本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于細(xì)胞藥物精準(zhǔn)注射的顯微注射裝置及其操作方法。

背景技術(shù)：

腫瘤是危害人們健康的最重要問(wèn)題之一，目前世界上有1/3的人患有癌腫，然而有1/4的人死于癌腫。腫瘤疾病容易在它的病發(fā)區(qū)造成堵塞和壓迫，這些是由于腫瘤細(xì)胞過(guò)度增長(zhǎng)所引起的，這一點(diǎn)不管是良性的腫瘤還是惡性的腫瘤都很相似。常見(jiàn)的有堵塞食管、堵塞血管和壓迫神經(jīng)等。它會(huì)影響相鄰器官腫瘤疾病所在的器官或者組織，都會(huì)因腫瘤細(xì)胞破壞所在的結(jié)構(gòu)和功能：如肝癌由于肝細(xì)胞破壞和肝內(nèi)膽管阻塞，可經(jīng)起全身性黃疸，如果長(zhǎng)期的持續(xù)性的感染其他的疾病，會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞迅速惡化、擴(kuò)散，引起全身各器官都含有腫瘤細(xì)胞，此時(shí)，只要去刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，就會(huì)容易導(dǎo)致人死亡。然而，現(xiàn)在的外科手術(shù)的費(fèi)用高且具有侵襲性，也會(huì)帶來(lái)很多復(fù)雜的并發(fā)癥；并且，此類(lèi)手術(shù)的成功率比較低這些就限制了手術(shù)的治療。對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)藥物注射研究成為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)上亟需進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究。

細(xì)胞顯微注射技術(shù)又稱(chēng)顯微注射或細(xì)胞注射技術(shù)。細(xì)胞注射一般可直接對(duì)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核兩部分進(jìn)行注射。其操作過(guò)程是在顯微鏡下通過(guò)顯微注射工具將玻璃微針刺入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，以注射藥物的方式將藥物、dna、細(xì)胞核或蛋白質(zhì)等外源物質(zhì)注入細(xì)胞，并進(jìn)一步研究分析。細(xì)胞注射是顯微操作中最直接有效的研究方法，也是其他有待深入研究技術(shù)中的關(guān)鍵步驟。在腫瘤細(xì)胞分析、蛋白質(zhì)分析、藥物藥性分析、疾病診斷及免疫學(xué)等領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。

細(xì)胞注射主要有以下四個(gè)特點(diǎn)：一是注射時(shí)只需要微量的注射樣品，不需要制備大量高純度的外源注射物，而電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法需要大量的原代培養(yǎng)物，代價(jià)較高。二是細(xì)胞注射樣品多樣化，不受培養(yǎng)基或原代培養(yǎng)物的限制，可直接向細(xì)胞注射抗體、dna、酶及大分子合成物等。三是可以對(duì)細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行定量注射，直接地改變細(xì)胞個(gè)體的內(nèi)環(huán)境。四是相比于電融合、電穿孔等方法，細(xì)胞注射操作更安全簡(jiǎn)便，不需要額外的設(shè)備。

