本發(fā)明涉及水生動(dòng)物病原微生物檢測，尤其是涉及一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測對蝦白斑綜合癥病毒的方法。

背景介紹

對蝦白斑綜合癥(whitespotsyndromevirusdisease)是一類嚴(yán)重的對蝦傳染性疫病，因部分瀕死對蝦的頭胸甲部位出現(xiàn)白色斑點(diǎn)，而得名。然而，亦有部分蝦體變紅，而不出現(xiàn)白斑。對蝦白斑綜合癥的病原是對蝦白斑綜合癥病毒(whitespotsyndromevirus，wssv)，該病原不僅可感染對蝦，如斑節(jié)對蝦penaeusmonodon，日本囊對蝦marsupenaeusjaponicas和凡納濱對蝦litopenaeusvannamei等，也在其他淡水和海水的甲殼動(dòng)物中檢測和發(fā)現(xiàn)，如蟹類和小龍蝦等(loetal,1996.whitespotsyndromebaculovirus(wsbv)detectedinculturedandcapturedshrimp,crabsandotherarthropods.diseasesofaquaticorganisms,27:215-225)。斑節(jié)對蝦和日本囊對蝦的整個(gè)生活史不同階段均可受該病毒感染，在3～10d對蝦死亡率可高達(dá)100％，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。例如，1993年，中國發(fā)生對蝦白斑綜合癥流行，導(dǎo)致當(dāng)年對蝦產(chǎn)量下降70％，引起全球水產(chǎn)業(yè)的高度關(guān)注。目前，在全球范圍內(nèi)，野生和養(yǎng)殖的對蝦中均有報(bào)道檢測到wssv，該病已然成為一種全球范圍內(nèi)的對蝦疫病。因此，國際獸疫局(officeinternationaldesepizooties,oie)將其列為必須申報(bào)的疫病，2008年中國農(nóng)業(yè)部也將其列為一類動(dòng)物疫病(第1125號公告)。此外，該病不僅嚴(yán)重威脅著甲殼動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)，也給海洋生態(tài)造成一定的破壞。目前，對蝦白斑綜合癥病毒的檢測方法，主要有組織切片、免疫分析、雜交和pcr等。其中，巢式pcr是oie所認(rèn)可的對蝦白斑綜合癥病毒檢測方法(http://www.oie.int/en/),該方法可以特異性檢測出對蝦白斑綜合癥病毒，且靈敏度高。然而，該方法需要控溫精確價(jià)格高昂的pcr儀、電泳設(shè)備以及具有較強(qiáng)專業(yè)知識(shí)的技術(shù)人員，限制了其在對蝦養(yǎng)殖過程中的推廣應(yīng)用。為了有效防控該疫病，需要開發(fā)儀器成本更低廉，且使用更方便的wssv檢測方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是日本學(xué)者notomi等(notomietal.2000.loop-mediatedisothermalamplificationofdna.nucleicacidsresearch,28(12):e63)首先提出的一種恒溫條件下快速核酸擴(kuò)增的新技術(shù)。該技術(shù)的工作原理：在60～65℃時(shí)，雙鏈dna處于變性和延伸性的動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)，任何一個(gè)引物向雙鏈dna的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)被解離，變成單鏈?；耍ㄟ^設(shè)計(jì)針對靶基因不同區(qū)域的4條特異性引物，在具有鏈置換活性dna聚合酶(如bst、gsp等)作用下，在恒溫條件下(60～65℃)進(jìn)行鏈置換反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)1h內(nèi)對靶核酸序列超過10⁹倍的擴(kuò)增效果。由于lamp是對同一段dna鏈上互補(bǔ)序列的周而復(fù)始擴(kuò)增，故形成多種長短不一的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和花椰菜樣結(jié)構(gòu)的dna混合物，所以，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖呈階梯條帶狀。同時(shí)，在lamp陽性反應(yīng)過程中，隨著核酸的大量形成，其副產(chǎn)物焦磷酸根可與反應(yīng)液中的鎂離子形成焦磷酸鎂(白色沉淀)，離心后，肉眼可觀察到白色沉淀(morietal,“real-timeturbidimetryoflampreactionforquantifyingtemplatedna,”journalofbiochemicalandbiophysicalmethods,2004，59(2):145-157)。此外，由于lamp陽性反應(yīng)產(chǎn)物為大量dna，故可通過添加與核酸結(jié)合的熒光染料，在紫外光下可觀察到顏色變化(gotoetal,colorimetricdetectionofloop-mediatedisothermalamplificationreactionbyusinghydroxynaphtholblue[j].biotechniques,2009，46(3):167-172)。lamp方法的主要優(yōu)點(diǎn)是在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸序列的特異性擴(kuò)增，因而無須控溫精確、價(jià)格高昂的pcr儀或熱循環(huán)儀。此外，因?yàn)槠鋵怂釘U(kuò)增的效率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便和快捷等，所以，具有良好的野外適應(yīng)性，在資源有限的基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核酸檢測的應(yīng)用前景。近年該方法已被廣泛應(yīng)用于病原微生物、轉(zhuǎn)基因相關(guān)檢測和胚胎性別鑒定等核酸診斷領(lǐng)域。

