本發(fā)明涉及口蹄疫病毒重組病毒樣粒子及其制備方法和應(yīng)用，屬于基因工程疫苗領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

口蹄疫(foot-and-mouthdisease,fmd)是由微rna病毒科口蹄疫病毒屬的口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,fmdv)所引起偶蹄動(dòng)物以蹄、口、鼻等部位發(fā)生水皰為主要特征的一種急性、烈性傳染病。該病對(duì)牛、豬、羊等主要畜種危害尤為嚴(yán)重，不僅能夠引起感染動(dòng)物的死亡，大大降低感染畜群的生產(chǎn)性能；還會(huì)對(duì)發(fā)生疫情的國(guó)家的國(guó)際動(dòng)物及其制品貿(mào)易產(chǎn)生一定的負(fù)面影響，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie)將fmd列為法定上報(bào)的動(dòng)物疫病首位，我國(guó)也將其列于一類動(dòng)物傳染病。我國(guó)是fmd疫區(qū)，該病已成為危害我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的動(dòng)物疫病之一。

fmdv在含有七種血清型，分別為a、o、c、asia1、sat1、sat2和sat3。各個(gè)血清型fmdv生物學(xué)特性及發(fā)病特征相似，但各型間無(wú)交叉免疫反應(yīng)。fmdv屬于單股負(fù)鏈rna病毒，基因組全長(zhǎng)約8.5kb，含有一個(gè)orf編碼框，編碼一個(gè)多聚蛋白。p1區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白在病毒自身蛋白酶3c的作用下裂解為vp0、vp3和vp1，該三種蛋白單體相互結(jié)合形成5s單體，并自動(dòng)組裝14s五聚體，12個(gè)五聚體進(jìn)一步組裝形成病毒衣殼?；蚪Mrna與病毒衣殼作用促使vp0自催化裂解為vp4和vp2蛋白，形成完整成熟的病毒粒子。

疫苗免疫是fmd的重要手段，其中，傳統(tǒng)疫苗滅活疫苗在現(xiàn)階段fmd防疫中發(fā)揮重要的作用。隨著疫苗學(xué)和病毒結(jié)構(gòu)生物學(xué)等領(lǐng)域的不斷發(fā)展，新型疫苗開(kāi)發(fā)研究是國(guó)內(nèi)外一致關(guān)注的熱點(diǎn)領(lǐng)域。病毒樣顆粒(viruslikeparticles,vlps)疫苗是由一種或多種病毒結(jié)構(gòu)蛋白組裝成的空衣殼結(jié)構(gòu)，形態(tài)上與真正的病毒粒子相似。vlps不含有病毒基因組，在宿主體內(nèi)無(wú)法進(jìn)行復(fù)制，不具有感染性。vlps類似天然病毒粒子結(jié)構(gòu)的特性，使其保留了大部分病毒的特異性抗原表位，也能夠模擬病毒對(duì)宿主感染過(guò)程，有效的刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的免疫應(yīng)答，是潛在安全的候選疫苗。目前，多種商品化vlps疫苗應(yīng)用于市場(chǎng)，如pcv-2，ev-71等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種口蹄疫病毒樣粒子的構(gòu)建方法及其在制備疫苗中的應(yīng)用。

基于上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種用于制備重組口蹄疫病毒樣粒子的dna分子組合物，包括o型口蹄疫vp0基因、o型口蹄疫vp1基因和o型口蹄疫vp3基因；其中，o型口蹄疫vp0基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；o型口蹄疫vp1基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；o型口蹄疫vp3基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

進(jìn)一步的，所述的用于制備重組口蹄疫病毒樣粒子的dna分子組合物，由所述o型口蹄疫vp0基因、所述o型口蹄疫vp1基因和所述o型口蹄疫vp3基因和綠色熒光蛋白egfp基因組成，其中，綠色熒光蛋白egfp基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

上述含有所述dna分子組合物的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組載體按照下述步驟構(gòu)建：

1)將o型口蹄疫vp0基因插入到pfbdm載體的ecori和xbai酶識(shí)別位點(diǎn)之間，得到插入了o型口蹄疫vp0基因的重組載體，命名為pfbdm-vp0；將o型口蹄疫vp1基因插入到pfbdm-vp0的smai和kpni酶識(shí)別位點(diǎn)之間，得到插入了o型口蹄疫vp0基因和o型口蹄疫vp1基因的重組載體，命名為pfbdm-vp0/vp1；