申請(qǐng)?zhí)枮?00410065016.7的發(fā)明專(zhuān)利公開(kāi)了一種細(xì)胞顯微注射儀，它包括細(xì)胞輸送器、細(xì)胞注射器、細(xì)胞吸持器以及數(shù)字化控制驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，在細(xì)胞注射時(shí)利用細(xì)胞輸送器，采用微流體輸送方法，以自動(dòng)送料的形式將細(xì)胞輸送到細(xì)胞輸送器、細(xì)胞注射器、細(xì)胞吸持器出口的匯聚區(qū)域。在注射過(guò)程中，細(xì)胞的輸送、吸持定位、注射針進(jìn)針進(jìn)行細(xì)胞膜穿刺、細(xì)胞內(nèi)藥液定量注射、注射針退出細(xì)胞、細(xì)胞釋放等顯微操作過(guò)程完全實(shí)現(xiàn)在計(jì)算機(jī)的同一操作界面上的計(jì)算機(jī)數(shù)字化控制，細(xì)胞吸持時(shí)吸持針保持固定，注射針以固定參數(shù)的單自由度伸縮運(yùn)動(dòng)完成細(xì)胞穿刺過(guò)程，操作簡(jiǎn)單、注射成功率高、可實(shí)現(xiàn)已注射和未注射的細(xì)胞自動(dòng)分離和自動(dòng)計(jì)數(shù)。該細(xì)胞顯微注射儀，全部使用機(jī)械方式控制及注射細(xì)胞，其存在的問(wèn)題有：細(xì)胞輸送器輸送微管道直徑固定，對(duì)于不同大小的細(xì)胞，較難保證細(xì)胞在輸送管道中會(huì)排列成直線(xiàn)向前輸送；細(xì)胞捕獲夾持采取機(jī)械控制，不能靈活移動(dòng)細(xì)胞，機(jī)械控制的方法極易損傷細(xì)胞，機(jī)械控制對(duì)于不同直徑的細(xì)胞存在無(wú)法穩(wěn)定夾持的問(wèn)題，設(shè)計(jì)的夾持裝置只能針對(duì)某一直徑的細(xì)胞夾持效果最好；該專(zhuān)利沒(méi)有說(shuō)明注射針的制作方法，對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行微量注射，注射液控制精讀要達(dá)到飛升量級(jí)，這對(duì)于常規(guī)的機(jī)械加工手段加工幾微米的針尖，精密的做出高精密的超細(xì)針尖是十分困難的；此外，該專(zhuān)利將細(xì)胞緊密裝在在細(xì)胞輸送器里面也存在困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明為了解決上述問(wèn)題，提供一種用于細(xì)胞藥物精準(zhǔn)注射的顯微注射裝置及其操作方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明一種用于細(xì)胞藥物精準(zhǔn)注射的顯微注射裝置，包括左升降臺(tái)和右升降臺(tái)，左升降臺(tái)上固定安裝有三維高精密的左位移臺(tái)，右升降臺(tái)上固定安裝有三維高精密的右位移臺(tái)，左升降臺(tái)的外側(cè)固定安裝有光源發(fā)射裝置，左升降臺(tái)上固定安裝有光鑷，右升降臺(tái)的外側(cè)設(shè)置注射器，右升降臺(tái)上固定安裝有光纖微針，左升降臺(tái)和右升降臺(tái)之間安裝有載物臺(tái)，載物臺(tái)的上方安裝有顯微鏡。

進(jìn)一步，左升降臺(tái)和右升降臺(tái)均為剪式折疊實(shí)驗(yàn)升降臺(tái)，左升降臺(tái)和右升降臺(tái)上分別固定安裝有左固定柱和右固定柱，左固定柱和右固定柱的中部開(kāi)設(shè)有與左位移臺(tái)和右位移臺(tái)相匹配的凹槽。

進(jìn)一步，左位移臺(tái)和右位移臺(tái)為電控三維高精密位移臺(tái)或者手動(dòng)液壓控制三維高精密位移臺(tái)，左位移臺(tái)和右位移臺(tái)的移動(dòng)控制光鑷與光纖微針的上下、左右、前后精密移動(dòng)。

進(jìn)一步，光纖微針為空心光纖微針。

進(jìn)一步，注射器為螺紋口注射器，前面連接螺紋座平頭針頭，針頭為25g，內(nèi)徑0.25mm，針頭插入空心光纖微針尾端，注射器上安裝微量注射泵，推動(dòng)控制注射器的微量注射。

進(jìn)一步，光鑷為物鏡構(gòu)成的空間光鑷或者尖端腐蝕的單模光纖光鑷，光鑷中耦合入徑向偏振光。

進(jìn)一步，光鑷為單模光纖與環(huán)形光纖焊接后在焊點(diǎn)拉錐而成的光鑷，環(huán)形光纖纖芯內(nèi)徑為20μm，外徑為23.2～26μm，僅有l(wèi)p01模和lp11模兩種簡(jiǎn)并模傳輸，環(huán)形光纖纖芯端面研磨制成光束匯聚的環(huán)形光纖光鑷，環(huán)形光纖光鑷中耦合入徑向偏振光。

