本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌j-15及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

棉花黃萎病素有“棉花癌癥”之稱，1914年在美國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)之后迅速蔓延至全世界，1935年傳入我國(guó)，由大麗輪枝菌（verticilliumdahliaekleb）侵染引起，是最具破壞性的棉花病害之一。黃萎病在世界范圍都有分布，在我國(guó)所有植棉區(qū)，發(fā)病面積占我國(guó)棉田總面積的50%，重病田占70%，成為影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的主要障礙因素。

棉花黃萎病的防治主要有抗性品種培育、化學(xué)防治、物理防治三大類，各個(gè)防治方法都有一定的作用，但都存在一定的問(wèn)題：利用棉花抗性品種雖然可以有效降低黃萎病的爆發(fā)程度，但目前已培育出的部分耐病品種，抗病性水平不高、抗性不夠穩(wěn)定，且抗性品種的抗病性與豐產(chǎn)性往往呈反比，從而影響棉花種植產(chǎn)量和質(zhì)量；使用化學(xué)農(nóng)藥方法防治病害，雖效果較好，但會(huì)造成病原菌的耐藥性，還會(huì)造成土壤、水等環(huán)境的農(nóng)藥污染，這一問(wèn)題現(xiàn)在已經(jīng)非常嚴(yán)峻；采用輪作、倒茬、深耕等物理方法，也是比較有效的防治棉花黃萎病的方法之一，但會(huì)耗費(fèi)大量的勞動(dòng)力和機(jī)械動(dòng)力，且要掌握好輪作的時(shí)間才能有效，如果輪作時(shí)間較為有限錯(cuò)過(guò)即不再有效。

利用拮抗微生物防治棉花黃萎病等作物病害已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。目前利用的微生物有木莓等真核微生物及芽孢桿菌原核類微生物。其中因?qū)θ诵鬅o(wú)害的優(yōu)勢(shì)，芽孢桿菌在開發(fā)生防菌中倍受研究者關(guān)注，已有多種生防效應(yīng)的優(yōu)良菌種報(bào)到。但由于這些菌的拮抗活性物質(zhì)不清楚，拮抗機(jī)制不明晰，廣泛應(yīng)用受到了限制。而且生防菌能否有效應(yīng)用，還與生防菌的來(lái)源和環(huán)境適應(yīng)性關(guān)系密切。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：提供一種從新疆和碩連作棉田根際土壤中分離出一株高效拮抗大麗輪枝菌的枯草芽孢桿菌j-15。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，枯草芽孢細(xì)菌j-15可導(dǎo)致大麗輪枝菌孢子不能萌發(fā)甚至死亡，菌絲畸形、產(chǎn)孢能力下降，可作為棉花黃萎病生防菌。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種枯草芽孢桿菌j-15（bacillussubtilisj-15），該菌株的保藏編號(hào)為cctccno：m2017309。所述的枯草芽孢桿菌j-15的16srrna基因序列如seqidno.1所示?？莶菅挎邨U菌j-15，在防治棉花黃萎病中的應(yīng)用。

菌種保藏說(shuō)明：菌種名稱：枯草芽孢菌；拉丁學(xué)名：bacillussubtilis；保藏編號(hào)：cctccno：m2017309；保藏機(jī)構(gòu)：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，郵編：430072，電話：（027）68754052，傳真：（027）68754833，e-mail：cctcc@whu.edu.cn；保藏日期：2017年6月7日。

本發(fā)明的有益效果：本菌株選擇新疆和碩境內(nèi)連作棉田為采樣區(qū)，從經(jīng)冬季低溫自然凍封后的棉花根際土壤，分離獲得對(duì)大麗輪枝菌具有高效拮抗效應(yīng)的枯草芽孢桿菌j-15，并探究了抑菌特性?？莶菅挎邨U菌j-15具有生長(zhǎng)快、對(duì)酸堿及營(yíng)養(yǎng)等條件要求低、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)和次生代謝抗菌活性物質(zhì)能胞外分泌等特質(zhì)，且對(duì)人畜安全、不污染環(huán)境、對(duì)植物無(wú)不良影響、不干擾其他植物病害防治措施。另外不僅能拮抗植物病原菌，且生命力強(qiáng)，對(duì)病原菌有穩(wěn)定的抑制效果。

附圖說(shuō)明

附圖1為枯草芽孢桿菌j-15菌液及其提取的活性物質(zhì)對(duì)大麗輪枝菌的拮抗效果圖，其中a為枯草芽孢桿菌j-15無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)大麗輪枝菌拮抗效果，b為枯草芽孢桿菌j-15菌液對(duì)大麗輪枝菌的拮抗效果；

附圖2為枯草芽孢桿菌j-15生理生化特性圖表；

附圖3為大麗輪枝菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周后，鏡下菌絲的生長(zhǎng)情況，其中b為抑菌圈附近的大麗輪枝菌，菌體短粗、彎曲，a為遠(yuǎn)離抑菌圈的大麗輪枝菌，菌絲細(xì)長(zhǎng)、光滑，與遠(yuǎn)離抑菌圈的鏡檢結(jié)果相比，抑菌圈附近的孢子數(shù)量相對(duì)較少；

附圖4為健康的大麗輪枝菌芽管圖及其局部放大圖；

附圖5為大麗輪枝菌與1倍濃度枯草芽孢桿菌j-15提取活性物質(zhì)共培養(yǎng)72小時(shí)后，大麗輪枝菌孢子的生長(zhǎng)情況，左圖為電鏡下的大麗輪枝菌孢子，右圖為對(duì)應(yīng)的局部放大圖；