目前，在白斑綜合癥病毒檢測中已有l(wèi)amp技術(shù)的應(yīng)用的報(bào)道，例如馮華等和何琳等利用wssv的保守囊膜蛋白vp28基因?yàn)榘行蛄?，建立lamp檢測技術(shù)，通過開管添加sybrgreeni染料再進(jìn)行熒光顯色，以檢測靶基因的擴(kuò)增情況(馮華等，對蝦白斑綜合癥病毒lamp檢測方法的建立，中國獸醫(yī)科學(xué)，2011，41(7)：707-711；何琳等,白斑綜合征病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測方法的建立，水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2010，34(4)：598-603)。有關(guān)對蝦白斑綜合癥病毒的專利有兩個(gè)，即：黃倢等“對蝦白斑綜合癥病毒核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測試劑及檢測方法”的專利，該專利以白斑綜合征病毒的保守基因?yàn)榘谢?，建立lamp檢測技術(shù)，通過反應(yīng)后添加genefinder^tm以檢測靶基因的擴(kuò)增情況(中華人民共和國國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局，發(fā)明專利申請?zhí)?00810139949.4；公開號：cn10372714a)；謝芝勛等“檢測對蝦白斑綜合癥病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物及其應(yīng)用”，該專利以對蝦白斑綜合片病毒基因組保守區(qū)orf120序列設(shè)計(jì)引物，主要通過鈣黃綠素：氯化錳作為顯色劑，建立可視化wssv-lamp檢測方法。上述對蝦白斑綜合癥病毒的lamp檢測方法，涉及反應(yīng)后額外添加試劑，或陰陽性反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)液的色差變化不大等問題，可能導(dǎo)致結(jié)果判讀的困難或者誤判。有研究報(bào)道，在核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)過程中，伴隨著靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物的積累過程中，也產(chǎn)生了大量的[h⁺]，使反應(yīng)體系ph下降(tanneretal,2015.visualdetectionofisothermalnucleicacidamplificationusingph-sensitivedyes.biotechniques,2015,58(2):59-68)，因此可利用ph敏感的指示劑以判斷l(xiāng)amp反應(yīng)是否發(fā)生。目前，尚未見ph指示劑應(yīng)用于對蝦白斑綜合癥病毒的lamp檢測的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測對蝦白斑綜合癥病毒的方法。

本發(fā)明包括以下步驟：

1)基因組提?。?/p>

在步驟1)中，所述基因組提取的具體方法可為：

采用gb/t28630.2-2012提供的方法進(jìn)行基因組提取、對蝦白斑綜合癥病毒(wssv)pcr檢測試劑盒的方法或采用其他商品化試劑盒提取基因組dna；