一種用于細(xì)胞藥物精準(zhǔn)注射的顯微注射裝置的操作方法，包括如下步驟：

a、將培養(yǎng)液中的細(xì)胞滴加在載玻片上，載玻片固定在載物臺(tái)上，調(diào)節(jié)顯微鏡目鏡和物鏡的倍數(shù)，使顯微鏡能清晰看到細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

b、取1米環(huán)形光纖，環(huán)形光纖纖芯內(nèi)徑20μm，外徑25μm，單模光纖與環(huán)形光纖焊接后，在焊點(diǎn)拉錐，環(huán)形光纖中耦合入徑向偏振光，環(huán)形光纖芯端面利用裸光纖研磨技術(shù)，研磨制成光束匯聚的環(huán)形光纖徑向偏振光光鑷，將光鑷遠(yuǎn)離左位移臺(tái)的一端放置在載玻片上，細(xì)胞在載玻片上的培養(yǎng)液中處于懸浮狀態(tài)，開(kāi)啟光源發(fā)射裝置，當(dāng)載玻片接入光鑷后，游動(dòng)的細(xì)胞接近光鑷捕獲點(diǎn)時(shí)，會(huì)被光鑷控制住。

c、將精密實(shí)驗(yàn)升降臺(tái)調(diào)到與顯微鏡下邊緣的高度，使用微調(diào)調(diào)節(jié)旋鈕，使顯微鏡達(dá)到與載物臺(tái)等高的高度。

d、取涂覆層250μm，纖芯外徑125μm，內(nèi)徑62.5μm空心光纖1米，在空心光纖中部用刀片剝除涂覆層后，在氫氧焰光纖拉錐機(jī)上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)拉錐，用0745數(shù)碼顯微鏡在線(xiàn)測(cè)量錐區(qū)直徑，當(dāng)錐區(qū)直徑拉至15-20μm時(shí)停止一次拉錐，采用短時(shí)補(bǔ)拉方式將錐區(qū)二次拉錐至10μm，利用超聲波光纖切割法將錐區(qū)最細(xì)區(qū)域平整切斷，得到空心光纖微針。注射器中提前吸取藥物，旋上螺紋平頭針頭，將空心光纖微針插在注射針頭平口后，用紫外固化膠密封。

e、通過(guò)顯微鏡觀(guān)察，微調(diào)左右手動(dòng)液壓控制高精密三維位移臺(tái)，使得光纖微針刺入細(xì)胞。

f、設(shè)置微量注射泵參數(shù)，推動(dòng)注射器，使藥物注入細(xì)胞內(nèi)。

本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明用于細(xì)胞藥物精準(zhǔn)注射的顯微注射裝置，具有光鑷方法捕獲控制單細(xì)胞，對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)藥物注射功能，其精準(zhǔn)度高、可調(diào)性強(qiáng)，在腫瘤細(xì)胞精準(zhǔn)醫(yī)療實(shí)驗(yàn)研究、單細(xì)胞顯微注射藥物實(shí)驗(yàn)方法方面應(yīng)用前景廣闊。

2、本發(fā)明用于細(xì)胞藥物精準(zhǔn)注射的顯微注射裝置，是用光阱力捕獲控制懸浮細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷，細(xì)胞可進(jìn)行三維移動(dòng)，控制靈活，精度高；采用氫氧焰光纖拉錐機(jī)對(duì)空心光纖拉錐后的錐區(qū)直徑可以達(dá)到幾個(gè)微米，且各個(gè)尺寸都有，我們可以在錐區(qū)的不同位置進(jìn)行切割，得到不同直徑的空心光纖微針，增加了光纖微針的適用性；采用氫氧焰拉錐與超聲波聯(lián)合切割法制作的光纖微針具有精度高，尺寸可小至幾微米量級(jí)，是常用金屬微針的千分之一以上，注射液體控制可達(dá)飛升量級(jí)，其藥物注射效果是其他微針無(wú)法比擬的。在腫瘤細(xì)胞分析、蛋白質(zhì)分析、藥物藥性分析、疾病診斷及免疫學(xué)等領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說(shuō)明：