2)將綠色熒光蛋白egfp基因插入到pfbdm載體的ecori和xbai酶識(shí)別位點(diǎn)之間，得到插入了綠色熒光蛋白egfp基因的重組載體，命名為pfbdm-egfp；將o型口蹄疫vp3基因插入到pfbdm-egfp的smai和kpni酶識(shí)別位點(diǎn)之間，得到插入了綠色熒光蛋白egfp基因和o型口蹄疫vp3基因的重組載體，命名為pfbdm-egfp/vp1；

3)將pfbdm-vp0/vp1質(zhì)粒經(jīng)spei/nrui酶切得到的大片段，與經(jīng)過(guò)avrii/pmei酶切的pfbdm-egfp/vp3質(zhì)粒產(chǎn)生的小片段連接，得到插入o型口蹄疫vp0、vp1基因、vp3基因和egfp基因的重組質(zhì)粒，命名為pfbdm-vp0/vp1/vp3/egfp，即上述的含有所述dna分子組合物的重組載體。

上述重組載體的構(gòu)建過(guò)程中，根據(jù)o/mya98p1段序列和綠色熒光蛋白egfp基因序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增fmdv結(jié)構(gòu)蛋白基因vp0、vp1、vp3和egfp的引物，設(shè)計(jì)的引物也在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。

所述o型口蹄疫vp0基因是以o型口蹄疫o/mya98株基因組cdna為模板，以引物vp0f和vp0r擴(kuò)增獲得；o型口蹄疫vp1基因是以o型口蹄疫o/mya98株基因組cdna為模板，以引物vp1f和vp1r擴(kuò)增獲得；o型口蹄疫vp3基因是以o型口蹄疫o/mya98株基因組cdna為模板，以引物vp3f和vp3r擴(kuò)增獲得；綠色熒光蛋白egfp基因是以pegfp-n1為模板，以引物egfpf和egfpr擴(kuò)增獲得；引物序列如下所示：

vp0f：cggaattcatgggagccggacaatccagtcc

vp0r：cgacaagcttactctttggaagggaactcacc

vp1f：tcccccgggatgaccacttcgacaggcgagtc

vp1r：ggggtaccttacaaggactgctttacaggtg

vp3f：tcccccgggatggggattttccctgtggcctg

vp3r：ggggtaccttactgttgccgtgcgtccacag

egfpf：cggaattcatggtgagcaagggcgaggag

egfpr：cgacaagcttttacttgtacagctcgtccatg

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種制備重組口蹄疫病毒樣粒子的方法，包括以下步驟：

1)將所述的dna分子組合物通過(guò)重組載體轉(zhuǎn)化dh10bac感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)篩選鑒定，得到重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒；

2)步驟1)獲得的重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)傳代3次，細(xì)胞培養(yǎng)凍融處理3次，離心，過(guò)濾除菌后，獲得重組桿狀病毒。

所述重組載體優(yōu)選為上述的重組載體。

上述的方法制備得到的重組病毒樣顆粒。

本發(fā)明的再一目的是保護(hù)一種重組口蹄疫病毒樣粒子，所述重組口蹄疫病毒樣粒子是由所述的dna分子組合物中的組分共同組裝表達(dá)的。

更進(jìn)一步的，所述重組口蹄疫病毒樣粒子是按照上述的方法制備得到的重組桿狀病毒樣顆粒。

本發(fā)明還要求保護(hù)一種預(yù)防和/或治療口蹄疫感染的疫苗，其活性成分為所述的重組口蹄疫病毒樣粒子。

所述的重組口蹄疫病毒樣粒子在制備預(yù)防和/或治療口蹄疫感染的疫苗中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

關(guān)于fmdvvlps研究方面，研究人員嘗試通過(guò)痘病毒載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體及大腸桿菌載體等系統(tǒng)建立fmdvvlps的模型。其中，桿狀病毒系統(tǒng)在fmdvvlps的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用中具有其他載體系統(tǒng)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。

基于上述的技術(shù)方案，本發(fā)明的口蹄疫病毒重組病毒樣粒子，利用fmdv結(jié)構(gòu)蛋白vp0、vp3和vp1自組裝成口蹄疫病毒重組病毒樣粒子(fmdvvlps)的特性，改良fmdvvlps桿狀病毒重組載體的構(gòu)建方法，并在載體中加入了綠色熒光蛋白標(biāo)記，通過(guò)pfbdmbac-to-bac系統(tǒng)成功制備出fmdvvlps，提供了一種優(yōu)異的基因工程疫苗。