所述采用gb/t28630.2-2012提供的方法進(jìn)行基因組提取的具體方法如下：采集對蝦的肌肉、鰓和肝胰腺等組織約100mg，加入300μlctab溶液研磨勻漿，后轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，再加入450μlctab溶液充分混勻，于25℃靜置2h，再加入600μl酚-三氯甲烷-異戊醇到組織樣品中，充分混勻，12000r/min，離心5min，吸取上清至新的1.5ml離心管中，加入700μl酚-三氯甲烷-異戊醇到組織樣品中，充分混勻，12000r/min，離心5min；吸取上清于新的1.5ml離心管中，加入900μl預(yù)冷的無水乙醇(-20℃)，混勻并靜置，并于-20℃放置8h以上，12000r/min，離心30min，棄去上清，將離心管倒置在吸水紙上，37℃干燥20min，加入10μl超純水，作為dna模板；

所述采用對蝦白斑綜合癥病毒(wssv)pcr檢測試劑盒提取基因組dna的具體方法可采用廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司，mbk-001的方法；

所述采用其他商品化試劑盒提取基因組dna的具體方法可采用天根生化科技有限公司或generay公司提取基因組dna的方法。

2)制備陽性對照；

在步驟2)中，所述制備陽性對照的方法可為：

以陽性wssv的dna為模板，以f3和b3為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr反應(yīng)體系(20μl)：2×gotaq@greenmastermix(promega)10μl，引物各0.5μl，模板各1.0μl，超純水8μl，反應(yīng)程序：94℃1min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，共32個(gè)循環(huán)；72℃10min。產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)過膠回收后，連接進(jìn)行pmd18t載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，測序驗(yàn)證，提取陽性質(zhì)粒作為陽性對照，-20℃保存，備用。

3)制備陰性對照：超純水；

4)樣品檢測及結(jié)果判定。

在步驟4)中，所述樣品檢測及結(jié)果判定的具體方法可為：取基因組dna1μl加入到lamp反應(yīng)體系中，在63℃60min，95℃3min后，通過以下方式判定結(jié)果：肉眼觀察，若lamp反應(yīng)體系顏色與陽性對照相近，變成黃色(除no.2指示劑為酒紅色)則為陽性反應(yīng)，表明待檢測樣品含有wssv；若lamp反應(yīng)體系顏色與陰性對照相近，即保持反應(yīng)體系原有的顏色(no.1指示劑為軍綠色，no.2指示劑橙黃色，no.3指示劑為紅色)則為陰性反應(yīng)，表明待檢樣品中沒有wssv。備選：瓊脂糖凝膠電泳：2％瓊脂糖凝膠中120v電壓下，電泳40min，eb染色或sybrgreeni染色后，在紫外燈下觀察到大小不一的條帶狀產(chǎn)物，即為陽性反應(yīng)，反之，沒有條帶狀產(chǎn)物，為陰性反應(yīng)；所述lamp反應(yīng)體系為緩沖液體系，體積5～50μl，以25μl反應(yīng)體系為例：10×buffer(80～120μm(nh4)2so4，300～700μmkcl，60～120μmmgso4，0.1％～1.5％tween-20或triton-100)2.5μl，外引物f3和b3各0.5μl，內(nèi)引物fip和bip各4μl，4×dntps(20～100mm)1.4μl，模板2μl，超純水8.1μl，bstdna合成酶1μl，染料1μl，1mkoh調(diào)整體系ph為7.5～9.5；反應(yīng)程序?yàn)?0℃5min，63℃60min，95℃3min。

本發(fā)明提供了一組檢測對蝦白斑綜合癥病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組合，包括外引物和內(nèi)引物，所述外引物為f3和b3，所述內(nèi)引物為fip和bip，對蝦白斑綜合癥病毒(whitespotsyndromevirus,wssv)引物序列如表1所示。不同引物的最適用量比：外引物︰內(nèi)引物為1︰(6～8)；引物濃度范圍：1～50μm，最適濃度為10μm。

