本發(fā)明涉及植物病害的生物防治，屬于植物保護學科中的生物防治研究與應用領域。具體涉及一種地衣芽孢桿菌w10的抗菌蛋白的氨基酸序列。

背景技術：

芽孢桿菌(bacillusspp.)作為一類重要的生防菌，可以產(chǎn)生各種抑菌抗菌物質(zhì)拮抗植物病原菌，具有防治植物病害的潛力，也是生物防治的主要來源。目前，許多科研人員對枯草芽孢桿菌(b.subtilis)以及其它芽孢桿菌的植物病原拮抗作用及其抗菌物質(zhì)的研究非常廣泛。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)防治植物病害，包括細菌素、細胞壁降解酶類、抗菌蛋白、脂肽類抗生素、聚酮類化合物和多肽類化合物等?？咕鞍资蔷哂锌拐婢钚缘拇蠓肿恿康鞍最愇镔|(zhì)，其氨基酸殘基通常在50個以上，分子量大于5kda。研究芽孢桿菌類生防細菌產(chǎn)生的抗菌蛋白，一方面可以進行發(fā)酵生產(chǎn)，形成生物農(nóng)藥用于防治植物病害，替代或減少化學農(nóng)藥使用；另一方面通過克隆抗菌蛋白編碼基因，構(gòu)建高效轉(zhuǎn)基因工程菌或多重功能工程菌，進行生產(chǎn)應用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了給研制新型生物農(nóng)藥提供基礎，豐富生物防治藥劑種類，提供一種抗菌蛋白的氨基酸序列，該抗菌蛋白具有較好的抑菌作用。

本發(fā)明報述的抗菌蛋白含有448個氨基酸殘基，分子量為48.794kda抗菌蛋白的氨基酸序列seqidno.1所示，如下：

本發(fā)明進一步公開了抗菌蛋白在防治植物病害中的應用。

該抗菌蛋白來自于一株地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)w10的代謝產(chǎn)物，可明顯抑制桃褐腐病菌及番茄灰霉病菌的生長，效果與化學農(nóng)藥相當?？蓮浹a桃褐腐病、番茄灰霉病等病害防控中缺乏的生物防治手段，該抗菌蛋白用于病害防控，可部分替代化學農(nóng)藥或與化學農(nóng)藥復配使用，在不影響防效的情況下能明顯減少化學農(nóng)藥使用，減少農(nóng)藥殘留和對環(huán)境造成的污染，同時也可延緩病菌產(chǎn)生抗藥性，有助于保證桃果、番茄等安全性，提升農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量。因此可以用該抗菌蛋白研發(fā)新型生物農(nóng)藥，用于桃褐腐病和番茄灰霉病的生物防治，特別是采后桃果防腐保鮮的應用。因此，該發(fā)明及其應用，不僅能夠用于防治病害，而且還能有利于增加綠色農(nóng)產(chǎn)品供給，推進農(nóng)業(yè)的綠色發(fā)展。

在生產(chǎn)中大量制備并應用抗菌蛋白有四種方式：一是菌株發(fā)酵，發(fā)酵液中含有抗菌蛋白，制成菌劑使用。二是菌株發(fā)酵后，研發(fā)抗菌蛋白提取生產(chǎn)工藝，制成抗菌蛋白產(chǎn)品，可用于田間防治和采后果蔬防腐處理。三是可以和化學農(nóng)藥復配使用，減少農(nóng)藥使用。我們也研究了蛋白與化學藥劑的復配增效作用，結(jié)果顯示，在兩者比例為1：1時，蛋白對化學藥劑腐霉利有增效作用，其ec50值(1.0416μg/ml)與腐霉利(1.2495μg/ml)相當。四是構(gòu)建抗菌蛋白的基因工程菌，使得抗菌蛋白大量表達，用于田間防治。也可以嘗試將該蛋白的基因轉(zhuǎn)入植物中，從而達到防病效果。

