本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2011年7月18日的中國(guó)專利申請(qǐng)201180034991.x“活的減毒的細(xì)小病毒”的分案申請(qǐng)。

本發(fā)明涉及活的減毒的細(xì)小病毒，它們的用途，包含這種活的減毒的細(xì)小病毒的疫苗以及它們的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

細(xì)小病毒屬于單鏈dna病毒科。在各種動(dòng)物如貓、狗和豬中，細(xì)小病毒可引起疾病。因?yàn)椴《拘枰钴S分裂的細(xì)胞以便復(fù)制，感染的組織的類型隨動(dòng)物的年齡而變化。在任何年齡都可以影響胃腸道和淋巴系統(tǒng)，導(dǎo)致嘔吐、腹瀉和免疫抑制，但是在子宮內(nèi)或在小于兩周齡時(shí)被感染的貓中僅看到小腦發(fā)育不全，在3周和8周齡之間被感染的小狗中看到心肌疾病。

犬細(xì)小病毒(cpv)是在小狗中尤其致命的疾病，約80％致死，在非常年幼的小狗中引起胃腸道損傷和脫水以及心臟綜合癥。它是通過(guò)與被感染的狗的糞便接觸而傳播的。癥狀包括嗜睡、嚴(yán)重腹瀉、發(fā)燒、嘔吐、食欲不振和脫水。豬細(xì)小病毒在豬中引起被稱為smedi的生殖疾病，其代表為死胎、木乃伊化、胚胎死亡和不孕。貓泛白細(xì)胞減少癥，通常被稱為貓瘟熱，是一種影響貓的病毒感染，由犬細(xì)小病毒的近親貓細(xì)小病毒(fpv)引起。貓泛白細(xì)胞減少癥在小貓中常見(jiàn)，并引起發(fā)燒、低白細(xì)胞數(shù)、腹瀉和死亡。小于兩周的貓?zhí)汉托∝埖母腥疽鹦∧X發(fā)育不全。水貂腸炎病毒在對(duì)貓泛白細(xì)胞減少癥的作用中是相似的，除了它不會(huì)引起小腦發(fā)育不全。不同的細(xì)小病毒在水貂和其它鼬科動(dòng)物中引起阿留申病(aleutiandisease)，其特征在于淋巴結(jié)病、脾腫大、腎小球性腎炎、貧血和死亡。細(xì)小病毒的最準(zhǔn)確的診斷方法是通過(guò)elisa。通常對(duì)貓、狗和豬進(jìn)行針對(duì)細(xì)小病毒的免疫。

在dna水平上，已知犬、貓和豬細(xì)小病毒具有高度同源的基因組。犬細(xì)小病毒cpv2是一種在狗中引起急性、且有時(shí)是致命的腸炎的病毒(kelly,aust.vet.j.54；593,1978；appel等,vet.rec.105；156-159,1979)。1977年左右首先出現(xiàn)的該病毒可能通過(guò)單個(gè)衣殼蛋白中少數(shù)突變而從在貓中非常密切相關(guān)的病毒(即貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(fplv))產(chǎn)生的；物種跳躍可能涉及在其它食肉動(dòng)物(如水貂或浣熊)的中間傳遞(truyen等,virology215,186-189,1996)。

早在1979年，出現(xiàn)了cpv2的第一種變異體，被稱為cpv2a，隨后很快在1984年出現(xiàn)了cpv2b(parrish等,science230,1046-1048,1985,和j.virol.65；6544-6552,1991)。

最初的2型病毒現(xiàn)在已經(jīng)從野外(field)消失，被2a和2b型所替代，盡管這兩種類型的相對(duì)比例在國(guó)與國(guó)間有變化(前面的truyen等；chinchkar等,arch.virol.151,1881-1887,2006；pereira等,infect.genet.evol.3,399-409,2007)。在衣殼蛋白(vp2)中的氨基酸變化，其特征為從2至2a以及至2b的轉(zhuǎn)變，是非常有限的。在87(met至leu)、300(ala至gly)、305(asp至tyr)和555(val至ile)位的替換發(fā)生在2至2a的進(jìn)化中，在426(asn至asp)和555(ile至val)的替換發(fā)生在從2a出現(xiàn)2b中(前面的parrish等；truyen等,j.virol.69,4702-4710,1995)。最近，報(bào)道了在555位缺乏val至ile替換的2a株(wang等,virusgenes31,171-174,2005；martella等,virusgenes33,11-13,2006)。似乎單一的氨基酸改變可以區(qū)分cpv2a和cpv2bvp2序列。

新近，在意大利出現(xiàn)了病毒株，其中426位的氨基酸(2a中為asn，2b中為asp)已經(jīng)變?yōu)楣劝彼?glu)殘基(buonavoglia等,j.gen.virol.82,3021-3025,2001；martella等,j.clin.microbiol.42,1333-1336,2004)。這些被稱為cpv2c病毒的glu426變異體是在意大利和其他歐洲國(guó)家傳播的（circulating）并與其它c(diǎn)pv類型共存(decaro等,j.vet.med.b.infect.dis.vet.publichealth53,468-472,2006)，并且也已經(jīng)在地理上多樣的國(guó)家如越南和蘇格蘭分離得到(nakamura等,archvirol.149,2261-2269,2004,spibey等,vet.microbiol128,48-55,2008)，這些事實(shí)表明它們?cè)谥辽僖欢ū壤墓啡后w中具有優(yōu)勢(shì)。

犬細(xì)小病毒的相對(duì)快速進(jìn)化已經(jīng)導(dǎo)致貓宿主范圍的丟失以及然后重新獲得(前面的truyen等,1996)，這種重新獲得的在貓中復(fù)制的能力可以很好地解釋2a、2b和2c變異體對(duì)最初的2型病毒的替代。在二十世紀(jì)七十年代末期和二十世紀(jì)八十年代早期，由于刺激交叉保護(hù)的共享抗原，活的和滅活的fpl疫苗用于保護(hù)狗免于cpv疾病，然而它們提供的保護(hù)水平較差，免疫持續(xù)時(shí)間較短。這些疫苗被活的減毒cpv疫苗所替代，其提供了良好的保護(hù)和更長(zhǎng)的免疫持續(xù)時(shí)間。目前活的減毒疫苗來(lái)自cpv2b分離物或最初的2型病毒。由于2型病毒已經(jīng)在該野外中被2a、2b以及現(xiàn)在的2c病毒完全替代，已經(jīng)考慮到對(duì)于減毒的2型疫苗提供的保護(hù)水平(pratelli等,clin.diag.lab.immunol.8,612-615,2001；truyen,vet.microbiol.69,47-50,1999)。

然而，基于現(xiàn)有的單克隆抗體的研究，與以前的變異體相比，每種新的抗原變異體已經(jīng)失去至少一個(gè)中和表位(strassheim等,virology198,175-184,1994；前面的pereira等)。以前已經(jīng)表明，即使用針對(duì)各種抗原類型產(chǎn)生的血清在體外進(jìn)行的交叉中和研究的確顯示出顯著差異(前面的pratelli等)，活的減毒的cpv2疫苗能夠保護(hù)狗免于2a和2b野外攻擊(greenwood等,vet.record.136,63-67,1995)。

最近顯示，活的減毒的2型疫苗(nobivac-intervet)能夠保護(hù)狗免于用最近的cpv變異體cpv2c的攻擊(spibey等,vet.microbiol128,48-55,2008)。

盡管如此，在疫苗領(lǐng)域中存在著誘導(dǎo)動(dòng)物、尤其是貓、狗和豬中足夠水平的免疫以免于感染和具有高度減毒行為的細(xì)小病毒的疫苗相組合的需求。高水平的減毒與安全性是同義的，尤其在年幼和年老的動(dòng)物中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供減毒的同時(shí)仍然免疫原性的新的活細(xì)小病毒。這種病毒提供了用于安全的疫苗的基礎(chǔ)。

在這個(gè)方面，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及活的減毒的細(xì)小病毒（pv），其包括在衣殼蛋白的219位氨基酸處除了異亮氨酸以外的氨基酸和/或在衣殼蛋白的386位氨基酸處除了谷氨酰胺以外的氨基酸（條件是，pv不是犬細(xì)小病毒疫苗nobivacparvoc中存在的cpv。在這種cpv（犬細(xì)小病毒疫苗nobivacparvoc的cpv）中包含的序列如seqidno:1中所示。

令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在衣殼基因的219和386位氨基酸這兩個(gè)位點(diǎn)，在病毒的減毒中起著重要作用。直到現(xiàn)在，假設(shè)衣殼區(qū)域之外的氨基酸主要參與病毒的毒力/減毒。

在犬和貓細(xì)小病毒中，無(wú)論血清型，衣殼蛋白的219位氨基酸處的異亮氨酸和衣殼蛋白的386位氨基酸處的谷氨酰胺的位置是相同的。這意味著，本發(fā)明可以至少普遍地適用于貓細(xì)小病毒和犬細(xì)小病毒。本發(fā)明也可以應(yīng)用于例如豬細(xì)小病毒，所述豬細(xì)小病毒具有衣殼蛋白的219位氨基酸處的異亮氨酸和衣殼蛋白的386位氨基酸處的谷氨酰胺。

具體而言，從本發(fā)明排除要求保護(hù)的是，犬細(xì)小病毒疫苗nobivacparvoc(intervetschering-ploughanimalhealth)中存在的cpv，其包含如seqidno:1所示的序列。

因此，本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案涉及活的減毒的細(xì)小病毒（pv），其包括編碼在衣殼蛋白的219位氨基酸處除了異亮氨酸以外的氨基酸和/或在衣殼蛋白的386位氨基酸處除了谷氨酰胺以外的氨基酸的衣殼基因，條件是，pv不包含seqidno:1所示的序列。

僅僅是為了表示219位氨基酸處的異亮氨酸和386位氨基酸處的谷氨酰胺的位置，下面顯示了在大多數(shù)cpv和fpv毒株中發(fā)現(xiàn)的序列背景的例子中這兩個(gè)氨基酸（以粗體字符表示）。

根據(jù)被用作根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)或兩個(gè)氨基酸的取代的起始材料的毒株，可能在219位或386位的單一氨基酸取代不足以，例如使病毒在非常年幼的動(dòng)物中是安全的。如果需要進(jìn)一步的減毒，優(yōu)選在219和386位的兩個(gè)氨基酸的取代。

因此，本實(shí)施方案的優(yōu)選形式涉及本發(fā)明的活的減毒的細(xì)小病毒（pv），其包括編碼在衣殼蛋白的219位氨基酸處除了異亮氨酸以外的氨基酸和在衣殼蛋白的386位氨基酸處除了谷氨酰胺以外的氨基酸的衣殼基因。

本實(shí)施方案的更優(yōu)選形式涉及活的減毒的細(xì)小病毒（pv），其包括編碼在衣殼蛋白的219位氨基酸處的纈氨酸和/或在衣殼蛋白的386位氨基酸處的賴氨酸的衣殼基因。

本實(shí)施方案的甚至更優(yōu)選形式涉及活的減毒的細(xì)小病毒（pv），其包括編碼在衣殼蛋白的219位氨基酸處的纈氨酸和在衣殼蛋白的386位氨基酸處的賴氨酸的衣殼基因。

如果優(yōu)選仍進(jìn)一步減毒，使用已經(jīng)具有另一個(gè)減毒突變的細(xì)小病毒作為用于引入本發(fā)明的氨基酸取代的起始材料可能是有吸引力的。

優(yōu)選地，這種減毒突變位于衣殼區(qū)域之外。這允許用在細(xì)小病毒毒株的同源非衣殼區(qū)域(所述細(xì)小病毒毒株在該區(qū)域攜帶減毒)替代本發(fā)明的病毒的非衣殼區(qū)域的一部分的dna片段。在非衣殼區(qū)域的一部分中攜帶減毒的細(xì)小病毒是，商業(yè)上可獲得的犬細(xì)小病毒疫苗nobivacparvoc(intervetschering-ploughanimalhealth)。

這樣一種方法的優(yōu)勢(shì)是，這種病毒可以具有更高的減毒水平。因此，本實(shí)施方案的仍然甚至更優(yōu)選的形式涉及本發(fā)明的活的減毒的細(xì)小病毒，其中所述細(xì)小病毒是重組細(xì)小病毒，其中所述細(xì)小病毒的非衣殼區(qū)域的一部分的dna片段被源自第二細(xì)小病毒的非衣殼區(qū)域的一部分的同源dna片段所替代，其中所述第二細(xì)小病毒的同源dna片段攜帶減毒的突變。

來(lái)自第二細(xì)小病毒的同源dna片段是具有與本發(fā)明的細(xì)小病毒的dna片段相同功能的dna片段，但是不同于該dna片段，因?yàn)槠鋽y帶導(dǎo)致病毒的減毒行為的突變。僅僅作為一個(gè)例子，如果dna片段在兩個(gè)特定的限制性位點(diǎn)之間的dna片段中包括減毒突變并且這兩個(gè)限制性位點(diǎn)也存在于不具有該突變的病毒中的相同位置，那么攜帶該突變的限制性片段被認(rèn)為與來(lái)自不具有該突變的病毒的相同片段是同源的。

本實(shí)施方案的高度優(yōu)選形式涉及本發(fā)明的活的減毒的細(xì)小病毒，其中所述第二細(xì)小病毒的同源的dna片段在非結(jié)構(gòu)區(qū)中從2061位至2070位的區(qū)域中攜帶減毒突變。

可以理解的是，本發(fā)明的活的減毒的細(xì)小病毒，無(wú)論是否額外存在任何進(jìn)一步的減毒，如，例如，減毒的非衣殼區(qū)域，可以從所有細(xì)小病毒(在所述細(xì)小病毒中，可以在衣殼蛋白中進(jìn)行本發(fā)明的異亮氨酸/x1和/或谷氨酰胺/x2轉(zhuǎn)換)獲得，因此至少可以從cpv和fpv的所有目前測(cè)序的成員獲得。（x1和x2分別是除了異亮氨酸和谷氨酰胺以外的氨基酸）。

也可以理解的是，本發(fā)明包括包含fpv-衣殼和cpv-非衣殼骨架的雜合病毒以及包含cpv-衣殼和fpv-非衣殼骨架的雜合病毒。

當(dāng)開(kāi)發(fā)疫苗用于保護(hù)動(dòng)物，更具體地保護(hù)寵物免于細(xì)小病毒感染時(shí)，用于這種疫苗中的優(yōu)選的細(xì)小病毒是犬細(xì)小病毒或貓細(xì)小病毒。

因此，本實(shí)施方案的甚至更優(yōu)選的形式涉及本發(fā)明的活的減毒的細(xì)小病毒，其中所述細(xì)小病毒是犬細(xì)小病毒或貓細(xì)小病毒。

特別地，當(dāng)疫苗分別特別針對(duì)保護(hù)狗和貓免于cpv和fpv時(shí)，本發(fā)明的病毒的衣殼基因優(yōu)選編碼cpv血清型2a，2b或2c的衣殼蛋白或貓細(xì)小病毒的衣殼蛋白。

如上所述，細(xì)小病毒的非衣殼部分可以是cpv或fpv來(lái)源的。

因此，本實(shí)施方案的甚至進(jìn)一步優(yōu)選的形式涉及，本發(fā)明的活的減毒的cpv，其中所述細(xì)小病毒編碼cpv血清型2a，2b或2c的衣殼蛋白或貓細(xì)小病毒的衣殼蛋白。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于保護(hù)動(dòng)物免于細(xì)小病毒感染的疫苗，其中這種疫苗包括本發(fā)明的活的減毒的細(xì)小病毒和藥學(xué)上可接受的載體。

在許多情況下，取決于減毒的水平和病毒的復(fù)制特征，用于疫苗中的本發(fā)明的合適量的細(xì)小病毒在10³–10⁹tcid50的范圍內(nèi)。在許多情況下，低于10³tcid50的感染劑量的病毒被認(rèn)為太低，因?yàn)閷?duì)于病毒復(fù)制到足以觸發(fā)免疫系統(tǒng)的高水平需要太多時(shí)間。如果僅僅出于商業(yè)的原因，超過(guò)10⁹tcid50的量是沒(méi)有吸引力的。

非常合適的劑量是10⁵–10⁸tcid50的范圍內(nèi)，甚至更好地10⁶–10⁸tcid50的范圍內(nèi)。

藥學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域中公知的。僅僅作為例子，這種載體可以和無(wú)菌水或緩沖溶液如pbs一樣簡(jiǎn)單。

可以以若干方式施用本發(fā)明的疫苗。由于疫苗包括活的減毒的病毒，許多施用方式，如口服的，鼻內(nèi)的，i.m.和皮下施用是可行的。優(yōu)選的施用途徑是皮下施用。

易受細(xì)小病毒感染的動(dòng)物，如貓和狗經(jīng)常同時(shí)接種疫苗以免受若干其它疾病。因此，組合本發(fā)明的疫苗和對(duì)狗和貓致病的病毒或微生物的額外的抗原或編碼所述抗原的遺傳信息是可行的。

因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及包含本發(fā)明的疫苗和對(duì)動(dòng)物致病的病毒或微生物的額外的抗原或編碼所述病毒或微生物的免疫原性多肽的遺傳信息組合疫苗。

病毒或微生物的額外抗原可以是整個(gè)病毒或微生物（以活的減毒的形式或滅活的形式）或該病毒或微生物的能夠誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的免疫原性的多肽或另一種免疫原性部分，如，例如，（脂質(zhì)-）多糖。

優(yōu)選地，對(duì)動(dòng)物致病的病毒或微生物選自犬埃立克體(ehrlichiacanis)，吉氏巴貝斯蟲(chóng)(babesiagibsoni)，vogeli,rossi，杜氏利什曼原蟲(chóng)-復(fù)合體(leishmaniadonovani-complex)，犬腺病毒，犬冠狀病毒，犬distempervirus，犬鉤端螺旋體血清型腎臟鉤端螺旋體(leptospirainterrogansserovarcanicola)，黃疸出血鉤端螺旋體(icterohaemorrhagiae)，pomona，流感傷寒型鉤端螺旋體(grippotyphosa)，bratislava，犬肝炎病毒，犬副流感病毒，狂犬病毒，犬肝簇蟲(chóng)(hepatozooncanis)，伯氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)，波氏支氣管敗血(bordetellabronchiseptica)，貓皰疹病毒，貓杯狀病毒，貓白細(xì)胞減少癥(felinepanleucopenia)和貓衣原體(chlamydophilafelis)。

包含活的減毒的病毒的疫苗必須在低溫下貯存，或者它們必須是冷凍干燥的形式。冷凍干燥的疫苗可以保持在適度的冷卻條件下，或者甚至在室溫下。經(jīng)常，將疫苗與穩(wěn)定劑混合，例如以保護(hù)易于降解的蛋白免于被降解，以增強(qiáng)的疫苗的壽命，或以提高冷凍干燥效率。有用的穩(wěn)定劑是，尤其spga，碳水化合物，例如山梨醇，甘露醇，海藻糖，淀粉，蔗糖，葡聚糖，葡萄糖，蛋白如白蛋白或酪蛋白或其降解產(chǎn)物，和緩沖液如堿金屬磷酸鹽。

因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的（組合）疫苗是冷凍干燥的形式。

此外，疫苗可以懸浮在生理上可接受的稀釋劑中。這種緩沖液可以例如是無(wú)菌水，緩沖液等。

不用說(shuō)，用于乳化或穩(wěn)定病毒的稀釋劑和化合物也體現(xiàn)在本發(fā)明中。

再次，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于制備本發(fā)明的（組合）疫苗的方法，其中這些方法包括混合本發(fā)明的活的減毒的細(xì)小病毒和藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明的仍另一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明的活的減毒的細(xì)小病毒，其用作藥物。

更具體地，本實(shí)施方案涉及本發(fā)明的活的減毒的細(xì)小病毒，其用于治療細(xì)小病毒感染。

再次，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明的活的減毒的細(xì)小病毒的用途，其用于治療細(xì)小病毒感染。

最后，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及用于制備本發(fā)明的細(xì)小病毒突變體的方法，其中這種方法包括用編碼至少部分細(xì)小病毒衣殼蛋白的dna片段(其在219位氨基酸處具有編碼除了異亮氨酸以外的氨基酸的密碼子和/或在386位氨基酸處具有編碼除了谷氨酰胺以外的氨基酸的密碼子)替代編碼至少部分細(xì)小病毒衣殼蛋白的dna片段(其在219位氨基酸處具有編碼異亮氨酸的密碼子和/或在386位氨基酸處具有編碼谷氨酰胺的密碼子)。

可以使用本領(lǐng)域公知的重組dna技術(shù)，如位點(diǎn)定向誘變，限制性片段的交換等進(jìn)行這種dna的替代。有若干制備219異亮氨酸和x1或386谷氨酰胺和x2取代的方法?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)合成或pcr以及隨后的新合成的片段和病毒dna的重組而引入這種變化。

附圖說(shuō)明

圖1：pcpva的構(gòu)建

圖2：pcpvc的構(gòu)建

圖3：pcpvac的構(gòu)建

圖4：pcpv154att的構(gòu)建

圖5：p630的構(gòu)建

圖6：p630att的構(gòu)建

圖7：獲得雜合的2/2c病毒分離物的天然重組（非gm）方法的示意圖。將源自2型疫苗和2c型場(chǎng)地病毒的兩個(gè)重疊片段轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，以及在同源重組后分離的病毒。

圖8：顯示限制性酶位點(diǎn)paci和xmni的cpv毒株154att的感染性質(zhì)粒克隆的示意圖。陰影方框表示末端回文序列。

圖9：顯示選擇用于進(jìn)一步操作的部分paci/xmni消化的選擇的產(chǎn)物的示意圖。

圖10：包含其中衣殼基因被強(qiáng)毒的cpv2c衣殼序列替代的154att疫苗病毒dna的質(zhì)粒。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1:犬細(xì)小病毒克隆630att的產(chǎn)生

起始材料

病毒

大腸桿菌菌株

選擇從大腸桿菌遺傳儲(chǔ)存中心（美國(guó)）獲得的大腸桿菌菌株jc811和菌株dl795(kramelbiotechuk)用于完整的感染性克隆的質(zhì)粒繁殖。

dna合成

由eurofinsmwggmbh進(jìn)行定制的dna合成。合成的dna片段在pbluescrpt克隆質(zhì)粒中提供。

犬細(xì)小病毒克隆630att的構(gòu)建是多步驟過(guò)程，在這里以其分開(kāi)的步驟進(jìn)行描述。

1)nobivacparvoc的感染性分子克隆(p154att)的構(gòu)建（p154att）

用“hirt”制備法的修改方法從被nobivacparvoc感染的細(xì)胞感染的a72細(xì)胞獲得復(fù)制形式（rf）病毒dna(parrish等1988,virology166,293-307)。用多種限制性酶消化病毒dna，并使用常規(guī)的克隆方法將基因組裝配進(jìn)pbluescript。圖1-4中概述了克隆方案。

首先用t4dna聚合酶“末端填充(endfilled)”cpv154att的rfdna。然后用ecorⅰ和speⅰ消化dna。這些酶分別在1099和3459位切割一次。這種消化產(chǎn)生三個(gè)片段，以它們的大小順序標(biāo)記為a、b&c。通過(guò)凝膠電泳分開(kāi)片段，然后將ecorⅰ/speⅰ片段（片段a）克隆進(jìn)已經(jīng)通過(guò)相同的酶消化而制備的質(zhì)粒pbluescript中（見(jiàn)圖1）。

然后將來(lái)自rfdna消化的ecori末端片段（片段c）克隆進(jìn)用ecori和ecorv消化的pbluescript，以產(chǎn)生pcpvc（見(jiàn)圖2）。

將犬細(xì)小病毒a和c片段一起亞克隆進(jìn)相同的質(zhì)粒。用spei和ecori消化質(zhì)粒pcpva和pcpvc。從pcpva純化cpv插入物，從pcpvc獲取載體部分。然后連接產(chǎn)生其中片段a和c“重新聯(lián)合”的質(zhì)粒（見(jiàn)圖3）。

然后將來(lái)自cpvrfdna消化的spei末端片段（片段b）克隆進(jìn)pcpvac。用spei和切割導(dǎo)致平末端的酶hincii消化質(zhì)粒pcpvac。連接并克隆片段。（見(jiàn)圖4）。

產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱為p154att。

通過(guò)將質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染進(jìn)a72細(xì)胞導(dǎo)致產(chǎn)生感染性病毒而實(shí)現(xiàn)驗(yàn)證已經(jīng)組裝完整的克隆。

進(jìn)行質(zhì)?？寺〉膁na序列分析；如下面進(jìn)一步顯示，顯示該序列與從感染的細(xì)胞提取的病毒dna測(cè)定的序列是相同的。

2).2/2c雜合d9的構(gòu)建

從nobivacparvoc感染的細(xì)胞和cpv2c“jes”感染的細(xì)胞或者單獨(dú)從cpv2c“jes”感染的細(xì)胞獲得病毒dna。各自用單一限制性酶消化病毒dna制備物，以便從每種制備物產(chǎn)生2個(gè)dna片段。酶消化進(jìn)行的方式使得nobivac基因組的左手片段和“jes”基因組的右手片段共享>200bp的重疊序列。分開(kāi)、純化并混合nobivac左末端和“jes”右末端片段（圖7）。

用這些重疊的片段轉(zhuǎn)染a72和crfk細(xì)胞允許通過(guò)自然重組產(chǎn)生感染性病毒。通過(guò)有限稀釋克隆產(chǎn)生的病毒，并命名為2/2c雜合d9。

3).克隆630的構(gòu)建。

從感染性質(zhì)?？寺154att和從2/2c雜合d9制備的dna開(kāi)發(fā)克隆630。

限制性酶paci在561和4651位左右的兩個(gè)位置(基因組的遠(yuǎn)左末端和右末端)切割cpv基因組。因此，用paci消化質(zhì)粒p154att，從載體和末端序列分開(kāi)包含超過(guò)80％的基因組的~4kbppaci片段，并用從2/2c雜合d9dna獲得的片段替代。產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱為p630。這如圖5中所示。

據(jù)預(yù)測(cè)，用p630轉(zhuǎn)染a72或crfk細(xì)胞導(dǎo)致感染性病毒的產(chǎn)生，該病毒被稱為630。

病毒630如2/2c雜合d9保留了低水平的致病性。

4).克隆630att的構(gòu)建。

當(dāng)注射進(jìn)狗時(shí)，630病毒顯示出一些低水平的臨床跡象。

化學(xué)合成衣殼基因的一部分，引入在nobivacparvoc中觀察到但是在場(chǎng)地毒株中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的氨基酸變化。然后用該片段替代質(zhì)粒p630中的相同區(qū)域以產(chǎn)生質(zhì)粒p630att；這如圖6中所示。

合成對(duì)應(yīng)于cpv基因組上的3356和4029位之間的dna序列。確切的dna序列，這里提供為seqidno：2，如下所示

限制性酶位點(diǎn)bglⅱ和xcmi以粗體和下劃線顯示。

從質(zhì)粒釋放該序列，這通過(guò)用bglⅱ和xcmi消化而提供。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離dna片段，分離并純化672bp片段。

用p630att轉(zhuǎn)染a72或crfk細(xì)胞導(dǎo)致感染性病毒(630att)的產(chǎn)生，當(dāng)該病毒施用于小狗時(shí)沒(méi)有任何臨床癥狀。

在比較研究中，比較包含克隆630的疫苗和包含克隆630att的疫苗。

以1ml中10^8.0-10^8.3tcid50的克隆630對(duì)五只mda陰性狗皮下接種疫苗。

這導(dǎo)致所有的狗中輕度至中度的跡象。在5只狗中超過(guò)5天期間的重量變化平均為-6％，從下表如下所示。

以1ml中10^8.0-10^8.3tcid50的克隆630att對(duì)五只mda陰性狗皮下接種疫苗。

在這組中，可見(jiàn)無(wú)臨床癥狀，無(wú)溫度升高，無(wú)白血球減少癥，無(wú)腹瀉或嘔吐。此外，該組中出現(xiàn)顯著的體重增加，從下表如下所示。

因此得出結(jié)論，基于克隆630att的疫苗與克隆630相比的確表現(xiàn)出減毒，并具有優(yōu)異的安全性特征。

實(shí)施例2:產(chǎn)生具有在衣殼基因之外的減毒突變的重組病毒

從商售的nobivacparvoc(intervetschering-ploughanimalhealth)獲得154att株，jess株是2c型病毒的野外分離物。

使用包含5％胎牛血清的m6b8培養(yǎng)基使病毒生長(zhǎng)在貼壁的犬或貓腎細(xì)胞(如a72&crfk)上。用標(biāo)準(zhǔn)“hirt”法的修改方法從被感染的細(xì)胞培養(yǎng)物制備復(fù)制形式(rf)dna(mcmaster等1981)。

