本發(fā)明屬于藥物質(zhì)量控制領(lǐng)域，具體涉及鹽酸沙格雷酯遺傳毒性雜質(zhì)ⅴ、ⅵ及其制備方法、檢測方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鹽酸沙格雷酯片1993年在日本首次上市，商品名為anplag，是一種5-ht2受體阻滯劑，能夠抑制血小板凝聚、抑制血管收縮，具有抗血栓作用以及改善微循環(huán)。其適應(yīng)癥為改善慢性動脈閉塞癥引起的潰瘍、疼痛以及冷感等缺血性諸癥狀。

目前，鹽酸沙格雷酯原料藥及其制劑的質(zhì)量研究涉及如下四種光降解雜質(zhì)：

申請人先前提供了一種一鍋法制備鹽酸沙格雷酯光降解雜質(zhì)ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ的方法(申請?zhí)?017106469276)，該方法通過一鍋法降解制備得到含有雜質(zhì)ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ的降解混合物，再通過高速逆流色譜法一次性分離得到雜質(zhì)ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ，純度均在98％以上，可以用作雜質(zhì)對照品，且總收率在80％以上，原料利用率高，步驟少，效率高，其高速逆流色譜圖如圖1所示。申請人對其中兩個未知色譜峰1、2進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)為兩種具有具有潛在遺傳毒性的雜質(zhì)(具有環(huán)氧警示結(jié)構(gòu)，可參見“遺傳毒性雜質(zhì)的警示結(jié)構(gòu)，中國新藥雜志2014年第23卷第18期”)，而且申請人在鹽酸沙格雷酯原料藥的強(qiáng)制光降解實驗中檢出了這兩種雜質(zhì)，進(jìn)一步的ames試驗顯示該兩種雜質(zhì)均為陽性。根據(jù)藥品中遺傳毒性雜質(zhì)的控制要求(藥品中遺傳毒性雜質(zhì)的評估和控制，中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)2014年9月第31卷第9期)，應(yīng)將這兩種雜質(zhì)列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行監(jiān)控。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供鹽酸沙格雷酯遺傳毒性雜質(zhì)ⅴ、ⅵ及其制備方法、檢測方法、應(yīng)用。

本發(fā)明通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)：

如下化學(xué)結(jié)構(gòu)的遺傳毒性雜質(zhì)ⅴ、ⅵ：

上述遺傳毒性雜質(zhì)ⅴ、ⅵ的制備方法，包括：

步驟s1，光降解：

將鹽酸沙格雷酯用水溶解配制成鹽酸沙格雷酯溶液，先于80-90℃高溫處理1-2小時，再依次于一百二十萬勒克斯冷白熒光燈照射4-6小時、200瓦小時/平方米的紫外熒光燈照射3-5小時，最后將降解的溶液濃縮冷凍至干得降解混合物；

步驟s2，高速逆流色譜分離：

用等體積固定相和流動相將上述降解混合物溶解作為樣品溶液，以乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸(4:1:5:0.025，v/v/v/v)為兩相溶劑系統(tǒng)，上相為固定相，下相為流動相，在主機(jī)轉(zhuǎn)速800r/min、流速2.0ml/min、檢測波長272nm條件下，根據(jù)色譜圖收集流分，濃縮干燥得雜質(zhì)ⅴ、ⅵ。

優(yōu)選地，高速逆流色譜采用多層聚四氟乙烯螺旋管作為分離管，直徑2.3mm，分離體積230ml，β值為0.5-0.8。

優(yōu)選地，高速逆流色譜分離柱溫為35℃。

優(yōu)選地，高溫處理優(yōu)選85℃處理1.5小時。

優(yōu)選地，光照處理優(yōu)選方案為：先于一百二十萬勒克斯冷白熒光燈照射5小時，再于200瓦小時/平方米的紫外熒光燈照射4小時。

上述遺傳毒性雜質(zhì)ⅴ、ⅵ的檢測方法，包括如下色譜參數(shù)：

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠(c18)色譜柱；

流動相：a相為體積百分濃度為0.2％的四氫呋喃-水溶液；

b相為體積百分濃度為0.2％的四氫呋喃-乙腈溶液；

洗脫程序：0-5min，5％b相；5-10min，5％→35％b相；10-30min，35％→65％b相；30-32min，65％→100％b相；32-35min，100％b相；35-37min，100％→5％b相；37-40min，5％b相；流速為1.0ml/min；