圖1為本發(fā)明用于細(xì)胞藥物精準(zhǔn)注射的顯微注射裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明光鑷與光纖微針聯(lián)合工作示意圖；

圖3為本發(fā)明光纖微針直徑與液滴注射體積示意圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

說(shuō)明書(shū)附圖中的附圖標(biāo)記包括：

升降臺(tái)1、三維高精密位移臺(tái)2、左位移臺(tái)2-1、右位移臺(tái)2-2、光纖微針3、注射器4、載物臺(tái)5、光鑷6、腫瘤細(xì)胞7、顯微鏡8、光源9。

如圖1、圖2所示的用于細(xì)胞藥物精準(zhǔn)注射的顯微注射裝置，左升降臺(tái)1和右升降臺(tái)1均為剪式折疊實(shí)驗(yàn)升降臺(tái)1，左升降臺(tái)1通過(guò)螺栓固定安裝左固定柱，右升降臺(tái)1通過(guò)螺栓固定安裝右固定柱，左固定柱和右固定柱的中部開(kāi)設(shè)與左位移臺(tái)2-1和右位移臺(tái)2-2相匹配的凹槽。手動(dòng)液壓控制三維高精密的左位移臺(tái)2-1和右位移臺(tái)2-2通過(guò)螺栓固定穿設(shè)在左固定柱和右固定柱中部的凹槽中，左升降臺(tái)1的左側(cè)固定安裝光源9發(fā)射裝置，左升降臺(tái)1上固定安裝光鑷6，光鑷6為單模光纖與環(huán)形光纖焊接后在焊點(diǎn)拉錐而成的環(huán)形光纖光鑷，環(huán)形光纖纖芯內(nèi)徑為20μm，外徑為23.2～26μm，僅有l(wèi)p01模和lp11模兩種簡(jiǎn)并模傳輸，環(huán)形光纖纖芯端面研磨制成光束匯聚的環(huán)形光纖光鑷6，環(huán)形光纖光鑷6中耦合入徑向偏振光，徑向偏振光環(huán)形光纖光鑷6的捕獲力很強(qiáng)，可以達(dá)到單獨(dú)抓細(xì)胞的能力。右升降臺(tái)1的右側(cè)設(shè)置注射器4，注射器4為螺紋口注射器4，前面連接螺紋座平頭針頭，針頭為25g，內(nèi)徑0.25mm，針頭插入空心光纖微針3尾端，注射器4上安裝微量注射泵，推動(dòng)控制注射器4的微量注射。右升降臺(tái)1上固定安裝光纖微針3，光纖微針3為空心光纖微針3。左位移臺(tái)2-1和右位移臺(tái)2-2的移動(dòng)控制光鑷6與光纖微針3的上下、左右、前后精密移動(dòng)。左升降臺(tái)1和右升降臺(tái)1之間安裝有載物臺(tái)5，載物臺(tái)5的上方安裝有顯微鏡8。

該用于細(xì)胞藥物精準(zhǔn)注射的顯微注射裝置工作時(shí)，通過(guò)左右位移臺(tái)2-2來(lái)調(diào)整光鑷6與光纖微針3的位置，實(shí)現(xiàn)光鑷6捕獲腫瘤細(xì)胞7后，與注射器4上平頭針頭連接的光纖微針3對(duì)細(xì)胞的精準(zhǔn)注射。