本發(fā)明的另一個(gè)進(jìn)步在于解決3c蛋白的細(xì)胞毒性問(wèn)題及vlps組裝效率低下的問(wèn)題。由于3c蛋白酶的細(xì)胞毒性及p1蛋白不能切割完全，這些在昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白組裝效率及產(chǎn)量普遍偏低。構(gòu)建能夠同時(shí)表達(dá)vp0、vp1和vp3三種衣殼蛋白的重組桿狀病毒，有效的避免了之前桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)fmdvvlps研究中3c蛋白酶的細(xì)胞毒性問(wèn)題和p1基因切割不完全造成vlps組裝效率低下的問(wèn)題。

本發(fā)明還解決細(xì)胞病變的可觀察性不強(qiáng)方面的問(wèn)題。桿狀病毒的感染滴度、感染復(fù)數(shù)、感染時(shí)間等參數(shù)的確定是制約桿狀病毒系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)的主要因素。其中，桿狀病毒的滴度的確定是其擴(kuò)大應(yīng)用的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)室通常通過(guò)噬斑試驗(yàn)和tcid50試驗(yàn)確定病毒的滴度，由于桿狀病毒感染時(shí)細(xì)胞病變可觀察性對(duì)操作人員具有一定的要求，具有較大的不可控性。本發(fā)明在構(gòu)建重組fmdv衣殼蛋白桿狀病毒時(shí)加入了綠色熒光標(biāo)簽egfp蛋白，可通過(guò)細(xì)胞在熒光顯微鏡下是否能夠表達(dá)egfp來(lái)確定是否存在病毒的感染，能夠很好的解決細(xì)胞病變的可觀察性不強(qiáng)方面的問(wèn)題。此外，egfp蛋白不參與fmdvvp0、vp1和vp3三種衣殼蛋白自組裝vlps生物過(guò)程，在后續(xù)vlps純化過(guò)程中可通過(guò)相應(yīng)的策略有效的去除，對(duì)后續(xù)的應(yīng)用無(wú)影響。

試驗(yàn)證明，本發(fā)明病毒樣顆粒rbac-fluofmdv感染sf9細(xì)胞過(guò)程中能夠表達(dá)fmdv的衣殼蛋白vp0、vp1和vp3，初步純化的病毒樣顆粒rbac-fluofmdv樣品負(fù)染后進(jìn)行透射電鏡觀察，可見(jiàn)其直徑大小為25～30nm病毒樣顆粒，并且中間發(fā)亮，表明rbac-fluofmdv感染sf9細(xì)胞過(guò)程中表達(dá)的vp0、vp1和vp3衣殼蛋白能夠組裝成vlps。以tcid50方法檢測(cè)rbac-fluofmdvp3代病毒滴度為10^-7.5/0.1ml。

附圖說(shuō)明

圖1：o型fmdvvp0、vp1、vp3及egfp基因的克隆；1:dl5000dnamaker；2:egfp基因；3：vp0基因；4：vp1基因；5：vp3基因。

圖2a：vp0、vp1、vp3片段的克隆流程示意圖。

圖2b：egfp片段的克隆流程示意圖。

圖3：重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。

圖4：rbac-fluofmdvp3感染sf9細(xì)胞綠色熒光的觀察。

圖5：rbac-fluofmdv感染sf9細(xì)胞重組蛋白的表達(dá)的westernblot檢測(cè)；

1:sf9細(xì)胞正常組；2:rbac-fluofmdvp2代感染的sf9細(xì)胞培養(yǎng)物；3：rbac-fluofmdvp3代感染的sf9細(xì)胞培養(yǎng)物；4：蛋白maker。

圖6：sf9細(xì)胞感染表達(dá)rbac-fluofmdvvlps電鏡圖片。

具體實(shí)施方式

以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售購(gòu)買產(chǎn)品。

實(shí)施例1重組載體pfbdm-vp0/vp1/vp3/egfp的構(gòu)建

以o/mya98/xj/2010株基因組cdna為模板(o/mya98/xj/2010株基因組cdna可由市售的含有o/mya98/xj/2010株的口蹄疫o型滅活疫苗中提取rna經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得)，分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物(見(jiàn)表1)。以引物vp0f和vp0r擴(kuò)增獲得o型口蹄疫vp0基因，該片段長(zhǎng)909bp，測(cè)序表明，其核苷酸序列為序列表中序列1所示。以引物vp1f和vp1r擴(kuò)增獲得o型口蹄疫vp1基因，該片段長(zhǎng)639bp，測(cè)序表明，其核苷酸序列為序列表中序列2所示。以引物vp3f和vp3r擴(kuò)增獲得o型口蹄疫vp3基因，該片段長(zhǎng)660bp，測(cè)序表明，其核苷酸序列為序列表中序列3所示。上述擴(kuò)增的示意圖請(qǐng)見(jiàn)圖2a,擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖請(qǐng)見(jiàn)圖1。

