本發(fā)明涉及蒺藜苜蓿轉(zhuǎn)錄因子hd-zipiii基因家族的mtrevoluta基因在調(diào)控小葉片數(shù)目和葉莖比中的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

豆科牧草苜蓿是世界上栽培最早，分布最廣，也是最為重要的一種多年生優(yōu)質(zhì)牧草。但是，國(guó)產(chǎn)苜蓿產(chǎn)量少、品質(zhì)差、貨源不穩(wěn)定，這已成為限制我國(guó)草食畜牧業(yè)和奶業(yè)發(fā)展的一個(gè)不可忽視的因素。目前我國(guó)苜蓿的商業(yè)生產(chǎn)正在迅速增長(zhǎng)，但由于國(guó)內(nèi)對(duì)高質(zhì)量苜蓿日益增長(zhǎng)的巨大需求，國(guó)產(chǎn)苜蓿的短缺情況并沒(méi)有得到緩解。因此苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)改良是我國(guó)草業(yè)、畜牧業(yè)和奶業(yè)發(fā)展的重大迫切需求。

苜蓿是以收獲葉、莖為主的牧草，葉對(duì)苜蓿產(chǎn)草量的貢獻(xiàn)率最多可達(dá)60％。葉片不僅是苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量構(gòu)成和品種特性的重要指標(biāo)，更是栽培管理及病蟲(chóng)害監(jiān)測(cè)的主要研究對(duì)象。在苜蓿品質(zhì)評(píng)價(jià)體系中，葉莖比(葉片與莖稈重量的比值)是其中一個(gè)重要的指標(biāo)。苜蓿70％的蛋白質(zhì)儲(chǔ)藏于葉片中，而且葉片纖維含量?jī)H為莖稈的1/3。因此葉莖比值越大，苜蓿的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值就越高，適口性就越好，同時(shí)利用價(jià)值也就相對(duì)越高。苜蓿多葉性狀目前已被作為一種形態(tài)學(xué)標(biāo)記，被認(rèn)為具有高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的潛力。選育葉量豐富、葉莖比高的苜蓿新品種一直是育種工作者追求的目標(biāo)。

植物的葉發(fā)育模式分為單葉和復(fù)葉。單葉結(jié)構(gòu)指得是在一個(gè)葉柄上只有一個(gè)小葉片，而復(fù)葉結(jié)構(gòu)指得是在一個(gè)葉柄上有多個(gè)小葉片生成。蒺藜苜蓿的葉為復(fù)葉結(jié)構(gòu)，包括三個(gè)小葉片。苜蓿的多葉性狀是由多基因控制的，其產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程而且同時(shí)受環(huán)境和基因兩方面的影響。到目前為止，只有少數(shù)多葉苜蓿品種被商業(yè)化。這些品種中大部分植株具有多葉性狀，但植株個(gè)體多葉頻率高低不均：有的植株僅數(shù)個(gè)復(fù)葉為多葉型，多數(shù)復(fù)葉仍為三出復(fù)葉；也有植株不同枝條上混雜出現(xiàn)多葉型復(fù)葉和三出復(fù)葉，而多葉頻率高的植株則非常少見(jiàn)。這些缺陷導(dǎo)致現(xiàn)有的多葉型苜蓿品種在生產(chǎn)性能方面并未表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。

因此，基于以上原因，對(duì)苜蓿復(fù)葉發(fā)育分子機(jī)制進(jìn)行研究，通過(guò)基因工程直接提高苜蓿小葉片數(shù)量可為苜蓿優(yōu)質(zhì)新品系的分子設(shè)計(jì)改良和育種提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)手段，有助于高效、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的苜蓿新品種的培育。

同源域亮氨酸拉鏈第三類(lèi)基因家族(classiiihomeodomain-leucinezipper，hd-zipiii)在葉片極性建立過(guò)程中起關(guān)鍵作用。目前尚未見(jiàn)到有關(guān)于蒺藜苜蓿hd-zipiii基因家族成員mtrevoluta基因在復(fù)葉物種中調(diào)控小葉片數(shù)目和葉莖比的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，針對(duì)現(xiàn)有多葉苜蓿品種多葉頻率不高的問(wèn)題，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種調(diào)控豆科植物小葉數(shù)目和葉莖比的基因，并提供了一種敲除該基因以獲得可提高小葉片數(shù)目和葉莖比的轉(zhuǎn)基因豆科植物的方法。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明首次分離得到了蒺藜苜蓿hd-zipiii基因家族成員mtrevoluta基因的敲除突變體株系，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，該基因參與了調(diào)控豆科植物的小葉片數(shù)目和葉莖比，并可通過(guò)敲除該基因的方式以得到小葉片數(shù)目和葉莖比高于野生型植株的轉(zhuǎn)基因豆科植物。

所述mtrevoluta基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

所述豆科植物，優(yōu)選苜蓿、蒺藜苜蓿、三葉草。

本發(fā)明利用特異性引物(核苷酸序列如seqidno.2和seqidno.3所示)，通過(guò)rt-pcr技術(shù)從蒺藜苜蓿中克隆mtrevoluta基因；利用構(gòu)建的突變體群體，篩選出了mtrevoluta基因的敲除突變體株系，發(fā)現(xiàn)植株的小葉片數(shù)目由三個(gè)變?yōu)樗膫€(gè)或五個(gè)(多達(dá)81.5％的葉片的小葉片數(shù)目得到了提高)，這一數(shù)據(jù)遠(yuǎn)高于目前現(xiàn)有的多葉苜蓿品種(約40％)，同時(shí)葉莖比顯著提高(提高了約11％)，這證明，該基因參與了調(diào)控豆科植物的小葉片數(shù)目和葉莖比，敲除該基因，可以得到小葉片數(shù)目和葉莖比高于野生型植株的轉(zhuǎn)基因豆科植物，可顯著提高小葉片數(shù)目和葉莖比，預(yù)示本發(fā)明實(shí)施后將會(huì)創(chuàng)造新型豆科牧草植物，可用于后續(xù)的牧草品質(zhì)，對(duì)我國(guó)草業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。