附圖6為枯草芽孢桿菌j-15對(duì)棉花黃萎病的防治效果對(duì)照?qǐng)D；其中，圖6a為只施大麗輪枝菌的對(duì)照組，圖6b為施有大麗輪枝菌和j-15發(fā)酵液的棉株，圖6c為相應(yīng)棉株莖橫切顯微圖；圖6d為相應(yīng)棉株莖橫切顯微圖；圖6e為相應(yīng)棉株莖橫切顯微圖；圖6c，d及e鏡檢倍數(shù)為100x和1000x。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明申請(qǐng)，所述實(shí)施例用于理解而不是限制本發(fā)明申請(qǐng)。

實(shí)施例1、從新疆和碩連作棉田根際土壤中分離出一株枯草芽孢桿菌j-15。經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出，j-15可導(dǎo)致大麗輪枝菌孢子不能萌發(fā)甚至死亡，菌絲畸形、失去產(chǎn)孢能力，可作為棉花黃萎病生防菌。然后在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行如下的實(shí)驗(yàn)測(cè)試：

1、枯草芽孢桿菌j-15發(fā)酵液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)抑制作用：使用抑菌圈法檢測(cè)菌株的抗病性，待大麗輪枝菌菌絲布滿平板后測(cè)量菌株的抑菌圈大小，如圖1所示，抗菌活性物質(zhì)為枯草芽孢桿菌j-15胞外分泌的代謝產(chǎn)物，保證了抗菌活性物質(zhì)易于提取。

2、枯草芽孢桿菌j-15的分離：將篩選獲得的枯草芽孢桿菌株j-15劃線接至牛肉膏蛋白胨平板，37℃倒置培養(yǎng)24h，經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后，重復(fù)平板抑菌試驗(yàn)，以確?？莶菅挎邨U菌j-15遺傳性能的穩(wěn)定性。

3、枯草芽孢桿菌j-15的常規(guī)鑒定：觀察篩選獲得的枯草芽孢桿菌j-15單菌落；使用革蘭氏染色法和schaeffer-fulton氏染色法，對(duì)拮抗菌株進(jìn)行菌體和芽孢染色，染色后鏡檢觀察，根據(jù)蠟樣芽胞桿菌鑒定管鑒定其生理生化特性，如圖2所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)鑒定菌株j-15為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體為白色，邊緣不整齊，表面有褶皺，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。

4、16srdna序列鑒定：并對(duì)其16srdna測(cè)序，利用blast將測(cè)得序列與genbank中所有已測(cè)定的原核生物的16srdna序列進(jìn)行比對(duì)，獲得相似菌株16srdna序列。結(jié)合該菌生理生化鑒定，確定為枯草芽孢桿菌。登錄號(hào)為kt901818，16srdna序列如seqidno.1所示，長(zhǎng)度為1407bp。

5、枯草芽孢桿菌j-15無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)大麗輪枝菌菌絲形態(tài)及產(chǎn)孢能力有顯著影響。在涂布大麗輪枝菌孢子懸液的固體培養(yǎng)基上打孔，在孔中加入j-15無(wú)菌發(fā)酵液，將平板指25度培養(yǎng)一周后，對(duì)比遠(yuǎn)離抑菌圈和靠近抑菌圈的菌絲的生長(zhǎng)情況。其中圖3a為遠(yuǎn)離抑菌圈的大麗輪枝菌，菌絲細(xì)長(zhǎng)、光滑、生長(zhǎng)健康，且周圍分布大量的新生孢子；圖3b為抑菌圈附近的大麗輪枝菌菌絲體生長(zhǎng)情況，其菌絲體短粗、彎曲甚至畸變，抑菌圈附近相對(duì)遠(yuǎn)離抑菌圈的位置的孢子數(shù)量極顯著減少；

6、將大麗輪枝菌與1倍濃度枯草芽孢桿菌j-15提取活性物質(zhì)共培養(yǎng)72小時(shí)后，在電鏡下觀察大麗輪枝菌孢子的萌發(fā)情況，孢子破裂，不能形成芽管，無(wú)法形成正常的菌絲體。

實(shí)施例2、對(duì)j-15的菌液進(jìn)行盆栽防治效果實(shí)驗(yàn)，將土壤滅菌，每盆60g。對(duì)vd（大麗輪枝菌）孢子懸液和j-15發(fā)酵液鏡檢計(jì)數(shù)。對(duì)照組（ck）：加vd孢子懸液至終濃度為107個(gè)/g土；處理：加vd孢子懸液和j-15發(fā)酵液至二者終濃度均達(dá)到107個(gè)/g土。每盆土均為獨(dú)立澆菌攪拌混勻。棉花種子浸泡一夜后播種，25℃溫室常規(guī)培養(yǎng)，對(duì)比ck與處理組棉花發(fā)病情況。并對(duì)各組棉株莖部進(jìn)行切片觀察。在實(shí)驗(yàn)室盆栽試驗(yàn)中，只混有大麗輪枝菌孢子液的對(duì)照組棉株葉脈間失綠變黃，葉片一觸即掉如附圖6c所示，自發(fā)病起兩周內(nèi)幾乎所有棉株干枯死亡，從其莖部切片發(fā)現(xiàn)維管束細(xì)胞處填充有黃色物質(zhì)如附圖圖6e所示；而施加j-15的棉株葉片正常如附圖6d所示，j-15處理棉株長(zhǎng)勢(shì)較好；對(duì)兩組棉株莖進(jìn)行切片鏡檢發(fā)現(xiàn)j-15處理組維管束細(xì)胞均無(wú)異常。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)室盆栽試驗(yàn)中，菌株j-15對(duì)棉花黃萎病均具有良好的防治效果。

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<110>新疆師范大學(xué)

<120>一種枯草芽孢桿菌j-15及其應(yīng)用

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<213>枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）

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