pegfp-n1質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)室保存，以pegfp-n1為模板，根據(jù)egfp基因序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物(見(jiàn)表1)，以引物egfpf和egfpr擴(kuò)增獲得綠色熒光蛋白egfp基因，片段長(zhǎng)度為720bp，測(cè)序表明，其核苷酸序列為序列表中序列4所示。上述擴(kuò)增的示意圖請(qǐng)見(jiàn)圖2b,擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖請(qǐng)見(jiàn)圖1。

表1.各片段的擴(kuò)增引物

分別將擴(kuò)增得到的o型口蹄疫vp0基因和綠色熒光蛋白egfp基因片段經(jīng)ecori/xbai酶切消化后得到的片段，與經(jīng)過(guò)相同的限制性內(nèi)切酶酶切的pfbdm載體(普如汀生物技術(shù)(北京)有限公司)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh10b感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有氨芐青霉素的lb平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落，在含有氨芐青霉素的液體lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h，分別利用表1中vp0和egfp的克隆引物進(jìn)行菌液pcr鑒定，陽(yáng)性菌落送生工測(cè)序。將測(cè)序正確的菌液以1:500加入到新鮮的含有氨芐抗生素的lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，即得到插入o型口蹄疫vp0基因的重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆和插入綠色熒光蛋白egfp基因的重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆，將測(cè)序表明插入了o型口蹄疫vp0基因的重組質(zhì)粒命名為pfbdm-vp0，將測(cè)序表明插入綠色熒光蛋白egfp基因的重組質(zhì)粒命名為pfbdm-egfp。保存?zhèn)溆?。上述重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖3。

進(jìn)一步將擴(kuò)增得到的vp1基因和vp3基因片段經(jīng)smai/kpni酶切消化后得到的片段，分別與經(jīng)過(guò)相同的限制性內(nèi)切酶酶切的pfbdm-vp0和pfbdm-egfp重組載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh10b感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有氨芐青霉素的lb平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落，在含有氨芐青霉素的液體lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h，分別利用表1中vp1和vp3的克隆引物進(jìn)行菌液pcr鑒定，陽(yáng)性菌落送生工測(cè)序。將測(cè)序正確的菌液以1:500加入到新鮮的含有氨芐抗生素的lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，即分別得到插入o型口蹄疫vp0和vp1基因的重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆、和插入vp3基因和egfp基因的重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆。將測(cè)序表明插入o型口蹄疫vp0和vp1基因的重組質(zhì)粒命名為pfbdm-vp0/vp1；將測(cè)序表明插入vp3基因和egfp基因的重組質(zhì)粒命名為pfbdm-egfp/vp3。將重組質(zhì)粒保存?zhèn)溆?，上述重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖3。

將提取的pfbdm-vp0/vp1質(zhì)粒經(jīng)spei/nrui酶切消化后得到的大片段，與經(jīng)過(guò)avrii/pmei酶切的pfbdm-egfp/vp3質(zhì)粒產(chǎn)生的小片段連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh10b感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有氨芐青霉素的lb平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落，在含有氨芐青霉素的液體lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h，分別利用表1中vp1和vp2的克隆引物進(jìn)行菌液pcr鑒定，陽(yáng)性菌落送生工測(cè)序。將測(cè)序正確的菌液以1:500加入到新鮮的含有氨芐抗生素的lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，即得到插入o型口蹄疫vp0、vp1基因、vp3基因和egfp基因的重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆，將該測(cè)序正確的插入o型口蹄疫vp0、vp1基因、vp3基因和egfp基因的重組質(zhì)粒命名為pfbdm-vp0/vp1/vp3/egfp。將重組質(zhì)粒保存?zhèn)溆?，其?gòu)建示意圖見(jiàn)圖3。

