本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以人adh2*2基因143位點(diǎn)gg型為模板的陽性參考品，該陽性參考品用于驗(yàn)證adh2*2基因型檢測試劑盒在應(yīng)用于樣本檢測時樣本是否為陽性的輔助判斷。

背景技術(shù)：

質(zhì)控品是指用于體外診斷的質(zhì)量控制物質(zhì)，其具有已知濃度含量的目標(biāo)檢測物，為使人們確信某一產(chǎn)品或服務(wù)質(zhì)量能滿足規(guī)定的質(zhì)量要求所必須的產(chǎn)品。質(zhì)控品的使用目的是為了驗(yàn)證整個pcr反應(yīng)過程具有準(zhǔn)確性、有效性和特異性，并監(jiān)控檢測系統(tǒng)的狀態(tài)。儀器在正式投入使用后，應(yīng)定期對其校準(zhǔn)，避免由于儀器原因?qū)е碌膶?shí)驗(yàn)偏差。再次，在收到每批新試劑后，應(yīng)首先對其進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確證新試劑質(zhì)量后，再用于對臨床標(biāo)本的檢測。

但是據(jù)申請人了解，目前在檢測人adh2*2基因143位點(diǎn)gg型質(zhì)量控制方面沒有陽性參考品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種以人adh2*2基因143位點(diǎn)gg型為模板的陽性參考品，用于驗(yàn)證被檢樣本中是否含有人adh2*2基因143位點(diǎn)gg型這一檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確，解決了人adh2*2基因的質(zhì)量檢測問題。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種以人adh2*2基因143位點(diǎn)gg型為模板的陽性參考品，該陽性參考品是一種以堿基序列為主要成分的試劑，該堿基序列包含人adh2*2基因片段，所述人adh2*2基因片段為5’-tcttttctgaatctgaacagcttctctttattctgtagatggtggctgtaggaatctgtcgcacagatgaccacgtggttagtggcaacctggtgaccccccttcctgtgattttaggccatgaggcagccggcatcgtggagagtgttggagaaggggt-3’，其中，帶有下劃線的堿基位點(diǎn)是人adh2*2基因的143位點(diǎn)，所述143位點(diǎn)用于表征人adh2*2基因的gg型可突變?yōu)槿薬dh2*2基因的aa型的位置。

上述技術(shù)方案中的有關(guān)內(nèi)容解釋如下：

1、上述方案中，所述陽性參考品中還含有緩沖試劑，該緩沖試劑選自ph7.6的tris-hcl緩沖液或ph7.6的te緩沖液。

2、上述方案中，所述陽性參考品中含有的人adh2*2基因序列是構(gòu)建到質(zhì)粒載體上保存，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)即可得到，質(zhì)粒構(gòu)建過程如下：

引物設(shè)計——pcr擴(kuò)增——割膠回收dna片段——構(gòu)建載體——轉(zhuǎn)化培養(yǎng)——陽性克隆鑒定——37℃搖床培養(yǎng)——質(zhì)粒抽提——測序確認(rèn)堿基序列。

抽提后的質(zhì)粒再配制成所述陽性參考品，配制方法如下：

（1）配制稀釋液：加入50%配方量的純化水→加入tris-hcl緩沖液（ph7.6）→加入剩余的純化水（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得0.002mol/l的tris-hcl（ph7.6）稀釋液；

（2）人adh2*2基因143位點(diǎn)gg純合載體質(zhì)粒預(yù)稀釋：加入50%配方量的所述稀釋液→加入人adh2*2基因143位點(diǎn)gg純合載體質(zhì)粒溶液→加入剩余的所述稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到x拷貝/微升人adh2*2基因143位點(diǎn)gg純合質(zhì)粒溶液（x代表質(zhì)粒濃度的具體數(shù)值）；

（3）得到gg型陽性參考品：加入50%配方量的稀釋液→加入x拷貝/微升人adh2*2基因143位點(diǎn)gg純合質(zhì)粒溶液→加入剩余的稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到gg型陽性參考品。