表1

三種指示劑的配方及其用量范圍參見表2。

表2

本發(fā)明根據(jù)對蝦白斑綜合癥病毒囊膜基因的保守序列，設(shè)計(jì)了lamp引物，建立lamp反應(yīng)體系，并通過在lamp反應(yīng)中添加不同的ph指示劑，以達(dá)到通過肉眼觀察顏色變化判定靶基因被有效擴(kuò)增的目的。

閉管式可視化快速檢測對蝦白斑綜合癥病毒的方法，因?yàn)榉磻?yīng)產(chǎn)物無須通過電泳和/或添加入熒光染料等鑒定，降低了lamp產(chǎn)物的污染風(fēng)險(xiǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例lamp反應(yīng)后，不同指示劑的顏色變化情況。在圖1中，1，2為指示劑1；3，4為指示劑2；5，6為指示劑3；1，3，5為陽性反應(yīng)結(jié)果；2，4，6為陰性反應(yīng)結(jié)果。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例lamp反應(yīng)后的凝膠電泳結(jié)果。加樣同圖1。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例的靈敏度檢測結(jié)果。在圖3中，以指示劑3為例，1～5分別是10倍稀釋的基因組模板，6為陰性對照，結(jié)果顯示：最低檢測深度為40copies/μl

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：新型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對樣品的檢測

1、基因組提?。?/p>

(1)采用gb/t28630.2-2012提供的方法進(jìn)行基因組提?。壕唧w操作如下：

采集對蝦的肌肉、鰓和肝胰腺等組織約100mg，加入300μlctab溶液研磨勻漿，后轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，再加入450μlctab溶液充分混勻，于25℃靜置2h。加入600μl酚-三氯甲烷-異戊醇到組織樣品中，充分混勻，12000r/min，離心5min。吸取上清至新的1.5ml離心管中，加入700μl酚-三氯甲烷-異戊醇到組織樣品中，充分混勻，12000r/min，離心5min。吸取上清于新的1.5ml離心管中，加入900μl預(yù)冷的無水乙醇(-20℃)，混勻并靜置，并于-20℃放置8h以上。12000r/min，離心30min，棄去上清，將離心管倒置在吸水紙上，37℃干燥20min。加入10μl超純水，作為dna模板。

(2)對蝦白斑綜合癥病毒(wssv)pcr檢測試劑盒(廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司，mbk-001)的方法，提取基因組dna。

(3)利用其他商品化試劑盒(天根生化科技有限公司，或generay公司)提取基因組dna。

置于-20℃保存，備用。

2、陽性對照的制備：以陽性wssv的dna為模板，以f3和b3為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)體系(20μl)：2×gotaq@greenmastermix(promega)10μl，引物各0.5μl，模板各1.0μl，超純水8μl。反應(yīng)程序：94℃1min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，共32個(gè)循環(huán)；72℃10min。產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)過膠回收后，連接進(jìn)行pmd18t載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，測序驗(yàn)證，提取陽性質(zhì)粒作為陽性對照，-20℃保存，備用。

3、陰性對照制備：超純水。

4、樣品檢測及結(jié)果判定：取基因組dna1μl加入到lamp反應(yīng)體系中，在63℃60min，95℃3min后，通過以下方式判定結(jié)果：肉眼觀察。若lamp反應(yīng)體系顏色與陽性對照相近，變成淡黃色(除no.2指示劑為酒紅)則為陽性反應(yīng)，表明待檢測樣品含有wssv；若lamp反應(yīng)體系顏色與陰性對照相近，即保持反應(yīng)體系原有的顏色(no.1指示劑為軍綠色，no.2指示劑橙黃色，no.3指示劑為紅色)則為陰性反應(yīng)，表明待檢樣品中沒有wssv(參見圖1)。備選：瓊脂糖凝膠電泳：2％瓊脂糖凝膠中120v電壓下，電泳40min，eb染色或sybrgreeni染色后，在紫外燈下觀察到大小不一的條帶狀產(chǎn)物，即為陽性反應(yīng)，反之，沒有條帶狀產(chǎn)物，為陰性反應(yīng)(參見圖2)。

實(shí)施例2：對蝦白斑綜合癥病毒的閉管式可視化的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的特異性

