本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種腫瘤組織3d培養(yǎng)方法；此外，本發(fā)明還涉及一種腫瘤組織3d培養(yǎng)液。
背景技術(shù)：
：世界癌癥報(bào)告估計(jì)，2012年中國癌癥發(fā)病人數(shù)為306.5萬，約占全球發(fā)病的五分之一；癌癥死亡人數(shù)為220.5萬，約占全球癌癥死亡人數(shù)的四分之一。由于人口老齡化等原因，當(dāng)前我國癌癥發(fā)病率、死亡率呈持續(xù)增長趨勢。目前在癌癥的治療當(dāng)中，藥物治療占據(jù)了60%，仍是腫瘤的主要治療方案。然而，在現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)化藥物治療中，70%的病人均為無效治療，并且在癌癥的治療過程中，還存在著嚴(yán)重的過度化療現(xiàn)象，這種過度或不合理的治療方案，至少促使了15%的癌癥患者加速死亡。因此，精準(zhǔn)化醫(yī)療逐漸成為了未來腫瘤醫(yī)學(xué)研究與應(yīng)用的趨勢。由于復(fù)雜的腫瘤異質(zhì)性及腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境的相互作用，腫瘤患者對(duì)于目前常規(guī)化療藥物的敏感性存在著極大差異，而目前輔助精確化診療實(shí)施的主要方法是基因測序和生物分子的標(biāo)記，缺乏針對(duì)于傳統(tǒng)化療藥物的有效篩查方法。雖然臨床上已開展了個(gè)體化藥物評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，但所采用的方法依然是傳統(tǒng)的2d細(xì)胞模型和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)。目前使用的動(dòng)物評(píng)價(jià)體系，大多都是人腫瘤組織在裸鼠皮下成瘤體系（pdx模型），該模型成本高，成瘤時(shí)間長，并不適用于臨床治療方案的篩選，另外由于人鼠之間較大的種屬差異，有時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能準(zhǔn)確反映藥物在人體內(nèi)的代謝情況和藥效作用。與體內(nèi)腫瘤相比，而常用的腫瘤細(xì)胞系模型與體內(nèi)腫瘤相比，缺乏腫瘤組織的基因突變現(xiàn)象，腫瘤細(xì)胞系的2d培養(yǎng)也不具備腫瘤生長時(shí)所處的微環(huán)境條件，缺少體內(nèi)某些特殊因子的刺激和蛋白調(diào)控作用，無法模擬體內(nèi)腫瘤生長的真實(shí)環(huán)境，而采用原代腫瘤細(xì)胞，一是原代細(xì)胞分離過程繁瑣耗時(shí)，而是由于缺乏相關(guān)的基質(zhì)成分、細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞，仍舊無法準(zhǔn)確反應(yīng)人體內(nèi)，腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性和耐受性。目前存在的一些多細(xì)胞共培養(yǎng)體系，仍舊缺乏復(fù)雜的脈管系統(tǒng)，而體內(nèi)這些脈管系統(tǒng)能夠通過簡單擴(kuò)散為組織提供氧、營養(yǎng)物質(zhì)并清除廢物，由于這一缺陷，使其在研究抗腫瘤藥物藥效學(xué)研究中仍具有一定不足。體外組織3d培養(yǎng)模型，直接選取病人癌及癌旁組織，放于特定載體上進(jìn)行短時(shí)間培養(yǎng)，最大程度上維持了腫瘤在體內(nèi)的生長環(huán)境，保存腫瘤異質(zhì)性，具備患者個(gè)體差異性，彌補(bǔ)了動(dòng)物模型耗時(shí)長、成本高，細(xì)胞模型準(zhǔn)確性低的缺陷，是一種較為理想的藥效評(píng)價(jià)模型。如今，組織培養(yǎng)條件的選擇大都借鑒于3d細(xì)胞培養(yǎng)或類器官培養(yǎng)的培養(yǎng)條件，尤其在培養(yǎng)載體方面，所采用的大多都是軟瓊脂、matrigel膠和水凝膠等常用的細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)載體。matrigel膠其主要成分有層粘連蛋白、ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，還包含生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等，室溫條件下，聚合形成有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜的功能、結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性。水凝膠是一種人工合成的多肽類生物納米材料，無需通過腫瘤分離，能有效避免因動(dòng)物異源蛋白和病原體污染造成的細(xì)胞生長抑制等其他不利影響，可用于多種類型細(xì)胞的培養(yǎng)，這兩種都是目前較為常用的細(xì)胞培養(yǎng)載體。使用時(shí)，用培養(yǎng)基或蔗糖溶液對(duì)matrigel膠或水凝膠進(jìn)行一定比例的稀釋，隨后將重懸好的細(xì)胞懸液與膠快速混合，鋪板接種。而與細(xì)胞培養(yǎng)操作不同，組織塊直接培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，組織塊容易與載體分離，從而失去載體支撐，貼壁生長。另外，細(xì)胞3d培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞種類單一，即便是多細(xì)胞共培養(yǎng)體系，其中包含的細(xì)胞類型也十分明確，而組織3d培養(yǎng)所采用的組織塊中不僅包含腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞類型和基質(zhì)成分，還有部分脈管系統(tǒng)，因此在培養(yǎng)液成分的篩選上，比細(xì)胞培養(yǎng)更加復(fù)雜。中國專利申請(qǐng)cn201510755769.9，發(fā)明名稱“卵巢癌癌組織3d培養(yǎng)方法及其在藥效評(píng)價(jià)中的應(yīng)用”，公開了一種卵巢癌癌組織3d培養(yǎng)方法，其采用傳統(tǒng)常用的matrigel膠，該載體存在組織固定性不好，組織樣本易漂浮，matrigel膠本身容易凝結(jié)，需嚴(yán)格控制操作溫度等缺點(diǎn)；其采用的兩種培養(yǎng)液，添加的因子成分單一，不適用于多種腫瘤組織的培養(yǎng)和藥效評(píng)價(jià)；其采用3個(gè)步驟，其中matrigel膠凝固有兩個(gè)步驟，流程步驟較繁瑣。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種腫瘤組織3d培養(yǎng)方法，解決了目前常規(guī)的抗腫瘤藥物的評(píng)價(jià)方法準(zhǔn)確性低，特異性差、成本高，周期長、存在種屬差異等問題，還能解決采用常用的matrigel膠，存在組織固定性不好，組織樣本易漂浮的問題，本發(fā)明采用的培養(yǎng)載體為水凝膠，該載體樣本固定性良好，還能簡化步驟，操作簡便，拓寬應(yīng)用范圍，能廣泛適用于多種腫瘤組織的培養(yǎng)和藥效評(píng)價(jià)。此外，本發(fā)明還提供一種腫瘤組織3d培養(yǎng)液。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：在本發(fā)明的一方面提供一種腫瘤組織3d培養(yǎng)方法，包括步驟為：（1）向孔板中滴加水凝膠，將剪切好的腫瘤組織塊移至所述水凝膠中，滴加培養(yǎng)液，co2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置使所述水凝膠凝固；（2）向步驟（1）的孔板中加入培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，再取出培養(yǎng)后的所述腫瘤組織塊并固定；所述培養(yǎng)液包括的組分有advanceddmem/f12培養(yǎng)液、1×glutamax、表皮細(xì)胞生長因子egf、成纖維細(xì)胞生長因子fgf10、n-乙酰-l-半胱氨酸nac、前列腺素e2pge2、nicotinamide和50×b27。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟（1）和步驟（2）中所述水凝膠是用20%無菌蔗糖溶液稀釋的，所述20%無菌蔗糖溶液與所述水凝膠的體積比為1:1-1:3。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟（1）和步驟（2）中所述的孔板中，事先滴加了5-10μl的磷酸鹽緩沖液，放入了與孔板大小一致的圓形蓋玻片，所述稀釋后的水凝膠滴加在該蓋玻片上。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟（1）中所述每次滴加的水凝膠的量為20-100μl；所述步驟（1）中滴加培養(yǎng)液的量為50-200μl；所述步驟（2）中加入培養(yǎng)液的量為300-450μl。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟（1）中所述腫瘤組織塊的大小為0.5-1mm3，所述腫瘤組織塊先用含1%雙抗和慶大霉素的緩沖液洗滌后再浸于生理鹽水中，所述腫瘤組織塊的制作過程在冰上進(jìn)行。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟（2）中，所述培養(yǎng)液按如下方法制得：將所述advanceddmem/f12培養(yǎng)液、所述1×glutamax、所述50×b27按體積比為40:5:5-50：1:1進(jìn)行混合，形成混合液，再在混合液中依次加入5-10μl的所述表皮細(xì)胞生長因子egf、1-5μl的所述成纖維細(xì)胞生長因子fgf、100-200μl的所述n-乙酰-l-半胱氨酸nac、3-8μl的所述前列腺素pge2混合得到所述培養(yǎng)液。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟（2）中分別將培養(yǎng)時(shí)間為7d、10d和14d的腫瘤組織塊從所述培養(yǎng)液里取出，固定于質(zhì)量百分比為4%的多聚甲醛固定液中。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟（2）中還包括對(duì)固定的所述腫瘤組織塊進(jìn)行石蠟包埋、切片、染色，觀察組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)的變化。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟（2）中還包括向所述培養(yǎng)液中加入化療藥物，繼續(xù)培養(yǎng)3d、6d，然后將所述腫瘤組織塊從所述培養(yǎng)液里取出，固定于質(zhì)量百分比為4%的多聚甲醛固定液中，再對(duì)固定的所述腫瘤組織塊進(jìn)行石蠟包埋、切片、染色，觀察腫瘤組織組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)的變化，統(tǒng)計(jì)增殖細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增值率，分析細(xì)胞增殖比率作為抗腫瘤藥物效價(jià)評(píng)價(jià)方法和指標(biāo)的可行性。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述染色為he染色或ki67免疫組化染色。作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述腫瘤組織包括腸癌腫瘤組織、胃癌腫瘤組織和食管癌腫瘤組織。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于腫瘤組織3d培養(yǎng)的培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液包括的組分有advanceddmem/f12培養(yǎng)液、1×glutamax、表皮細(xì)胞生長因子egf、成纖維細(xì)胞生長因子fgf10、n-乙酰-l-半胱氨酸nac、前列腺素e2pge2、nicotinamide和50×b27。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的用于腫瘤組織3d培養(yǎng)的培養(yǎng)液的制備方法，包括如下步驟：將所述advanceddmem/f12培養(yǎng)液、所述1×glutamax、所述50×b27按體積比為40:5:5-50：1:1進(jìn)行混合,形成混合液，再在混合液中依次加入5-10μl的所述表皮細(xì)胞生長因子egf、1-5μl的所述成纖維細(xì)胞生長因子fgf、100-200μl的所述n-乙酰-l-半胱氨酸nac、3-8μl的所述前列腺素pge2混合得到所述培養(yǎng)液。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所建立的人腫瘤組織的3d培養(yǎng)方法，以水凝膠為載體，與matrigel膠相比，其成本更低，且具有更好的組織固定性，操作更為簡便。改進(jìn)后的培養(yǎng)液適合腸癌、胃癌等多種腫瘤組織生長，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其大大增強(qiáng)了腫瘤組織培養(yǎng)的成活率，達(dá)到了預(yù)料不到的培養(yǎng)效果。采用多種檢測方法對(duì)組織生長情況和藥物藥效進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果更為可靠，能更快、更精準(zhǔn)地評(píng)價(jià)常規(guī)抗腫瘤藥物的藥效，彌補(bǔ)2d細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)技術(shù)準(zhǔn)確性差、成本高、耗時(shí)長等缺點(diǎn)，有望促進(jìn)我國創(chuàng)新型抗癌藥物的研發(fā)和精確化治療的進(jìn)程。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中：圖1是本發(fā)明實(shí)施例一中腸癌組織以matrigel膠培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織外觀示意圖，放大倍數(shù)為40x；其中，圖1a代表培養(yǎng)7d時(shí)，圖1b代表培養(yǎng)10d時(shí)，圖1c代表培養(yǎng)14d時(shí)；圖2是本發(fā)明實(shí)施例一中腸癌組織以水凝膠培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織外觀示意圖照片，放大倍數(shù)為40x；其中，圖2a代表培養(yǎng)7d時(shí)，圖2b代表培養(yǎng)10d時(shí)，圖2c代表培養(yǎng)14d時(shí)；圖3是本發(fā)明實(shí)施例一中腸癌組織以vitro-gel3d-rgd膠培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織外觀示意圖，放大倍數(shù)為40x；其中，圖3a代表培養(yǎng)7d時(shí)，圖3b代表培養(yǎng)10d時(shí)，圖3c代表培養(yǎng)14d時(shí)；圖4是本發(fā)明實(shí)施例一中腸癌組織分別以matrigel膠（a）、水凝膠（b）和vitro-gel3d-rgd膠（c）為載體培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀的變化示意圖，圖中所示是he染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×；其中，圖4a代表matrigel膠，圖4b代表水凝膠，圖4c代表vitro-gel3d-rgd膠；圖5是本發(fā)明中腸癌組織分別以matrigel膠（a）、水凝膠（b）和vitro-gel3d-rgd膠（c）為載體培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀的變化示意圖，圖中所示是ki67染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×；其中圖5a代表matrigel膠，圖5b代表水凝膠，圖5c代表vitro-gel3d-rgd膠；圖6是本發(fā)明實(shí)施例二中腸癌、胃癌和食管癌組織分別在培養(yǎng)液一和培養(yǎng)液二的條件下培養(yǎng)7d、14d時(shí)的組織外觀示意圖，放大倍數(shù)為40x；圖6a-圖6c代表腸癌組織在培養(yǎng)液一的條件下培養(yǎng)0d、7d、14d時(shí)；圖6d-圖6f代表腸癌組織在培養(yǎng)液二的條件下培養(yǎng)0d、7d、14d時(shí)；圖6g-圖6i代表胃癌組織在培養(yǎng)液一的條件下培養(yǎng)0d、7d、14d時(shí)；圖6j-圖6l代表胃癌組織在培養(yǎng)液二的條件下培養(yǎng)0d、7d、14d時(shí)；圖6m-圖6o代表食管癌組織在培養(yǎng)液一的條件下培養(yǎng)0d、7d、14d時(shí)，圖6p-圖6r代表食管癌組織在培養(yǎng)液二的條件下培養(yǎng)0d、7d、14d時(shí)；圖7是本發(fā)明實(shí)施例二中腸癌組織分別在培養(yǎng)液一和培養(yǎng)液二的條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀的變化示意圖，圖中所示是he染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×，圖7a代表了腸癌組織在培養(yǎng)液一條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)，圖7b代表了腸癌組織在培養(yǎng)液二條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)；圖8是本發(fā)明實(shí)施例二中胃癌組織分別在培養(yǎng)液一和培養(yǎng)液二的條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀的變化示意圖，圖中所示是he染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×，圖8a代表了胃癌組織在培養(yǎng)液一條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)，圖8b代表了胃癌組織在培養(yǎng)液二條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)；圖9是本發(fā)明實(shí)施例二中食管癌組織分別在培養(yǎng)液一和培養(yǎng)液二的條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀的變化示意圖，圖中所示是he染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×，圖9a代表了食管癌組織在培養(yǎng)液一條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)，圖9b代表了食管癌組織在培養(yǎng)液二條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)；圖10是本發(fā)明實(shí)施例二中腸癌組織分別在培養(yǎng)液一和培養(yǎng)液二的條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀的變化示意圖，圖中所示是ki67染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×；圖10a代表了腸癌組織在培養(yǎng)液一條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)，圖10b代表了腸癌組織在培養(yǎng)液二條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)；圖11是本發(fā)明實(shí)施例二中胃癌組織分別在培養(yǎng)液一和培養(yǎng)液二的條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀的變化示意圖，圖中所示是ki67染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×；圖11a代表了胃癌組織在培養(yǎng)液一條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)，圖11b代表了胃癌組織在培養(yǎng)液二條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)；圖12是本發(fā)明實(shí)施例二中食管癌組織分別在培養(yǎng)液一和培養(yǎng)液二的條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀的變化示意圖，圖中所示是ki67染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×，圖12a代表了食管癌組織在培養(yǎng)液一條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)，圖12b代表了食管癌組織在培養(yǎng)液二條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)；圖13是本發(fā)明實(shí)施例三中腸癌組織在培養(yǎng)條件下加入不同化療藥物后的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀的變化示意圖，圖中所示是he結(jié)果，放大倍數(shù)為400×，圖13a為control組，圖13b為草酸鉑組，圖13c為順鉑組，圖13d為草酸鉑+5-fu組；圖14是本發(fā)明實(shí)施例三中腸癌組織在培養(yǎng)條件下加入不同化療藥物后的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀的變化示意圖，圖中所示是ki67結(jié)果，放大倍數(shù)為400×；圖14a為control組，圖14b為草酸鉑組，圖14c為順鉑組，圖14d為草酸鉑+5-fu組；圖15是本發(fā)明實(shí)施例三中腸癌組織在培養(yǎng)條件下加入不同化療藥物后根據(jù)ki-67染色結(jié)果對(duì)每組增殖細(xì)胞的計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果示意圖。具體實(shí)施方式下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例一：提供一種腸癌癌組織3d培養(yǎng)方法，包括步驟為：（1）組織培養(yǎng)板的準(zhǔn)備取24孔板，滴加5-10μl的磷酸鹽緩沖液，將高溫滅菌后的圓形蓋玻片放于孔板中，輕拍使其與底部貼合，置于一旁備用；（2）腫瘤組織塊的制作取腸癌腫瘤組織，用含1%雙抗和慶大霉素的pbs清洗，采用眼科手術(shù)器械將其剪切成0.5-1mm3的組織塊，用生理鹽水清洗，整個(gè)操作在碎冰上進(jìn)行。（3）腫瘤組織塊培養(yǎng)以下是篩選膠的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)常用的三種膠matrigel膠、水凝膠、vitro-gel3d-rgd進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)：3.1matrigel膠在玻片上滴加30-100μl未經(jīng)稀釋的matrigel膠，將腸癌腫瘤組織塊小心移至matrigel膠中（整個(gè)操作4℃冰盒上進(jìn)行），室溫或co2培養(yǎng)箱中放置30-50min。取出孔板，每孔小心加入0.5-1ml培養(yǎng)液，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每天用倒置顯微鏡記錄組織生長情況。具體請(qǐng)參閱圖1。3.2水凝膠在玻片上滴加20-100μl水凝膠（與20%無菌蔗糖溶液1:1-1:5稀釋），將腸癌腫瘤組織塊小心移至水凝膠中，隨后加入50-200μl培養(yǎng)液，co2培養(yǎng)箱中放置10-30min。取出孔板，每孔補(bǔ)加300-450μl培養(yǎng)液，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每天用倒置顯微鏡記錄組織生長情況。具體請(qǐng)參閱圖2。3.3vitro-gel3d-rgd在玻片上滴加30-100μl稀釋后的vitro-gel3d-rgd（與dmem的稀釋比例為1:2-1:4），將腸癌腫瘤組織塊小心移至vitro-gel3d-rgd中，co2培養(yǎng)箱中放置30-50min。取出孔板，每孔小心加入0.5-1ml培養(yǎng)液，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每天用倒置顯微鏡記錄組織生長情況。具體請(qǐng)參閱圖3。從圖1、圖2和圖3中可以看出，與另外兩組相比，以水凝膠為載體培養(yǎng)14天的組織并未出現(xiàn)漂浮、移動(dòng)現(xiàn)象。在篩選膠的過程中，出乎意料地發(fā)現(xiàn)采用水凝膠為載體培養(yǎng)14天的組織并未出現(xiàn)漂浮、移動(dòng)現(xiàn)象，克服了采用matrigel膠存在組織固定性不好，組織樣本易漂浮，matrigel膠本身容易凝結(jié)，需嚴(yán)格控制操作溫度等缺點(diǎn)。上述所用培養(yǎng)液一成分如下表1所示，表1中是100ml培養(yǎng)液中所含的各種成分的量。表1培養(yǎng)液一成分含量高糖dmem培養(yǎng)液68mlf12培養(yǎng)液22ml10×n210mlegf10-30ng/mlfgf10-30ng/ml（4）腫瘤組織塊檢測分別于組織培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)，小心取出圓形玻片，將組織塊完整轉(zhuǎn)移到質(zhì)量百分比為4%的多聚甲醛固定液中固定至少72h。對(duì)固定的腫瘤組織塊進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋、切片、he染色和ki67染色，觀察組織形態(tài)和生長情況。鏡下觀察上述培養(yǎng)條件下腫瘤組織的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)的變化，具體請(qǐng)參閱圖4、圖5。圖4為腸癌組織以在上述培養(yǎng)條件下分別以matrigel膠（圖4a）、水凝膠(圖4b)和vitro-gel3d-rgd膠（圖4c）為載體培養(yǎng)7天、10天、14天時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀，圖中所示是he染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×。圖5為腸癌組織在上述培養(yǎng)條件下分別以matrigel膠（圖5a）、水凝膠(圖5b)和vitro-gel3d-rgd膠（圖5c）為載體培養(yǎng)7天、10天、14天時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀，圖中所示是ki67染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×。實(shí)施例二提供一種多種腫瘤組織3d培養(yǎng)方法，包括步驟為：（1）組織培養(yǎng)板的準(zhǔn)備取24孔板，滴加5-10μl的磷酸鹽緩沖液，將高溫滅菌后的圓形蓋玻片放于孔板中，輕拍使其與底部貼合，置于一旁備用；（2）腫瘤組織塊的制作取腸癌、胃癌和食管癌腫瘤組織，用含1%雙抗和慶大霉素的pbs清洗，，采用眼科手術(shù)器械將其剪切成0.5-1mm3的組織塊，用生理鹽水清洗，整個(gè)操作在碎冰上進(jìn)行。（3）腫瘤組織塊培養(yǎng)在玻片上滴加20-100μl水凝膠（與20%無菌蔗糖溶液1:1-1:5稀釋），分別將腸癌、胃癌和食管癌腫瘤組織塊小心移至水凝膠中，隨后加入50-200μl培養(yǎng)液一（其組分見實(shí)施例一中的表1，為中國專利申請(qǐng)cn201510755769.9采用的培養(yǎng)液）或培養(yǎng)液二（其組分見下表2，為本發(fā)明培養(yǎng)液），co2培養(yǎng)箱中放置10-30min。取出孔板，每孔補(bǔ)加300-450μl培養(yǎng)液一或培養(yǎng)液二，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每天用倒置顯微鏡記錄組織生長情況。具體請(qǐng)參閱圖6。所述培養(yǎng)液二成分如下表2所示，表2中所示是50ml培養(yǎng)液中各成分的量。表2培養(yǎng)液二成分含量advanceddmem/f12培養(yǎng)液48ml1×glutamax1mlb271mlnicotinamide500μlnac125μlpge23-10μlegf20-60ng/mlfgf1020-60ng/ml（4）腫瘤組織塊檢測分別于組織培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)，小心取出圓形玻片，將組織塊完整轉(zhuǎn)移到質(zhì)量百分比為4%的多聚甲醛固定液中固定至少72h。對(duì)固定的腫瘤組織塊進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋、切片、he染色和ki67染色，觀察組織形態(tài)和生長情況。鏡下觀察上述培養(yǎng)條件下腫瘤組織的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)的變化，具體請(qǐng)參閱圖7至圖12。圖7a為腸癌組織在培養(yǎng)液一的培條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀，圖7b為腸癌組織在培養(yǎng)液二的培條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀，圖中所示是he染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×。圖8a為胃癌組織在培養(yǎng)液一的條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀，圖8b為胃癌組織在培養(yǎng)液二的條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀，圖中所示是he染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×。圖9a為食管癌組織在培養(yǎng)液一的條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀，圖9b為食管癌組織在培養(yǎng)液二的條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀，圖中所示是he染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×。圖10a為腸癌組織在培養(yǎng)液一的培條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀，圖10b為腸癌組織在培養(yǎng)液二的培條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀，圖中所示是ki67染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×。圖11a為胃癌組織在培養(yǎng)液一的條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀，圖11b為胃癌組織在培養(yǎng)液二的條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀，圖中所示是ki67染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×。圖12a為食管癌組織在培養(yǎng)液一的條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀，圖12b為食管癌組織在培養(yǎng)液二的條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形狀，圖中所示是ki67染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×。從上述圖中可以看出，在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7d、10d、14d時(shí)，相同天數(shù)的腸癌組織生長情況無明顯差別，組織結(jié)構(gòu)無明顯變化，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和染色深淺差異不明顯；但采用培養(yǎng)液一培養(yǎng)的胃癌組織和食管癌組織（參見實(shí)施例一的圖4和圖5），14d時(shí)，明顯可以看出成活細(xì)胞數(shù)量少于培養(yǎng)液二中培養(yǎng)的組織樣本，即本發(fā)明采用的培養(yǎng)液大大增強(qiáng)了組織培養(yǎng)的成活率，達(dá)到了預(yù)料不到的培養(yǎng)效果。實(shí)施例三3d培養(yǎng)的腫瘤組織對(duì)抗腫瘤藥物藥效評(píng)價(jià)的可行性分析實(shí)施例二中腸癌組織培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)液中加入不同濃度、不同種類的化療藥物，于培養(yǎng)后不同時(shí)間，取出組織，固定于上述固定液中，經(jīng)he染色、ki67免疫組化染色或相應(yīng)的其它染色，鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，比較與未加抗腫瘤藥物的標(biāo)本的形態(tài)差異，評(píng)價(jià)藥物的藥效作用，統(tǒng)計(jì)增殖細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增值率，見表3，分析細(xì)胞增殖比率作為抗腫瘤藥物效價(jià)評(píng)價(jià)方法和指標(biāo)的可行性。具體參閱圖13、圖14和圖15。表3ki-67陽性細(xì)胞數(shù)視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)陽性細(xì)胞百分比（%）control44459974.1草酸鉑26441064.4順鉑22556939.5草酸鉑+5-fu13448027.9圖13為腸癌在實(shí)施例二的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)同時(shí)加入不同臨床常用化療藥物，繼續(xù)培養(yǎng)6天時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核形狀的變化，圖中所示是he染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×。圖13a為control組，圖13b草酸鉑組，圖13c為順鉑組，圖13d為草酸鉑+5-fu組；圖14為腸癌在實(shí)施例二的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)同時(shí)加入不同臨床常用化療藥物，繼續(xù)培養(yǎng)6天時(shí)的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核形狀的變化，圖中所示是ki67免疫組化染色結(jié)果，放大倍數(shù)為400×。圖14a為control組，圖14b草酸鉑組，圖14c為順鉑組，圖14d為草酸鉑+5-fu組。圖15是對(duì)每組增殖細(xì)胞的計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果。從圖13、圖14和圖15中可以看出，草酸鉑聯(lián)合5-fu對(duì)腸癌組織的殺傷情況最佳，隨后是順鉑組，單獨(dú)使用草酸鉑殺傷效果最差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所建立的腫瘤組織3d培養(yǎng)模型能作為評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物藥效評(píng)價(jià)的一個(gè)方法，且重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定，呈現(xiàn)了比動(dòng)物體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)短、比常規(guī)的體外實(shí)驗(yàn)更精確的優(yōu)勢特點(diǎn)。本發(fā)明中長期培養(yǎng)后的組織并未出現(xiàn)細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)的明顯變化，但特定給藥組腫瘤組織的細(xì)胞核發(fā)生明顯畸形，同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，體現(xiàn)了該方法用于抗腫瘤藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)的可行性。作為對(duì)照，本發(fā)明使用了傳統(tǒng)的體外細(xì)胞藥效評(píng)價(jià)試驗(yàn)評(píng)價(jià)了草酸鉑、順鉑、伊立替康和氟尿嘧啶聯(lián)合用藥的抗腫瘤藥效，發(fā)現(xiàn)給藥后72h，每組給藥方案對(duì)腸癌細(xì)胞系colo205的殺傷效果基本相同，而使用本方法，每組給藥方案對(duì)腫瘤組織抑制率分別為，草酸鉑+5-fu組：70-80%，順鉑組：60-65%，草酸鉑組:30-40%，間接反應(yīng)出了組織來源的病人對(duì)不同化療藥物敏感性差異。以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12