本發(fā)明的特點(diǎn)以及有益效果是：所述陽性參考品實(shí)質(zhì)是事先設(shè)計好的、當(dāng)做已知濃度及堿基序列的樣本，和其他被檢樣本（即人全血）一起利用相關(guān)的adh2*2基因型檢測試劑盒進(jìn)行檢測，從而驗(yàn)證被檢樣本檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。也就是說，在利用adh2*2基因型檢測試劑盒檢測被檢樣本時，本發(fā)明的陽性參考品相當(dāng)于是一種已知濃度的陽性樣本，用于驗(yàn)證adh2*2基因型檢測試劑盒的檢測結(jié)果是否真實(shí)、有效，解決了人adh2*2基因的質(zhì)量檢測問題。

附圖說明

附圖1為人adh2*2基因的143位點(diǎn)為gg型時的熒光定量pcr擴(kuò)增熔解曲線圖，橫坐標(biāo)是溫度，縱坐標(biāo)是熒光微分值；

附圖2為人adh2*2基因的143位點(diǎn)為aa型時的熒光定量pcr擴(kuò)增熔解曲線圖，橫坐標(biāo)是溫度，縱坐標(biāo)是熒光微分值；

附圖3為人adh2*2基因的143位點(diǎn)為ag型時的熒光定量pcr擴(kuò)增熔解曲線圖，橫坐標(biāo)是溫度，縱坐標(biāo)是熒光微分值；

附圖4為空白對照時的熒光定量pcr擴(kuò)增熔解曲線圖，橫坐標(biāo)是溫度，縱坐標(biāo)是熒光微分值。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實(shí)施例：一種以人adh2*2基因143位點(diǎn)gg型為模板的陽性參考品

gg型陽性參考品是一種以堿基序列為主要成分的試劑，該堿基序列包含人adh2*2基因片段，所述人adh2*2基因片段為5’-tcttttctgaatctgaacagcttctctttattctgtagatggtggctgtaggaatctgtcgcacagatgaccacgtggttagtggcaacctggtgaccccccttcctgtgattttaggccatgaggcagccggcatcgtggagagtgttggagaaggggt-3’（如seqno:4所示），其中，帶有下劃線的堿基位點(diǎn)是人adh2*2基因的143位點(diǎn)，所述143位點(diǎn)用于表征人adh2*2基因的gg型可突變?yōu)槿薬dh2*2基因的aa型的位置。所述gg型陽性參考品中還含有緩沖試劑，該緩沖試劑為ph為7.6的tris-hcl緩沖液。

aa型陽性參考品是一種以堿基序列為主要成分的試劑，該堿基序列包含人adh2*2基因片段，所述人adh2*2基因片段為5’-tcttttctgaatctgaacagcttctctttattctgtagatggtggctgtaggaatctgtcacacagatgaccacgtggttagtggcaacctggtgaccccccttcctgtgattttaggccatgaggcagccggcatcgtggagagtgttggagaaggggt-3’（如seqno:5所示），其中，帶有下劃線的堿基位點(diǎn)是人adh2*2基因的143位點(diǎn)，所述143位點(diǎn)用于表征人adh2*2基因的aa型可突變?yōu)槿薬dh2*2基因的gg型的位置。所述aa型陽性參考品中還含有緩沖試劑，該緩沖試劑選自ph7.6的tris-hcl緩沖液或ph7.6的te緩沖液。

ag型陽性參考品是通過所述gg型陽性參考品與aa型陽性參考品按等體積混合配制而成。所述gg型陽性參考品中含有g(shù)g純合型dna序列的濃度為500拷貝/微升，所述aa型陽性參考品中含有aa純合型dna序列的濃度為500拷貝/微升，那么，所述ag型陽性參考品中含有g(shù)g純合型dna序列和aa純合型dna序列的濃度均為500拷貝/微升。

所述gg型陽性參考品、aa型陽性參考品以及ag型陽性參考品作為adh2*2基因型檢測試劑盒中的一部分。

在本實(shí)施例中，adh2*2基因型檢測試劑盒包括koddna聚合酶、上游引物、下游引物、特異性靶向熒光探針、gg型陽性參考品、aa型陽性參考品以及ga型陽性參考品；

所述上游引物為針對人adh2*2基因設(shè)計的上游引物，上游引物的序列為5’-ccttctccaacactctccacgatgc-3’（如seqno:1所示）；

所述下游引物為針對人adh2*2基因設(shè)計的下游引物，下游引物的序列為5’-gaatctgaacagcttctctttattctgtaga-3’（如seqno:2所示）；

所述特異性靶向熒光探針是帶有人adh2*2基因的特異性配對序列的探針，其堿基序列為5’-tctgtcgcacagatgaccac-3’（如seqno:3所示），熒光染料為氟硼二吡咯。