本發(fā)明的抗菌蛋白能有效抑制桃褐腐病菌、番茄灰霉病菌，效果與化學農(nóng)藥多菌靈相當，有防治這些病害的潛力。而且與化學藥劑相比，應用抗菌蛋白防治植物病害沒有環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題，也可用于采后農(nóng)產(chǎn)品特別是桃果的防腐保鮮。

附圖說明

圖1是粗蛋白sds-page電泳圖。m:marker1:粗蛋白。

圖2是提取的粗蛋白對桃褐腐病菌的拮抗效果。

圖3是提取的粗蛋白對番茄灰霉病菌的拮抗效果。

圖4是用hiprep16/60sephacryls-100highresolution純化柱經(jīng)aktapurifier系統(tǒng)純化粗蛋白的洗脫圖。

圖5是純化蛋白sds-page電泳圖。m：premixedproteinmarker(low)；1—5：峰ⅰ洗脫液；6—7：峰ⅱ洗脫液；8—10：峰ⅲ洗脫液。

圖6是純化后的蛋白對番茄灰霉病菌的拮抗效果。

圖7是包含抗菌蛋白基因的pcr擴增電泳圖。m:marker1-3:同一基因3個重復。

圖8是帶酶切位點抗菌蛋白基因pcr擴增電泳圖。m:marker1-3:同一基因3個重復。

圖9是菌株基因組雙酶切電泳圖。m:marker1-3:同一基因3個重復。

圖10是pet28a(+)雙酶切電泳圖。m:marker1-3:同一基因3個重復。

圖11是重組原核表達載體菌落pcr驗證電泳圖。m:marker1-3:同一基因3個重復。

圖12是重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖。m:marker1-3:同一基因3個重復。

圖13是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入bl21后抗菌蛋白基因擴增電泳圖。m:marker1-3:同一基因3個重復。

圖14是重組蛋白sds-page電泳圖。m:marker1:重組表達蛋白。

具體實施方式

(1)地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)w10(地衣芽孢桿菌w10及其抗菌蛋白對桃褐腐病的抑制作用。紀兆林，賀惠文等，園藝學報，2015，42(10):1879-1888)用nb培養(yǎng)液培養(yǎng)(28℃、180r/min)72h，4℃下8000g離心20min，上清液經(jīng)濾器(濾膜孔徑0.45μm)過濾，濾液用30％飽和度的硫酸銨鹽析，4℃過夜，收集沉淀，沉淀溶解在0.05mol/l、ph6.8的tris-hcl緩沖液中，透析袋(截留分子量為8.0kda)中透析48h(定時更換緩沖液)，再經(jīng)濾器(濾膜孔徑0.22μm)過濾，過濾得到的即為粗蛋白，蛋白經(jīng)10％sds-page分析，出現(xiàn)2條條帶(圖1)。將桃褐腐病菌、番茄灰霉病菌菌絲塊(直徑6mm)分別接在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(pda)平板中央，將50μl的tris-hcl緩沖液、粗蛋白分別接到離病原菌20mm的對稱位置。25℃培養(yǎng)48h觀察抑菌活性，如圖2-3所示，粗蛋白可明顯抑制桃褐腐病菌、番茄灰霉病菌的生長。

(2)配制0.2mnaoh、20％乙醇、1mmnaoh、0.05mol/l、ph6.8的tris-hcl緩沖液以及無菌水，用hiprep16/60sephacryls-100highresolution純化柱經(jīng)aktapurifier系統(tǒng)純化粗蛋白(圖4)，根據(jù)洗脫圖收集溶液。將分別收集的3個峰的溶液經(jīng)10％sds-page分析，如圖5所示，只有峰ⅰ的溶液顯示出一條與原來大小相似的條帶，并進行質(zhì)譜鑒定。將番茄灰霉病菌菌絲塊(直徑6mm)接在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(pda)平板中央，將50μl的tris-hcl緩沖液、峰ⅰ收集的溶液分別接到離病原菌20mm的對稱位置。25℃培養(yǎng)48h觀察抑菌活性，如圖6所示，峰ⅰ收集的溶液可明顯抑制番茄灰霉病菌的生長，這表明峰ⅰ收集得到的是抗菌蛋白。