以pcr檢測為陽性的樣本30份和陰性的樣本20份(對蝦白斑綜合癥病毒(wssv)pcr檢測試劑盒，廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司提供；和gb/t28630.2-2012檢測結(jié)果一致)，相應(yīng)的對蝦組織總dna為模板；或副溶血弧菌(vibrioparahemolyticus)、嗜水氣單胞菌(aeromonashydrophila，b11、b14和b48)、維氏氣單胞菌(a.veronii)、豚鼠氣單胞菌(a.caviae)、2株金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、綠膿桿菌(pseudomonasaeruginosa)和肺炎克雷伯氏桿菌(klebsiellapneumoniae)的基因組為模板，利用優(yōu)化的lamp反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，以實(shí)施例一所制備的陰性和陽性對照為參比。通過實(shí)施例一中的肉眼觀察變化和電泳檢測以判斷所檢測樣品的結(jié)果。結(jié)果顯示，僅30份wssv陽性標(biāo)本的檢測結(jié)果為陽性，其余均為陰性結(jié)果，與預(yù)期結(jié)果相同，即表明該方法特異性強(qiáng)。

實(shí)施例3：對蝦白斑綜合癥病毒的閉管式可視化的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的靈敏度

以對蝦白斑綜合癥病毒陽性質(zhì)粒為模板，進(jìn)行10倍比稀釋，模板中靶基因的拷貝數(shù)為4×10⁶、4×10³、4×10²、4×10¹、4×10⁰(copy/μl)，和陰性對照，同時(shí)采用優(yōu)化的lamp反應(yīng)體系及程序進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)，反應(yīng)體系為10μl。通過實(shí)施例一中的肉眼觀察變化和電泳檢測以判斷所檢測樣品的結(jié)果。結(jié)果顯示，靶基因拷貝數(shù)大于或等于4.18×10¹(copy/μl)的模板，檢測結(jié)果均為陽性，4×10⁰(copy/μl)偶爾出現(xiàn)陽性結(jié)果，陰性對照的結(jié)果均呈現(xiàn)為陰性反應(yīng)，說明該方法的靈敏度為40(copy/μl)(參見圖3)。

本發(fā)明的wssv-lamp檢測技術(shù)的優(yōu)勢：

1)本發(fā)明在lamp反應(yīng)起始到結(jié)果判斷定均在完全閉管狀態(tài)，無需開管檢測反應(yīng)產(chǎn)物。

2)本發(fā)明提供了多種優(yōu)選的指示劑，其陽性和陰性反應(yīng)結(jié)果的顏色差異大，難以發(fā)生結(jié)果誤判。

3)本發(fā)明根據(jù)gb/t28630.2-2012的wssv保守序列設(shè)計(jì)lamp引物，與國標(biāo)pcr檢測方法的結(jié)果符合率高。

4)本發(fā)明的檢測方法特異性強(qiáng)：對副溶血弧菌、綠膿桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞、豚鼠氣單胞菌等多種病原，均無陽性擴(kuò)增結(jié)果。

5)靈敏度高，基因組dna最低檢出率為40copies/μl。

6)該方法結(jié)合簡易的基因組核酸提取技術(shù)，具有良好野外及資源有限的基層實(shí)驗(yàn)室檢測應(yīng)用的前景。

序列表

<110>集美大學(xué)

<120>一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測對蝦白斑綜合癥病毒的方法

<130>2017-06-19

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>對蝦白斑病毒（whitespotsyndromevirus）

<400>1

ctatcaggccaacaagct18

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>對蝦白斑綜合癥病毒(whitespotsyndromevirus)

<400>2

tgacaataacgtcgaggtt19

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<212>dna

<213>對蝦白斑綜合癥病毒(whitespotsyndromevirus,wssv

<400>3

ggagggaagatcctgttactctagatattagtgacaaacattacgtgatg50

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<211>42

<212>dna

<213>對蝦白斑綜合癥病毒(whitespotsyndromevirus)

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tggactgaaatgagaatgaactcccatgccagagttggagag42