所述adh2*2基因型檢測試劑盒還包括陽性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品是一種以堿基序列為主要成分的試劑，所述堿基序列是通過所述gg型陽性參考品與aa型陽性參考品按等體積混合配制而成，所述陽性質(zhì)控品含有g(shù)g純合型dna序列和aa純合型dna序列的濃度均為1000拷貝/微升。

所述陽性質(zhì)控品是事先設(shè)計好的、當(dāng)做已知濃度及堿基序列的樣本，和其他被檢樣本一起進(jìn)行檢測，它作為試劑盒的一部分，與其他試劑配套使用，用于用戶驗(yàn)證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在實(shí)際生產(chǎn)中，所述adh2*2基因型檢測試劑盒可以做成包含下列組分的試劑盒：

（1）聚合酶試劑[kodmix]：由koddna聚合酶、dntp等組成，規(guī)格為140μl×2支、140μl×4支或140μl×6支；

（2）引物?探針試劑[adh2*2mix]：即由上游引物、下游引物以及特異性靶向熒光探針組成的混合試劑，規(guī)格為140μl×1支、140μl×2支或140μl×3支；

（3）gg型陽性參考品、aa型陽性參考品以及ag型陽性參考品，規(guī)格均為100μl×1支；

（4）陽性質(zhì)控品，規(guī)格為150μl×1支。

其中，gg型陽性參考品、aa型陽性參考品以及ag型陽性參考品中的dna序列均是構(gòu)建到載體質(zhì)粒上保存，原始質(zhì)粒購置于生工生物工程（上海）股份有限公司，載體質(zhì)粒構(gòu)建過程屬于現(xiàn)有技術(shù)，具體過程如下：

引物設(shè)計——pcr擴(kuò)增——割膠回收dna片段——構(gòu)建載體——轉(zhuǎn)化培養(yǎng)——陽性克隆鑒定——37℃搖床培養(yǎng)——質(zhì)粒抽提——測序確認(rèn)堿基序列。

抽提后的質(zhì)粒再配制成所述gg型陽性參考品，配制方法如下：

（1）配制稀釋液：加入50%配方量的純化水→加入tris-hcl緩沖液（ph7.6）→加入剩余的純化水（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得0.002mol/l的tris-hcl（ph7.6）稀釋液；

（2）人adh2*2基因143位點(diǎn)gg純合載體質(zhì)粒預(yù)稀釋：加入50%配方量的所述稀釋液→加入人adh2*2基因143位點(diǎn)gg純合載體質(zhì)粒溶液→加入剩余的所述稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到x拷貝/微升人adh2*2基因143位點(diǎn)gg純合質(zhì)粒溶液（x代表質(zhì)粒濃度的具體數(shù)值）；

（3）得到gg型陽性參考品：加入50%配方量的稀釋液→加入x拷貝/微升人adh2*2基因143位點(diǎn)gg純合質(zhì)粒溶液→加入剩余的稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到gg型陽性參考品。

抽提后的質(zhì)粒再配制成所述aa型陽性參考品，配制方法如下：

（1）配制稀釋液：加入50%配方量的純化水→加入tris-hcl緩沖液（ph7.6）→加入剩余的純化水（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得0.002mol/l的tris-hcl（ph7.6）稀釋液；

（2）人adh2*2基因143位點(diǎn)aa純合載體質(zhì)粒預(yù)稀釋：加入50%配方量的所述稀釋液→加入人adh2*2基因143位點(diǎn)aa純合載體質(zhì)粒溶液→加入剩余的所述稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到x拷貝/微升人adh2*2基因143位點(diǎn)aa純合質(zhì)粒溶液（x代表質(zhì)粒濃度的具體數(shù)值）；

（3）得到aa型陽性參考品：加入50%配方量的稀釋液→加入x拷貝/微升人adh2*2基因143位點(diǎn)aa純合質(zhì)粒溶液→加入剩余的稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到aa型陽性參考品。

adh2*2基因型檢測方法包括以下步驟：

第一步，準(zhǔn)備被檢樣本，以被檢樣本作為檢測的對象，被檢樣本為人全血；用樣本溶解液把采集的人全血稀釋25倍后，作為所述被檢樣本；其中，所述樣本溶解液是由緩沖液和純化水組成，緩沖液與純化水的體積比為1：99，緩沖液為ph7.6的tris-hcl緩沖液；