(3)根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果mascot檢索的相似物，使用primer5.0設計特異性引物(up：5，-aatgccgttacagcccgctcat-3，(seqidno.2),down：5，-gtaagtgccattgtgattcctcc-3，(seqidno.)3)進行pcr擴增，得到一條1778bp的條帶(圖7)，并送生工測序，seqidno.6所示。

(4)根據(jù)獲得的全長序列使用dnaman進行分析，并結(jié)合載體pet-28a(+)的基因序列，設計分別帶ecori、xhoi酶切位點的特異性引物

(up：5，-aggaattcatgggaggaaaagtatatatg-3，(seqidno.4)，

down：5，-atactcgagaaaggttactctttcggcac-3，(seqidno.5))。以該菌株的基因組dna為模板，進行pcr擴增，得到一條1347bp的條帶(圖8)。

(5)在37℃下使用ecori、xhoi對基因組和載體pet-28a(+)進行雙酶切3h(圖9-10)，使用t4連接酶連接酶切產(chǎn)物，16℃過夜。

(6)將連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化到dh5α中，使用步驟4中設計的特異性引物進行pcr擴增驗證(圖11)，并酶切進一步驗證(圖12)。

(7)構(gòu)建重組分泌型表達質(zhì)粒，將步驟5中抗菌蛋白與載體pet-28a(+)的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(e.coli)bl21(de3)中，進行pcr擴增驗證(圖13)，并送生工測序。

(8)將重組菌株在la(含km)平板上劃線，37℃活化培養(yǎng)，后接入20mllb培養(yǎng)液(含km)中37℃條件下，180r/min過夜培養(yǎng)。以1：100接種于100mllb液體培養(yǎng)基(含km)中，37℃條件下，180r/min振蕩培養(yǎng)，od600達到0.6-0.8時，加入終濃度1.0mm的iptg，誘導培養(yǎng)2h。等分離心收集菌體細胞(4500r/min，10min，4℃)，加入1/10體積的pbs(ph＝6.5)，溶解菌體，將菌體懸浮液置于冰上，進行超聲波破碎(共5次，每次15s，間隔30s)，12000r/min，4℃下離心15min，回收上清，上清即為表達的重組蛋白，經(jīng)10％sds-page分析，如圖14所示，有一條與原來大小相似的條帶，并進行質(zhì)譜鑒定。

(9)使用dnaman軟件檢測步驟3測定的核苷酸序列的開放閱讀框，從而得到本抗菌蛋白的核苷酸序列，再使用dnaman軟件翻譯為氨基酸序列,如seqidno.1。根據(jù)得到的氨基酸序列，使用生物信息學軟件，對蛋白進行預測。利用protparam工具分析得知本抗菌蛋白含有448個氨基酸殘基，分子量為48.794kda。使用protscale程序分析得知本蛋白為親水性蛋白。使用tmhmm軟件得知不存在跨膜區(qū)。使用signalp軟件得知不存在信號肽。使用smart服務器搜索蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示含有peptidase_s8的保守功能域。

實施例2

在我們的室內(nèi)試驗中，結(jié)果表明，該抗菌蛋白在桃果上應用能較好的防治褐腐病，能明顯推遲病害發(fā)生，浸果處理能顯著降低桃果貯藏期的自然腐爛率，與化學農(nóng)藥多菌靈類似；且對桃果品質(zhì)沒有影響。另外，在小區(qū)試驗中，我們利用提取的粗蛋白噴霧防治番茄灰霉病葉片病害，以化學藥劑腐霉利為對照，藥后20d調(diào)查，抗菌蛋白防效(65.34％)好于腐霉利(45.29％)。

sequencelisting

<110>揚州大學

<120>一種地衣芽孢桿菌w10抗菌蛋白及應用

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<213>地衣芽孢桿菌bacilluslicheniformis

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