實(shí)施例2重組桿狀病毒rbac-fluofmdv的制備

將pfbdm-vp0/vp1/vp3/egfp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化dh10bac感受態(tài)細(xì)胞，在含有四環(huán)霉素和卡那霉素的液體lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h，涂布含有慶大霉素、四環(huán)霉素和卡那霉素的lb平板，通過(guò)兩輪藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落，用m13f/vp1f和vp0f/m13r引物對(duì)(m13f/r引物是根據(jù)invitrogen公司bac-to-bac說(shuō)明書(shū)提供的序列合成)，進(jìn)行菌液pcr檢測(cè)鑒定，擴(kuò)大培養(yǎng)正確菌株，提取重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒，將其命名為bacmid-vp0/vp1/vp3/egfp，保存?zhèn)溆谩?/p>

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sf9細(xì)胞鋪于六孔板，重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒bacmid-vp0/vp1/vp3/egfpdna按照轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine3000的轉(zhuǎn)染方法要求，進(jìn)行稀釋，與轉(zhuǎn)染試劑混合，轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞。27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)8000rpm離心5min，收集上清，經(jīng)過(guò)濾除菌后，獲得重組桿狀病毒p0代病毒，保存?zhèn)溆?，將該重組桿狀病毒命名為rbac-fluofmdv。

實(shí)施例3重組桿狀病毒rbac-fluofmdv的擴(kuò)增與毒價(jià)測(cè)定

將rbac-fluofmdvp0代病毒按照病毒與培養(yǎng)基1/10(v/v)比例接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sf9細(xì)胞，27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)8000rpm離心5min，收集上清，獲得p1代病毒。以p1代病毒進(jìn)行擴(kuò)增得到p2代，以p2病毒進(jìn)行擴(kuò)增得到p3代。以tcid50方法檢測(cè)rbac-fluofmdvp3代病毒滴度為10^-7.5/0.1ml。

實(shí)施例4重組蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9中的表達(dá)及鑒定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sf9細(xì)胞鋪于六孔板，接種代及p3代rbac-fluofmdv病毒，感染后60h，利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白egfp表達(dá)的情況。結(jié)果如圖4所示，重組桿狀病毒能夠大量表達(dá)綠色熒光蛋白，而未感染重組病毒的sf9細(xì)胞對(duì)照組無(wú)綠色熒光，說(shuō)明綠色熒光蛋白獲得了成功的表達(dá)。

為進(jìn)一步鑒定fmdv各結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)情況，將p2代及p3代細(xì)胞樣品進(jìn)行westernblot分析，以o型fmdv豬多抗血清作為一抗，hrp標(biāo)記羊抗豬igg為上海生工公司產(chǎn)品。用ecl顯色試劑盒顯色，使用化學(xué)發(fā)光曝光顯色。結(jié)果如圖5所示，與豬抗o型fmdv高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)的條帶與fmdv衣殼蛋白vp0(約33kd)、vp1和vp3(約24kd)分子量大小相符，表明rbac-fluofmdv感染sf9細(xì)胞過(guò)程中能夠表達(dá)fmdv的衣殼蛋白vp0、vp1和vp3。

實(shí)施例5病毒樣顆粒的大量制備

將合適密度的sf9細(xì)胞接種于搖瓶中，27℃110rpm恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，待其密度達(dá)到2×10⁶cells/ml，以moi為5接種p3代重組桿狀病毒rbac-fluofmdv，27℃110rpm恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)72h，離心收集細(xì)胞沉淀，用1/20體積的ph8.0的pbs重懸細(xì)胞，與-80℃和室溫反復(fù)凍融3次，12000g離心10min，收集上清，即為初始病毒樣顆粒溶液。

實(shí)施例6病毒樣顆粒的初步純化

將實(shí)施例5中獲得的病毒樣顆粒溶液用0.22μm的濾膜過(guò)濾，取上清溶液做30％蔗糖墊層處理，35000g離心3.5小時(shí)，用1/10體積的pbs重懸，保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例7病毒樣顆粒的鑒定

實(shí)施例6初步純化的病毒樣顆粒樣品負(fù)染后進(jìn)行透射電鏡觀察，結(jié)果如圖6所示，可見(jiàn)其直徑大小為25～30nm病毒樣顆粒，并且中間發(fā)亮，表明rbac-fluofmdv感染sf9細(xì)胞過(guò)程中表達(dá)的vp0、vp1和vp3衣殼蛋白能夠組裝成vlps。

