本發(fā)明屬于蔬菜育種與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高通量鑒定甜瓜雜交種純度的方法。

背景技術(shù)：

甜瓜是傳統(tǒng)的特色水果和瓜農(nóng)就業(yè)增收的主要經(jīng)濟作物。甜瓜雜交種的種子純度是種子質(zhì)量的核心指標(biāo)，隨著甜瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和生產(chǎn)的需求，越來越多的優(yōu)質(zhì)、抗病新品種涌入市場，但由于雜交種子中混入了母本種子導(dǎo)致純度不達標(biāo)，引起的種子糾紛時有發(fā)生，給瓜農(nóng)造成很大的經(jīng)濟損失，因此為了保護育種者、種子經(jīng)營者及瓜農(nóng)的利益，研究并建立快速、準(zhǔn)確有效的種子純度鑒定方法是非常重要的。

在眾多分子標(biāo)記技術(shù)中，ssr技術(shù)因其多態(tài)性高、操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，在甜瓜、黃瓜、西瓜等瓜類作物的雜交種純度鑒定方面得到了廣泛應(yīng)用。甜瓜核基因組ssr標(biāo)記呈現(xiàn)共顯性遺傳方式，電泳檢測時，f1帶型為雙親互補帶型，只能通過單株檢測才能顯示f1種子中混入的母本種子，工作量較大。而在甜瓜雜交種子純度鑒定工作中，母本株通常較少，如果能夠通過混合樣品檢測就可顯示母本的有無，從而迅速判定混合樣品的整體純度，將大幅度減少工作量，顯著提高工作效率，因此，急需尋找能夠進行混合樣品分析的分子標(biāo)記技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高通量鑒定甜瓜雜交種純度的方法。

本發(fā)明提供了一種高通量鑒定甜瓜品種a的雜交種中是否混有其母本自交種的方法，其原理在于：甜瓜的線粒體基因組呈現(xiàn)獨特的父系遺傳特性。電泳檢測時，純合的f1帶型和父本帶型一樣；如果f1帶型是雙親帶型，將表示f1種子中混入了母本種子。該方法具體可包括如下步驟：

(a1)從待測甜瓜種子中隨機選取若干數(shù)目的種子，提取基因組dna，混合后形成混合樣本dna；

(a2)以步驟(a1)所得混合樣本dna作為模板，采用根據(jù)甜瓜線粒體基因組開發(fā)的ssr引物對進行pcr擴增，得到擴增產(chǎn)物；

(a3)將步驟(a2)所得擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)電泳譜圖按照如下確定所述待測甜瓜種子是否均為甜瓜品種a的雜交種：若所述電泳圖譜上具有所述甜瓜品種a的父本的特征譜帶且不具有所述甜瓜品種a的母本的特征譜帶，則所述待測甜瓜種子均為所述甜瓜品種a的雜交種，不含其母本自交種；若所述電泳圖譜上同時具有所述甜瓜品種a的父本的特征譜帶和所述甜瓜品種a的母本的特征譜帶，則所述待測甜瓜種子中除了所述甜瓜品種a的雜交種外混有其母本自交種。

所述待測甜瓜種子為所述甜瓜品種a的雜交種，或者所述甜瓜品種a的雜交種與其母本自交種的混合。

在所述方法的步驟(a1)中，所述若干數(shù)目可為大于等于2且小于50的整數(shù)(如20-40)。

進一步，在本發(fā)明的一個實施例中，所述若干數(shù)目具體為20，即步驟(a1)中，每20個種子一混合。

在所述方法中，所述凝膠電泳具體為聚丙烯酰胺凝膠電泳；如非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；更加具體如8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

在本發(fā)明中，所述8％非變性聚丙烯酰胺溶液具體由20mlddh2o、4ml10×tbe、16ml20％(質(zhì)量百分比)acr-bis、40μltemed、400μl10％(質(zhì)量百分比)ap配制而成。

在所述方法中，將所述擴增產(chǎn)物經(jīng)8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，220v穩(wěn)壓電泳直至溴酚藍指示劑遷移至可以使擴增dna片段能夠被清楚識別的距離時，停止電泳；銀染法染色，拍照記錄特征譜帶。