一種用于細(xì)胞藥物精準(zhǔn)注射的顯微注射裝置的操作方法，包括如下步驟：

a、將處于培養(yǎng)液中的腫瘤細(xì)胞7滴加在載玻片上，載玻片固定在載物臺(tái)5上。調(diào)節(jié)顯微鏡8目鏡和物鏡的倍數(shù)，使之能清晰的看到腫瘤細(xì)胞7的結(jié)構(gòu)。

b、取1米環(huán)形芯光纖，環(huán)形芯光纖纖芯內(nèi)徑20μm，外徑25μm，單模光纖與環(huán)形光纖焊接后，在焊點(diǎn)拉錐，環(huán)形芯光纖中耦合入徑向偏振光，僅lp01模和lp11模可在環(huán)形芯光纖中傳輸，環(huán)形芯端面利用裸光纖研磨技術(shù)，研磨制成光束匯聚的環(huán)形芯光纖徑向偏振光光鑷6。再將光鑷6端放置在載玻片上，細(xì)胞在載玻片上培養(yǎng)液中處于懸浮狀態(tài)，將光鑷6右端放置在載玻片上，細(xì)胞在載玻片上的培養(yǎng)液中處于懸浮狀態(tài)，開(kāi)啟光源9發(fā)射裝置，當(dāng)載玻片接入光鑷6后，游動(dòng)的細(xì)胞接近光鑷6捕獲點(diǎn)時(shí)，會(huì)被光鑷6控制住。

c、將精密實(shí)驗(yàn)升降臺(tái)1調(diào)到與顯微鏡8下邊緣的高度，使用微調(diào)調(diào)節(jié)旋鈕，使顯微鏡8達(dá)到與載物臺(tái)5等高的高度。

d、取涂覆層250μm，纖芯外徑125μm，內(nèi)徑62.5μm空心光纖1米，在空心光纖中部用刀片剝除涂覆層后，在氫氧焰光纖拉錐機(jī)上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)拉錐，用0745數(shù)碼顯微鏡8在線(xiàn)測(cè)量錐區(qū)直徑，當(dāng)錐區(qū)直徑拉至15-20μm時(shí)停止一次拉錐，采用短時(shí)補(bǔ)拉方式將錐區(qū)二次拉錐至10μm，利用超聲波光纖切割法將錐區(qū)最細(xì)區(qū)域平整切斷，得到空心光纖微針3。注射器4中提前吸取藥物，旋上螺紋平頭針頭，將空心光纖微針3插在注射針頭平口后，用紫外固化膠密封。

e、通過(guò)顯微鏡8觀(guān)察，微調(diào)左右手動(dòng)液壓控制高精密三維位移臺(tái)，使得光纖微針3刺入細(xì)胞。

f、設(shè)置微量注射泵參數(shù)，推動(dòng)注射器4，使藥物注入腫瘤細(xì)胞7內(nèi)。

圖3為光纖微針3直徑與液滴注射體積示意圖，采用氫氧焰光纖拉錐機(jī)對(duì)空心光纖拉錐后，在錐區(qū)的不同位置進(jìn)行切割，得到不同直徑的空心光纖微針3，隨著空心光纖微針3直徑的增大，單位時(shí)間藥物液滴的注射量也在增加。因此，可以根據(jù)不同使用者的單位時(shí)間藥物量需求以及腫瘤細(xì)胞7的多少來(lái)調(diào)整空心光纖微針3的直徑。

通過(guò)本發(fā)明用于細(xì)胞藥物精準(zhǔn)注射的顯微注射裝置操作方法制備的光纖微針3，空心光纖微針3的直徑尺寸可小至幾微米量級(jí)，是常用金屬微針的千分之一以上，注射液體控制可達(dá)飛升量級(jí)，其藥物注射效果是其他微針無(wú)法比擬的。并且通過(guò)在環(huán)形光纖光鑷6中耦合入徑向偏振光，徑向偏振光環(huán)形光纖光鑷6的定位和捕獲力很強(qiáng)，基本可以達(dá)到單獨(dú)抓細(xì)胞的能力。通過(guò)徑向偏振光環(huán)形光纖光鑷6的定位和光纖微針3的配合，能夠?qū)⑺幬锞珳?zhǔn)的注射到腫瘤細(xì)胞7中，并且能夠降低藥物的使用量。

最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。