附圖說(shuō)明

圖1：蒺藜苜蓿mtrevoluta基因的克隆和表達(dá)分析，其中，a.mtrevoluta的基因結(jié)構(gòu)，方框代表外顯子，實(shí)線(xiàn)代表內(nèi)含子；tnt1插入在第六個(gè)外顯子區(qū)域。b-i.蒺藜苜蓿mtrevoluta基因的表達(dá)分析；通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子：gus轉(zhuǎn)基因植株的染色，表明mtrevoluta基因在頂芽、葉片、葉柄、莖、花、果莢、根尖和種皮中都有表達(dá)。

圖2：蒺藜苜蓿mtrevoluta基因突變體的鑒定，其中，a.基因組pcr擴(kuò)增野生型和突變體的mtrevoluta序列，表明突變體基因中插入了一個(gè)5.3kb的tnt1序列。b.qrt-pcr檢測(cè)mtrevoluta的表達(dá)水平，表明在突變體中mtrevoluta的表達(dá)水平顯著下降。

圖3：蒺藜苜蓿mtrevoluta基因突變體的小葉數(shù)量和葉莖比統(tǒng)計(jì)，其中，a.野生型的復(fù)葉結(jié)構(gòu)，包括三個(gè)小葉片。b-c.mtrevoluta突變體的的復(fù)葉結(jié)構(gòu)，包括四個(gè)或五個(gè)小葉片。d.野生型和mtrevoluta突變體不同數(shù)目小葉片的百分比統(tǒng)計(jì)。e.野生型和mtrevoluta突變體的葉莖比統(tǒng)計(jì)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。

下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無(wú)特別說(shuō)明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過(guò)正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等，若無(wú)特別說(shuō)明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等。

實(shí)施例1克隆蒺藜苜?；騧trevoluta

1.蒺藜苜蓿mtrevoluta基因的克隆

通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站ncbi獲得擬南芥revoluta的序列，然后利用blast進(jìn)行序列比對(duì)搜索，獲得mtrevoluta的基因組序列。根據(jù)序列設(shè)計(jì)seqidno.2和seqidno.3所示的引物。利用trizol試劑盒提取蒺藜苜蓿rna，rt-pcr方法擴(kuò)增mtrevoluta基因的全長(zhǎng)cds序列。利用gateway技術(shù)將基因序列連入pearleygate201載體，然后進(jìn)行序列測(cè)定，驗(yàn)證克隆序列的正確性。

2.蒺藜苜蓿mtrevoluta基因的序列信息與特性分析

mtrev1基因的編碼區(qū)cds為2520bp，包含18個(gè)外顯子和17個(gè)內(nèi)含子，編碼839個(gè)氨基酸，包含有保守的hd-zip，mekhla和start脂結(jié)合區(qū)域(圖1a)。

蒺藜苜蓿mtrevoluta基因的表達(dá)分析

mtrevoluta啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus表達(dá)：為了定位mtrevoluta基因表達(dá)的精細(xì)部位，將mtrevoluta啟動(dòng)子區(qū)域2.1kb的片段構(gòu)建到phgwfs7。通過(guò)農(nóng)桿菌eha105轉(zhuǎn)化蒺藜苜蓿，最后篩選獲得mtrevoluta啟動(dòng)子：gus的轉(zhuǎn)基因植株。gus染色分析發(fā)現(xiàn)，mtrevoluta在葉芽、成年葉、葉柄、莖、花、莢果以及正在萌發(fā)的種子的根尖中均有較強(qiáng)表達(dá)(圖1b-i)。

實(shí)施例2蒺藜苜蓿mtrevoluta突變體的獲得和鑒定

利用thermalasymmetricinterlaced-pcr(tail-pcr)技術(shù)，篩選了蒺藜苜蓿tnt1標(biāo)記的突變體庫(kù)，在22000個(gè)突變體株系中篩選出tnt1插入到mtrevoluta基因中的突變體株系(圖2a)。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，tnt1插入到mtrevoluta基因的第六個(gè)外顯子，導(dǎo)致該基因表達(dá)水平顯著下降(圖2b)。

實(shí)施例3蒺藜苜蓿mtrevoluta突變體的小葉數(shù)量統(tǒng)計(jì)

對(duì)突變體的表型進(jìn)行分析，結(jié)果表明，敲除mtrevoluta突變體的小葉片數(shù)目顯著增多。野生型的復(fù)葉中包括三個(gè)小葉片，而突變體中約81.5％(n＝300)的復(fù)葉中包含有4個(gè)或5個(gè)小葉片(圖3a-d)。進(jìn)一步分析表明，突變體的葉莖比與野生型相比，提高了約11％(n＝10)(圖3e)。

序列表

<110>山東大學(xué)

<120>revoluta基因在調(diào)控豆科植物小葉片數(shù)目和葉莖比中的應(yīng)用

<141>2017-08-08

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4380

<212>dna

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