柱溫：34-36℃；檢測波長：272±2nm。

優(yōu)選地，所述色譜柱的規(guī)格為長250mm，內(nèi)徑4.6mm，填料粒徑5μm。

優(yōu)選地，色譜柱優(yōu)選zorbaxsb-c18柱。

遺傳毒性雜質(zhì)ⅴ、ⅵ在鹽酸沙格雷酯原料藥或制劑的質(zhì)量控制中用作雜質(zhì)對照品的用途。

本發(fā)明的優(yōu)點：

1、本發(fā)明提供了兩種具有潛在遺傳毒性的雜質(zhì)ⅴ、ⅵ(具有環(huán)氧警示結(jié)構(gòu))，而且本申請的發(fā)明人在鹽酸沙格雷酯原料藥的強(qiáng)制光降解實驗中檢出了這兩種雜質(zhì)，進(jìn)一步的ames試驗顯示該兩種雜質(zhì)均為陽性，遺傳毒性風(fēng)險非常高。根據(jù)藥品中遺傳毒性雜質(zhì)的控制要求，這兩種遺傳毒性雜質(zhì)應(yīng)當(dāng)列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行監(jiān)控，本發(fā)明提供的遺傳毒性雜質(zhì)ⅴ、ⅵ可以在鹽酸沙格雷酯原料藥或制劑的質(zhì)量控制中用作雜質(zhì)對照品；

2、本發(fā)明提供的制備方法可以一次性制備得到雜質(zhì)ⅴ、ⅵ，純度大于98％；該制備方法還可以同時制備得到另外四種雜質(zhì)ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ，效率高；

3、本發(fā)明提供的檢測方法可以有效將雜質(zhì)遺傳毒性ⅴ、ⅵ與沙格雷酯、雜質(zhì)ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ分離，分離度均大于1.5，拖尾因子在規(guī)定范圍內(nèi)。

附圖說明

圖1為鹽酸沙格雷酯光降解產(chǎn)物的高速逆流分離色譜圖；

圖2為沙格雷酯與雜質(zhì)ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅵ的分離色譜圖；其中a為混合對照品溶液色譜圖，b為鹽酸沙格雷酯+混合對照品溶液色譜圖，c為強(qiáng)制光降解溶液色譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步介紹本發(fā)明的技術(shù)方案。

下述實施例采用的高速逆流色譜儀的相關(guān)信息：

gs10a型高速逆流色譜儀(hsccc，北京艾美林科技有限公司)、多層聚四氟乙烯螺旋管(直徑2.3mm，分離體積230ml，β值為0.5-0.8)、tbp泵(上海同田生物技術(shù)有限公司)、8823b-紫外檢測器(北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司)、3057-11記錄儀(重慶川儀總廠有限公司)。

實施例1光降解雜質(zhì)ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅵ的制備

降解混合物的制備方法：

取60mg鹽酸沙格雷酯用水溶解配制成3mg/ml的溶液，先于85℃高溫處理1.5小時，再依次于一百二十萬勒克斯冷白熒光燈照射5小時、200瓦小時/平方米的紫外熒光燈照射4小時，最后將降解的溶液濃縮冷凍至干得降解混合物。

降解混合物的高速逆流分離方法：

分離前12小時配制乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸(4:1:5:0.025，v/v/v/v)溶劑系統(tǒng)，具體配制方法為：將四種溶劑按比例混合，劇烈震蕩后，靜置12小時使其完全分層，在漏斗中將上、下相分離，上相用作固定相，下相用作流動相，用前超聲半小時。分別取上相5ml和下相5ml，混合后將上述凍干粉全部溶解在其中(需要超聲輔助溶解)作為高速逆流的樣品溶液。

將兩相溶劑體系中已超聲脫氣的上相(固定相)以20ml/min的流速泵入hsccc分離管中(分離溫度35℃)，待上相充滿整個分離管后，調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速達(dá)800r/min，順時針旋轉(zhuǎn)，待轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，以2.0ml/min流速泵入下相(流動相)，檢測波長為272nm。當(dāng)流動相從主機(jī)口流出時，說明體系已達(dá)到流體動力學(xué)平衡，此時將已準(zhǔn)備好的10ml樣品溶液注入hsccc儀，同時開始采集數(shù)據(jù)，根據(jù)色譜圖收集目標(biāo)成分，色譜圖如圖1所示。

未知色譜峰2核磁鑒定數(shù)據(jù)：¹h-nmr(dmso-d6，600mhz)，δ：2.25(6h，n-ch3)，2.36-2.64(2h，n-ch2)，3.72(3h，o-ch3)，4.06(1h，ch-oh)，5.35(1h，-oh)，4.12-4.18(2h，o-ch2)，4.24(2h，ch-o-ch)，6.91-7.28(8h，苯環(huán)氫)；esi，m/z：344.18[m+h]⁺；

鑒定為如下結(jié)構(gòu)：

未知色譜峰1核磁鑒定數(shù)據(jù)：¹h-nmr(dmso-d6，600mhz)，δ：2.52(2h，co-ch2)，2.73(2h，co-ch2)，2.65,2.90(2h，n-ch2)，3.27(3h，n-ch3)，3.70(3h，o-ch3)，4.06,4.29(2h，o-ch2)，4.23(2h，ch-o-ch)，5.12(1h，o-ch)，5.54(1h，-nh-)，12.16(1h，-cooh)，6.90-7.28(8h，苯環(huán)氫)；esi，m/z：430.18[m+h]⁺；

鑒定為如下結(jié)構(gòu)：

將各色譜峰對應(yīng)的流分濃縮干燥得雜質(zhì)ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅵ，純度均大于98％。

實施例2遺傳毒性雜質(zhì)ⅴ、ⅵ的液相檢測方法

1、色譜條件

色譜柱：zorbaxsb-c18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；

流動相：a相為體積百分濃度為0.2％的四氫呋喃-水溶液；

b相為體積百分濃度為0.2％的四氫呋喃-乙腈溶液；

洗脫程序：0-5min，5％b相；5-10min，5％→35％b相；10-30min，35％→65％b相；30-32min，65％→100％b相；32-35min，100％b相；35-37min，100％→5％b相；37-40min，5％b相；流速為1.0ml/min；

柱溫：35℃；

檢測波長：272nm；

進(jìn)樣量：10μl。

2、溶液配制

對照品溶液：分別取雜質(zhì)ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅵ的對照品用5％b相的流動相溶解配制成濃度約為1μg/ml的單獨對照品溶液和混合對照品溶液；

鹽酸沙格雷酯+混合對照品溶液：分別取鹽酸沙格雷酯、雜質(zhì)ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ、ⅵ的對照品用5％b相的流動相溶解配制成雜質(zhì)濃度分別約為1μg/ml、沙格雷酯1mg/ml的溶液；

強(qiáng)制光降解溶液：取鹽酸沙格雷酯用去離子水溶解配制成濃度約為1mg/ml的溶液，置于強(qiáng)制光降解試驗箱內(nèi)，于4500±500lx光照強(qiáng)度下光照10天。

3、分析結(jié)果

分別精密量取對照品溶液、鹽酸沙格雷酯+混合對照品溶液、強(qiáng)制光降解溶液10μl按照上述色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果各溶液的色譜圖如圖2所示，其中a為混合對照品溶液色譜圖，b為鹽酸沙格雷酯+混合對照品溶液色譜圖，c為強(qiáng)制光降解溶液色譜圖。從圖2可以看出，本發(fā)明提供的檢測方法可以有效將雜質(zhì)遺傳毒性ⅴ、ⅵ與沙格雷酯、雜質(zhì)ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ分離，分離度均大于1.5，峰形良好。而且，鹽酸沙格雷酯強(qiáng)制光降解樣品中檢出了遺傳毒性雜質(zhì)ⅴ、ⅵ，根據(jù)相關(guān)法規(guī)，這兩種遺傳毒性雜質(zhì)應(yīng)當(dāng)列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行監(jiān)控。

上述實施例證明：

本發(fā)明提供了兩種具有潛在遺傳毒性的雜質(zhì)ⅴ、ⅵ(具有環(huán)氧警示結(jié)構(gòu))，而且本申請的發(fā)明人在鹽酸沙格雷酯原料藥的強(qiáng)制光降解實驗中檢出了這兩種雜質(zhì)，進(jìn)一步的ames試驗顯示該兩種雜質(zhì)均為陽性，遺傳毒性風(fēng)險非常高。根據(jù)藥品中遺傳毒性雜質(zhì)的控制要求，這兩種遺傳毒性雜質(zhì)應(yīng)當(dāng)列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行監(jiān)控，本發(fā)明提供的遺傳毒性雜質(zhì)ⅴ、ⅵ可以在鹽酸沙格雷酯原料藥或制劑的質(zhì)量控制中用作雜質(zhì)對照品；

本發(fā)明提供的制備方法可以一次性制備得到雜質(zhì)ⅴ、ⅵ，純度大于98％；該制備方法還可以同時制備得到另外四種雜質(zhì)ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ，效率高；

本發(fā)明提供的檢測方法可以有效將雜質(zhì)遺傳毒性ⅴ、ⅵ與沙格雷酯、雜質(zhì)ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ分離，分離度均大于1.5，拖尾因子在規(guī)定范圍內(nèi)。