在所述方法中，從種子中提取基因組dna具體為從種子所發(fā)幼芽中提取基因組dna。更加具體的，為：將待測樣品種子35℃發(fā)芽3-4天，取1cm左右的幼芽，分別裝入2ml離心管，加入0.1m的naoh溶液100μl，用組織搗碎儀打碎樣品，沸水水浴1min左右，加入ph8.0的tris-hcl緩沖液1ml，充分混勻，得待測樣品基因組dna，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

在所述方法中，進行pcr擴增采用的反應(yīng)體系如下：基因組dna20ng、含mg²⁺的10×buffer1.25μl，dntp0.2mmol·l^-11μl，上下游引物0.25mmol·l^-1各1μl，taq酶5u·μl^-10.2μl，ddh2o補足至12.5μl。

在所述方法中，進行pcr擴增采用的退火溫度為55℃。更加具體的，進行pcr擴增采用的擴增程序如下：94℃下預(yù)變性5min；94℃下變性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec，35個循環(huán)反應(yīng)；72℃延伸5min；16℃永久保存。

在本發(fā)明的一個實施例中，所述甜瓜品種a為甜瓜品種“糖妃極品”。步驟(a2)中，所述根據(jù)甜瓜線粒體基因組開發(fā)的ssr引物對為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈dna組成的引物對。相應(yīng)的，所述“糖妃極品”的父本的特征譜帶是大小為255bp的目的條帶；所述“糖妃極品”的母本的特征譜帶是大小為243bp的目的條帶。

本發(fā)明還請求保護用于鑒定甜瓜“糖妃極品”雜交種純度的引物對。

所述引物對具體由序列表中序列1和序列2所示兩條單鏈dna組成。

所述引物對在如下(b1)或(b2)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍：

(b1)鑒定甜瓜“糖妃極品”雜交種純度；

(b2)制備用于鑒定甜瓜“糖妃極品”雜交種純度的試劑盒。

其中，所述鑒定甜瓜“糖妃極品”雜交種純度可為高通量鑒定甜瓜“糖妃極品”雜交種純度。

本發(fā)明的有益效果是：通過合理混合樣品dna，避免了單株分析，具有簡單、高效等優(yōu)勢?？梢詫⒅辽?0株樣品dna進行混合，1次pcr檢測即可顯示混合樣品中是否存在母本，大幅度減少了鑒定工作量，將鑒定效率提高20倍左右，具有較高的商業(yè)應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為利用引物mtssr073擴增“糖妃極品”f1及其父本、母本和不同比例dna混合樣品的pcr電泳結(jié)果。♀表示母本，♂表示父本，f1表示“糖妃極品”，1:1、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50表示混合樣品dna中的母本與f1體積比。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、用于高通量檢測甜瓜“糖妃極品”雜交種混合樣品純度的方法

一、篩選用于鑒定甜瓜“糖妃極品”純度的mtssr引物

從genbank下載甜瓜線粒體基因組序列，使用mreps2.5ssr序列鑒定程序，鑒定甜瓜線粒體基因組中含ssr的序列區(qū)段，同時設(shè)計出跨越ssr位點的pcr引物；

以“糖妃極品”母本、父本、f1為dna模板進行引物篩選，獲得條帶清晰、差異大、重復(fù)性好的引物mtssr073，其序列為；

mtssr073f：5’-tgtcgagttcactctttcattag-3’(序列1)；

mtssr073r：5’-ttcattctttgctctcgttatac-3’(序列2)。

二、利用特異性引物mtssr073對甜瓜“糖妃極品”雜交種子混合樣品進行純度鑒定

1、樣品dna的快速提?。簩⒐┰囂鸸稀疤清鷺O品”以及其父本和母本的種子，35℃發(fā)芽3-4天，取0.5-1cm左右的幼芽，分別裝入2ml離心管，加入0.1m的naoh溶液100μl，用組織搗碎儀打碎樣品，沸水水浴1min左右，加入ph8.0的tris-hcl緩沖液1ml，充分混勻，得待測樣品基因組dna，4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

2、樣品dna混合：按照母本與f1(即“糖妃極品”)的體積比為1:1、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的體積比進行樣品dna混合；

3、pcr擴增

①反應(yīng)體系

12.5μl反應(yīng)體系如下：基因組dna20ng、含mg²⁺的10×buffer1.25μl，dntp0.2mmol·l^-11μl，上下游引物0.25mmol·l^-1各1μl，taq酶5u·μl^-10.2μl，ddh2o補足至12.5μl。

②反應(yīng)條件

94℃下預(yù)變性5min；94℃下變性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec，35個循環(huán)；72℃延伸5min；16℃永久保存；

4、聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳

擴增產(chǎn)物在8％聚丙烯酰胺非變性凝膠(由20mlddh2o、4ml10×tbe、16ml20％acr-bis、40μltemed、400μl10％ap配制而成。％均表示質(zhì)量百分比)電泳分離，120v穩(wěn)壓1.5小時，電泳結(jié)束后，0.1％agno3銀染6min；然后用2％naoh、0.4％甲醛顯色，直至條帶清晰即可。

5、拍照記錄樣品dna的特征譜帶。

6、擴增結(jié)果分析：

mtssr073引物在“糖妃極品”父本、母本均可以擴增出特異標(biāo)記，母本表現(xiàn)為243bp的特征譜帶，父本表現(xiàn)為相異于母本的255bp特征譜帶，f1表現(xiàn)和父本一樣的255bp特征譜帶。

混合樣品中，當(dāng)混合比例為1:1、1:5、1:10、1:20時，混合樣品中均顯示出清晰的243bp母本條帶，說明當(dāng)混樣株數(shù)達到20株時，樣品中即使只有1株母本株，也可以被檢測出來。但是，當(dāng)混合樣品比例降低到1:30甚至1:40時，243bp的母本條帶變?nèi)?；混合樣品比例降低?:50時弱帶消失。說明當(dāng)混樣株數(shù)達到50株時，如果樣品中有1株母本株，將很難被檢測，影響純度鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。具體結(jié)果如圖1所示。

實施例2、采用混合樣品法高通量檢測“糖妃極品”雜交種樣品純度

一、樣品dna的快速提取

將待測試的“糖妃極品”f1種子100粒，35℃發(fā)芽3-4天，取0.5-1cm左右的幼芽，分別裝入2ml離心管，加入0.1m的naoh溶液100μl，用組織搗碎儀打碎樣品，沸水水浴1min左右，加入ph8.0的tris-hcl緩沖液1ml，充分混勻，得待測樣品基因組dna，4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

二、樣品dna混合

將“糖妃極品”f1種子dna，按照每20株一混，形成5個混合樣品?；旌系?0株樣品，單株體積相同。

三、pcr擴增

1、反應(yīng)體系

12.5μl反應(yīng)體系如下：基因組dna20ng、含mg²⁺的10×buffer1.25μl，dntp0.2mmol·l^-11μl，上下游引物0.25mmol·l^-1各1μl，taq酶5u·μl^-10.2μl，ddh2o補足至12.5μl。

其中，基因組dna分為兩組：一組為單株dna；另一組為混樣dna。即實驗中采用單株檢測和混樣高通量檢測兩種方法平行進行，以驗證高通量檢測方法的準(zhǔn)確性。

2、反應(yīng)條件

94℃下預(yù)變性5min；94℃下變性30sec、55℃退火30sec、72℃下延伸30sec，35個循環(huán)；72℃延伸5min；16℃永久保存；

四、聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳

擴增產(chǎn)物在8％聚丙烯酰胺非變性凝膠(由20mlddh2o、4ml10×tbe、16ml20％acr-bis、40μltemed、400μl10％ap配制而成。％均表示質(zhì)量百分比)電泳分離，120v穩(wěn)壓1.5小時，電泳結(jié)束后，0.1％agno3銀染6min；然后用2％naoh、0.4％甲醛顯色，直至條帶清晰即可。拍照記錄樣品dna的特征譜帶。

五、擴增結(jié)果分析

采用單株dna進行pcr分析時，100株f1單株中有1株表現(xiàn)為母本帶型，說明100株單株中混入了一株母本株；

采用混合樣品dna進行pcr分析時中，只有混樣1表現(xiàn)為雜合帶型，說明20株f1單株中混入了母本，其余4個混樣均表現(xiàn)為父本帶型，表明這80株均為純合的f1單株。將混樣1進行單株檢測，發(fā)現(xiàn)確實有1株母本，與單株檢測結(jié)果一致。

<110>北京市農(nóng)林科學(xué)院

<120>高通量鑒定甜瓜雜交種純度的方法

<130>gncln171418

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tgtcgagttcactctttcattag23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ttcattctttgctctcgttatac23