用限制性酶psti消化從154att株制備的rfdna，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分開(kāi)片段。從凝膠切出3055堿基對(duì)(bp)條帶(對(duì)應(yīng)于cpv的左手末端)并用qiagenqiaquick凝膠提取柱純化。用限制性酶xmni消化從cpvjess感染的細(xì)胞分離的rfdna。再次通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離dna片段，隨后用qiagenqiaquick凝膠提取柱純化約2750bp條帶(對(duì)應(yīng)于包括衣殼序列的cpv的右手末端)。

將來(lái)自154att和jess的純化的3055bp和2750bp片段合并并轉(zhuǎn)染進(jìn)培養(yǎng)中的a72或crfk細(xì)胞。根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)，用lipofectamine2000(invitrogen)將約3μg的每種片段進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

轉(zhuǎn)染后，傳代細(xì)胞并用血凝(ha)分析法監(jiān)測(cè)。在第4代時(shí)用ha檢測(cè)病毒。使用標(biāo)準(zhǔn)dna測(cè)序方案，用rfdna或pcr片段模板進(jìn)行雜合病毒的dna序列測(cè)定。通過(guò)有限稀釋法純化在貼壁的易感犬或貓細(xì)胞上的病毒。

實(shí)施例3：從克隆的病毒dna構(gòu)建的重組病毒

從克隆的片段產(chǎn)生重組病毒。將病毒株154att的基因組克隆進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的克隆載體pbluescript(stratageneinc.)。為了保持回文末端序列完整，將質(zhì)粒在許多重組系統(tǒng)缺陷的細(xì)菌宿主dl795中繁殖。細(xì)小病毒基因組的克隆已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述，所需的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。

用限制性酶paci消化獲得的154att的克隆(p154att)而不允許消化完整進(jìn)行，即限制性酶消化僅僅是部分的。然后使消化的片段經(jīng)受限制性酶xmni的消化。然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分開(kāi)消化的dna片段，從凝膠切出下圖中所示的片段，并用qiagenqiaquick凝膠提取柱純化。xmni和右手的pac位點(diǎn)位于細(xì)小病毒基因組中的衣殼區(qū)域的兩側(cè)。

如下用cpv的強(qiáng)毒株的衣殼基因替代154att的衣殼基因。圖8中所示的xmni位點(diǎn)和右手的paci位于衣殼基因的邊界之外。paci位點(diǎn)和衣殼基因的末端之間約110bp序列在154att株和強(qiáng)毒的分離物之間差異顯著。在xmni位點(diǎn)和衣殼基因的起始處之間的短序列(～55bp)中還沒(méi)有記錄到序列改變。因此，為了將物質(zhì)的交換僅僅限制在衣殼序列；化學(xué)合成了強(qiáng)毒的cpv衣殼序列，保留了paci位點(diǎn)和衣殼終止信號(hào)之間的疫苗特異性序列。

下面，顯示了包含cpv衣殼基因的化學(xué)合成的序列。下面所示的序列在本文作為seqidno：3提供。

標(biāo)注并用下劃線表示了xmni和paci位點(diǎn)。衣殼編碼區(qū)的終止密碼子(taa)用下劃線表示。衣殼(vp1/vp2)編碼序列用粗體表示。

用酶xmni和paci將合成的片段從提供其的質(zhì)粒中切出釋放，然后將其連接至圖9所示的片段。用標(biāo)準(zhǔn)方法以連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)e.coli(菌株dl795)，分離并鑒定包含重組質(zhì)粒的細(xì)菌。然后從克隆的e.coli制備下面所示的獲得的質(zhì)粒p1542c(圖10)。

如下制備雜合病毒。將質(zhì)粒p1542cdna轉(zhuǎn)染進(jìn)培養(yǎng)中的a72或crfk細(xì)胞。根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)，用lipofectamine2000(invitrogen)將約3微克dna進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，傳代細(xì)胞并用血凝(ha)分析法監(jiān)測(cè)。在第4代時(shí)用ha檢測(cè)病毒。使用標(biāo)準(zhǔn)dna測(cè)序方法，用rfdna或pcr片段模板進(jìn)行雜合病毒的dna序列測(cè)定。通過(guò)有限稀釋法純化在貼壁的易感犬或貓細(xì)胞上的病毒。