第二步，以所述被檢樣本為模板基因鏈，利用所述試劑盒進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)，熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為：

上游引物0.1μmol/l，1.4至2.8μl；

下游引物0.1μmol/l，1.4至2.8μl；

特異性靶向熒光探針0.1μmol/l，1.0至2.0μl；

mgcl2*6h2o0.35g/l，1.4至2.8μl；

dntps0.02mm，0.4至0.8μl；

koddna聚合酶0.02u/μl，0.4至0.8μl；

kodbuffer3.2至6.4μl；

模板4至8μl；

在上述熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系中，在各組分的使用濃度不變的前提下，各組分的體積用量最多可為上述數(shù)值的2倍，即上游引物的所用體積為2.8μl，下游引物的所用體積為2.8μl，特異性靶向熒光探針的所用體積為2.0μl，mgcl2*6h2o的所用體積為2.8μl，dntps的所用體積為0.8μl，koddna聚合酶的所用體積為0.8μl，kodbuffer的所用體積為6.4μl，模板的所用體積為8μl；

所述熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)過程如下：

（1）94.0℃預(yù)變性30.0秒，

（2）97.0℃變性1.0秒，

（3）60.0℃退火3.0秒，

（4）63.0℃延伸5.0秒，其中，步驟（2）~（4）循環(huán)50次；

第三步，用高分辨率熔解曲線法進(jìn)行檢出，檢出條件依次為：

（1）94.0℃，30.0秒，

（2）39.0℃，30.0秒，

（3）40.0~75.0℃，0.09℃/秒；

直接在全自動基因分析儀genecube（生產(chǎn)商為toyobo）上進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)和檢測。具體步驟為：將被檢樣本4μl、聚合酶試劑[kodmix]4μl、引物?探針試劑[adh2*2mix]5.2μl混合后，調(diào)制成反應(yīng)液。專用吸管吸取反應(yīng)液到專用塑料毛細(xì)管中。進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。進(jìn)行檢出，測定波長為510nm~550nm的熒光值。測定的熒光值由專用分析軟件解析，轉(zhuǎn)換成表示熒光變化量的熒光微分值。解析熒光微分值，在顯示屏上顯示測定結(jié)果。

第四步，檢出結(jié)果通過陽性判斷值來判斷，陽性判斷值的三種結(jié)果的判斷依據(jù)為：

（1）adh2*2基因的143位點(diǎn)為gg純合子：熒光微分值≥10，并且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在61.5℃~65.5℃之間，參見附圖1所示；

（2）adh2*2基因的143位點(diǎn)為aa純合子：熒光微分值≥10，并且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在54℃~58.5℃之間，參見附圖2所示；

（3）adh2*2基因的143位點(diǎn)為ag雜合子：有2個熔解曲線峰，其中一個熔解曲線峰的熒光微分值≥10且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在54℃~58.5℃之間，另一個熔解曲線峰的熒光微分值≥10且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在61.5℃～65.5℃之間，參見附圖3所示。

所述熒光微分值是指對檢測到的目標(biāo)物的熒光強(qiáng)度隨溫度變化的值做微分求導(dǎo)，得到熒光微分值。

在上述實(shí)施例中，所述gg型陽性參考品中含有g(shù)g純合型dna序列的濃度、aa型陽性參考品中含有aa純合型dna序列的濃度以及ag型陽性參考品中含有g(shù)g純合型dna序列和aa純合型dna序列的濃度均為500拷貝/微升，在該濃度下實(shí)施效果最好，但在本領(lǐng)域內(nèi)上述陽性參考品中dna序列的濃度在500~5000拷貝/微升范圍內(nèi)都可以實(shí)施。同理，陽性質(zhì)控品含有g(shù)g純合型dna序列和aa純合型dna序列的濃度在500~5000拷貝/微升范圍內(nèi)都可以實(shí)施。另外，在對人全血進(jìn)行稀釋時，上述實(shí)施例是以稀釋25倍為例，在本領(lǐng)域?qū)嶋H操作中，用樣本溶解液把采集的人全血稀釋10~50倍作為被檢樣本都可以實(shí)施。

上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>踏石生物科技（蘇州）有限公司

<120>以人adh2*2基因143位點(diǎn)gg型為模板的陽性參考品

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