以上對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。

序列表

<110>中牧實(shí)業(yè)股份有限公司

<120>口蹄疫病毒重組病毒樣粒子及其制備方法和應(yīng)用

<130>whoi170046

<160>4

<210>1

<211>909

<212>dna

<213>

<400>1

ggagccggacaatccagtccggctactgggtcacagaaccaatcaggcaacaccgggagt60

atcatcaacaattactacatgcagcagtaccagaactccatggacacccaacttggtgac120

aatgccatcagcggaggctccaacgagggatccacagacacaacttccacccacacaacc180

aacactcagaacaatgactggttttcaaagttggccagctctgccttcagtggtcttttc240

ggcgccctcctcgccgataagaaaaccgaggagaccactcttctcgaggaccgcatcctc300

accacccgaaacggacacaccacctcgacaacccagtcgagtgttggcataacgcacggg360

tacgcaacagctgaggattttgtgagcgggccaaacacctctggtcttgagaccagagtt420

gtccaggcggaacggttctttaaaacccacctgttcgactgggtcaccagtgatccgttc480

ggacggtactacttgttggagctcccgactgaccacaaaggtgtctacggcagcctgacc540

gactcatatgcctacatgagaaacggttgggatgttgaagtcaccgctgtggggaatcag600

ttcaacggaggctgcctactggtggccatggtgcctgaactttgttccatcgagcggaga660

gagctgttccagcttacgctcttcccccaccagttcatcaacccccggacgaacatgaca720

gcccacatcaaggtgccctttgttggcgtcaaccgttacgatcagtacaaggtacacaag780

ccgtggacccttgtggttatggtcgtagccccactgactgtcaacaccgaaggcgctccg840

cagatcaaggtgtatgccaacatcgcacccaccaacgtgcacgtcgcgggtgagttccct900

tccaaagag909

<210>2

<211>639

<212>dna

<213>

<400>2

accacttcgacaggcgagtcggctgaccccgtgactgccaccgttgagaattacggcggc60

gagacacaggtccagaggcgccaccacacagatgtctcattcatattggacagatttgtg120

aaagtcacaccaaaagaatcaataaatgtattggacctgatgcagactcccccccacacc180

ctagtaggggcgctcctccgcactgccacttactatttcgctgatctagaggtggcagtg240

aaacacgagggagaccttacctgggtgccaaatggagcacctgaagcagccttggacaac300

accaccaacccaacggcgtaccataaggcgccgcttacccggcttgcattgccatacacg360

gcaccacaccgtgttttggccaccgtttacaacgggaactgcaaatacgccgggggctca420

ctgctcaacgtgagaggcgatctccaagcgctggctccgaaggcagcgaggccgctgcct480

acttctttcaactacggtgccatcaaagccactcgggtgacagaactgctgtaccgcatg540

aagagggccgagacgtactgtcctcggcccctcttggctattcacccgagtgcggccaga600

cacaaacagaaaatagtggcacctgtaaagcagtccttg639

<210>3

<211>660

<212>dna

<213>

<400>3

gggattttccctgtggcctgtagcgacggttatggcggcttggtgacaactgacccaaag60

acggctgaccccgtttacggcaaagtgttcaaccccccccgcaacatgttgccggggcgg120

ttcaccaacctcttggacgtggctgaggcttgccccacgtttctgcacttcgatggtgac180

gtaccgtacgtgaccactaagacggattcggacagggtgctcgcacaatttgacttgtct240

ttggcagcaaaacacatgtcaaacaccttccttgcaggtcttgcccagtactacacgcag300

tacagcggcaccgtcaacctgcacttcatgttcacaggtcccactgacgcgaaagcgcgt360

tacatgattgcgtatgcccctccgggcatggagccgcccaaaacacctgaggctgctgct420

cactgcattcacgcagagtgggacacgggtctgaactcaaagtttaccttttccatcccc480

tacctctcggcggctgattacgcgtacaccgcgtctgacgctgctgagaccacaaatgtt540

cagggatgggtctgcttatttcaaataacacacgggaaagctgagggtgacgctcttgtc600

gtgctggccagtgctggcaaagactttgagctgcgcctgcctgtggacgcacggcaacag660

<210>4

<211>720

<212>dna

<213>

<400>4

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggac60

ggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctac120

ggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccacc180

ctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaag240

cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttc300

ttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctg360

gtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcac420

aagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaac480

ggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgcc540

gaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccac600

tacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtc660

ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa720