本發(fā)明涉及天然高分子技術領域，具體地說，是兩種具有免疫調節(jié)的鐵皮石斛葉多糖的制備方法及其應用。

背景技術：

鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛的干燥莖，因表皮呈鐵綠色而得名。鐵皮石斛作為一種價值極高的珍貴傳統(tǒng)中藥材，具有生津養(yǎng)胃、退熱潤肺等滋補功效，素有“千金草”之稱。2015版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定鐵皮石解的莖作為藥用部位，葉為非藥用部位。鐵皮石斛的莖通常加工成干品，如鐵皮楓斗、鐵皮石斛功能性飲料等；另外，鐵皮石斛的鮮莖可直接食用，或燉湯，或泡茶，或浸酒。然而，鐵皮石斛葉常作為廢棄物，被焚燒或當肥料，造成了嚴重的資源浪費。最近幾年人們發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛葉對高血壓，高血糖，高血脂等癥狀有較好的輔助療效，并作為保健茶飲用。因此，我們有必要對鐵皮石斛葉資源進行深入研究并合理利用。

鐵皮石斛主要含有多糖類、生物堿類，研究表明，多糖與鐵皮石斛的藥理活性，如提高機體免疫，抗氧化，抗腫瘤，抗衰老等密切相關。目前，人們對鐵皮石斛多糖的研究幾乎全部集中在莖部，對鐵皮石斛葉的研究報道卻較少。

中國專利文獻cn104740335a、cn104740336a公開了一種具有降尿酸、降壓作用的鐵皮石斛葉提取物，通過以下方法制備得到：鐵皮石斛葉洗凈、干燥后，機械粉碎，用體積百分比濃度為0～30％的乙醇溶液回流提取1～3次，每次1～3h，每次用量分別為藥材重量的5～20倍，合并濾液，回收乙醇，減壓濃縮得鐵皮石斛葉提取物。中國專利文獻cn105534831a公開了一種具有保濕功效的鐵皮石斛葉提取物，由如下步驟的方法制備得到：s1.將鐵皮石斛葉以1g:5～20ml的料液比加水回流提取1～5次，每次20～180min，得鐵皮石斛葉水提液；s2.將鐵皮石斛葉水提液濃縮，然后加入乙醇，使鐵皮石斛葉水提液中的乙醇體積濃度達到50％～90％，沉淀8～36h，離心取沉淀即得。中國專利文獻cn106581441a公開了一種鐵皮石斛葉提取物的制備方法，將新鮮的鐵皮石斛葉經(jīng)過初步篩選去除雜質之后洗凈；將干凈的鐵皮石斛葉進行粉碎；將鐵皮石斛葉按固液比6-10倍加入溶劑中，進行微波處理48-60小時，后將處理過的溶液加熱回流，加熱2-3小時，回流提取，收集濾液，減壓濃縮得鐵皮石斛葉提取物。但是關于本發(fā)明的兩種具有免疫調節(jié)的鐵皮石斛葉多糖的制備方法及其應用目前還未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供兩種具有免疫調節(jié)的鐵皮石斛葉多糖。

本發(fā)明的再一的目的是，提供兩種具有免疫調節(jié)的鐵皮石斛葉多糖的制備方法。

本發(fā)明的另一的目的是，提供兩種具有免疫調節(jié)的鐵皮石斛葉多糖的用途。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是：一種鐵皮石斛葉多糖，所述的鐵皮石斛葉多糖由以下步驟的制備方法制得：

(1)將干燥鐵皮石斛葉研磨、粉碎、過20目篩，隨后向鐵皮石斛葉粉末加入5倍量的石油醚，攪拌使充分接觸，靜置2h，棄上層石油醚，重復操作3次，最后將石油醚減壓揮干，得鐵皮石斛葉脫脂粉末；加水，鐵皮石斛葉脫脂粉末按照料液比1:30，70℃提取2h，得水提液，60℃減壓濃縮，得濃縮液；

(2)向濃縮液加入3倍體積的sevage試劑，所述的sevage試劑為氯仿:正丁醇＝3:1，劇烈振蕩30min，4000rpm離心20min，取上清，重復操作5次；隨后60℃減壓濃縮除去有機試劑并將溶液濃縮；

(3)向濃縮液加入3倍體積的85％乙醇，室溫下靜置48h沉淀多糖，4000rpm、20min、4℃離心收集沉淀；將沉淀物溶解于蒸餾水中，冷凍干燥得粗多糖；

(4)取粗多糖0.2g，配置成濃度為100mg/ml的溶液，上樣量為2ml，經(jīng)deae-52纖維素離子交換柱分離，依次用濃度為0、0.05、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6mol/lnacl，溶液洗脫，自動部分收集器收集，流速為1ml/min，4min每管；收集第3-15管，合并后經(jīng)濃縮、透析、冷凍干燥得多糖a-1；

(5)多糖a-1配置成濃度為100mg/ml的溶液，上樣量為2ml，經(jīng)sephadexg-100柱分離，用0.1mol/lnacl溶液洗脫，自動部分收集器收集，流速為1ml/min，4min每管；采用苯酚-硫酸法檢測，收集第9-14管，合并后經(jīng)濃縮、透析、冷凍干燥得鐵皮石斛葉多糖。

進一步地，所述的鐵皮石斛葉多糖平均相對分子量為28342da，主要由摩爾比為3.21:1.11:0.23的半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖組成，以及痕量的木糖、葡萄糖和甘露糖。

進一步地，所述的鐵皮石斛葉多糖的紫外圖譜如附圖9所示，紅外圖譜如附圖10所示。

另一種鐵皮石斛葉多糖，所述的鐵皮石斛葉多糖由以下步驟的制備方法制得：

(1)將干燥鐵皮石斛葉研磨、粉碎、過20目篩，隨后向鐵皮石斛葉粉末加入5倍量的石油醚，攪拌使充分接觸，靜置2h，棄上層石油醚，重復操作3次，最后將石油醚減壓揮干，得鐵皮石斛葉脫脂粉末；加水，鐵皮石斛葉脫脂粉末按照料液比1:30，70℃提取2h，得水提液，60℃減壓濃縮，得濃縮液；

(2)向濃縮液加入3倍體積的sevage試劑，所述的sevage試劑為氯仿:正丁醇＝3:1，劇烈振蕩30min，4000rpm離心20min，取上清，重復操作5次；隨后60℃減壓濃縮除去有機試劑并將溶液濃縮；

(3)向濃縮液加入3倍體積的85％乙醇，室溫下靜置48h沉淀多糖，4000rpm、20min、4℃離心收集沉淀；將沉淀物溶解于蒸餾水中，冷凍干燥得粗多糖；

(4)取粗多糖0.2g，配置成濃度為100mg/ml的溶液，上樣量為2ml，經(jīng)deae-52纖維素離子交換柱分離，依次用濃度為0、0.05、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6mol/lnacl，溶液洗脫，自動部分收集器收集，流速為1ml/min，4min每管；收集第66-71管，合并后經(jīng)濃縮、透析、冷凍干燥得多糖a-2；

(5)多糖a-2配置成濃度為100mg/ml的溶液，上樣量為2ml，經(jīng)sephadexg-100柱分離，用0.1mol/lnacl溶液洗脫，自動部分收集器收集，流速為1ml/min，4min每管；采用苯酚-硫酸法檢測，收集第14-19管，合并后經(jīng)濃縮、透析、冷凍干燥得鐵皮石斛葉多糖。

進一步地，所述的鐵皮石斛葉多糖平均相對分子量為41143da，主要由摩爾比為3.23:1.02的葡萄糖和半乳糖組成，以及痕量的木糖和阿拉伯糖。

進一步地，所述的鐵皮石斛葉多糖的紫外圖譜如附圖9所示，紅外圖譜如附圖10所示。

為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：一種鐵皮石斛葉多糖的制備方法，所述的制備方法包括以下步驟：(1)鐵皮石斛葉經(jīng)粉碎機器粉碎，再過20目篩得到鐵皮石斛葉粉末；(2)鐵皮石斛葉粉末經(jīng)石油醚浸泡脫脂得到脫脂鐵皮石斛葉粉末；(3)脫脂鐵皮石斛葉粉末水提得到鐵皮石斛葉水提液；(4)鐵皮石斛葉水提液經(jīng)sevage法除蛋白，85％乙醇沉淀，最后冷凍干燥獲得粗多糖；(5)粗多糖經(jīng)陰離子交換柱層析得到洗脫液；(6)第(5)步的洗脫液濃縮、透析、冷凍干燥獲得多糖a-1；(7)多糖a-1經(jīng)凝膠柱層析得到洗脫液；(8)第(7)步的洗脫液濃縮、透析、冷凍干燥得到鐵皮石斛葉多糖。

另一種鐵皮石斛葉多糖的制備方法，所述的制備方法包括以下步驟：(1)鐵皮石斛葉經(jīng)粉碎機器粉碎，再過20目篩得到鐵皮石斛葉粉末；(2)鐵皮石斛葉粉末經(jīng)石油醚浸泡脫脂得到脫脂鐵皮石斛葉粉末；(3)脫脂鐵皮石斛葉粉末水提得到鐵皮石斛葉水提液；(4)鐵皮石斛葉水提液經(jīng)sevage法除蛋白，85％乙醇沉淀，最后冷凍干燥獲得粗多糖；(5)粗多糖經(jīng)陰離子交換柱層析得到洗脫液；(6)第(5)步的洗脫液濃縮、透析、冷凍干燥獲得多糖a-2；(7)多糖a-2經(jīng)凝膠柱層析得到洗脫液；(8)第(7)步的洗脫液濃縮、透析、冷凍干燥得到鐵皮石斛葉多糖。

為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：所述的鐵皮石斛葉多糖在制備免疫調節(jié)劑中的應用。

進一步地，所述的免疫調節(jié)劑促進巨噬細胞的吞噬作用。

進一步地，所述的免疫調節(jié)劑增加巨噬細胞的一氧化氮的產(chǎn)生量。

所述的鐵皮石斛葉多糖在制備抗腫瘤藥物中的應用。

本發(fā)明優(yōu)點在于：

1、本發(fā)明首次從鐵皮石斛葉中分離出兩種多糖，分別測定其平均相對分子量，分析其單糖組成并確定其具體的活性用途。

2、鐵皮石斛葉多糖a-11，a-22，經(jīng)gpc測定，a-11，a-22的平均相對分子量分別為28342da和41143da。經(jīng)gc-ms分析，a-11主要由半乳糖，阿拉伯糖和鼠李糖組成，摩爾比為3.21:1.11:0.23，還發(fā)現(xiàn)痕量的木糖，葡萄糖和甘露糖；a-22主要由葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為3.23:1.02，還發(fā)現(xiàn)痕量的木糖，阿拉伯糖。

3、鐵皮石斛葉多糖a-11，a-22都可顯著促進巨噬細胞raw264.7吞噬中性紅的能力，a-11在5-500μg/ml濃度范圍內，a-22在50-800μg/ml濃度范圍內，與對照組相比都有顯著性差異(p<0.05)，并且a-11促進巨噬細胞raw264.7吞噬中性紅的能力明顯強于a-22。另外鐵皮石斛葉多糖a-11，a-22都可顯著促進巨噬細胞raw264.7產(chǎn)生no，a-11在125-500μg/ml濃度范圍內，a-22在大于400μg/ml濃度范圍內，與lps對照組相比都有顯著性差異(p<0.05)，并且a-11促進巨噬細胞raw264.7產(chǎn)生no的能力明顯強于a-22。

附圖說明

附圖1：鐵皮石斛葉多糖的提取流程圖。

附圖2：鐵皮石斛葉多糖a的deae-52柱洗脫曲線。

附圖3：鐵皮石斛葉多糖a-1的sephadexg-100柱洗脫曲線。

附圖4：鐵皮石斛葉多糖a-2的sephadexg-100柱洗脫曲線。

附圖5：鐵皮石斛葉多糖紫外分光圖譜。

附圖6：鐵皮石斛葉多糖紅外分光圖譜。

附圖7：鐵皮石斛葉多糖a-11對巨噬細胞raw264.7吞噬中性紅的影響圖。

附圖8：鐵皮石斛葉多糖a-22對巨噬細胞raw264.7吞噬中性紅的影響圖。

附圖9：鐵皮石斛葉多糖a-11對巨噬細胞raw264.7產(chǎn)生no的影響圖。

附圖10：鐵皮石斛葉多糖a-22對巨噬細胞raw264.7產(chǎn)生no的影響圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。

實施例1鐵皮石斛葉多糖a-11的制備

將干燥鐵皮石斛葉研磨、粉碎、過20目篩，隨后向鐵皮石斛葉粉末加入石油醚(料液比為1:5)，攪拌使之與石油醚充分接觸，靜置2h，棄上層石油醚，重復上述操作3次，最后將石油醚減壓揮干，得鐵皮石斛葉脫脂粉末。加水，鐵皮石斛葉脫脂粉末按照料液比1:30，70℃提取2h，得水提液，60℃減壓濃縮，得濃縮液。

利用sevage法除蛋白，向濃縮液加入3倍體積的sevage試劑(氯仿:正丁醇＝3:1)，劇烈振蕩30min，4000rpm離心20min，取上清，重復上述操作5次。隨后60℃減壓濃縮除去有機試劑并將溶液濃縮。

向濃縮液加入3倍體積的85％乙醇，室溫下靜置48h沉淀多糖，4000rpm、20min、4℃離心收集沉淀。將沉淀物溶解于蒸餾水中，冷凍干燥得粗多糖。

取上述粗多糖0.2g，配置成濃度為100mg/ml的溶液，上樣量為2ml，經(jīng)deae-52纖維素離子交換柱分離，依次用濃度為0、0.05、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6mol/lnacl，溶液洗脫，自動部分收集器收集，流速為1ml/min，4min每管；采用苯酚-硫酸法檢測，以試管號為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線，收集第3-15管，合并后經(jīng)濃縮、透析、冷凍干燥得多糖a-1。

上述多糖a-1配置成濃度為100mg/ml的溶液，上樣量為2ml，經(jīng)sephadexg-100柱分離，用0.1mol/lnacl溶液洗脫，自動部分收集器收集，流速為1ml/min，4min每管；采用苯酚-硫酸法檢測，以試管號為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線，收集第9-14管，合并后經(jīng)濃縮、透析、冷凍干燥得鐵皮石斛葉多糖a-11。

實施例2鐵皮石斛葉多糖a-22的制備

將干燥鐵皮石斛葉研磨、粉碎、過20目篩，隨后向鐵皮石斛葉粉末加入石油醚(料液比為1:5)，攪拌使之與石油醚充分接觸，靜置2h，棄上層石油醚，重復上述操作3次，最后將石油醚減壓揮干，得鐵皮石斛葉脫脂粉末。加水，鐵皮石斛葉脫脂粉末按照料液比1:30，70℃提取2h，得水提液，60℃減壓濃縮，得濃縮液。

利用sevage法除蛋白，向濃縮液加入3倍體積的sevage試劑(氯仿:正丁醇＝3:1)，劇烈振蕩30min，4000rpm離心20min，取上清，重復上述操作5次。隨后60℃減壓濃縮除去有機試劑并將溶液濃縮。

向濃縮液加入3倍體積的85％乙醇，室溫下靜置48h沉淀多糖，4000rpm、20min、4℃離心收集沉淀。將沉淀物溶解于蒸餾水中，冷凍干燥得粗多糖。

取上述粗多糖0.2g，配置成濃度為100mg/ml的溶液，上樣量為2ml，經(jīng)deae-52纖維素離子交換柱分離，依次用濃度為0、0.05、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6mol/lnacl，溶液洗脫，自動部分收集器收集，流速為1ml/min，4min每管；采用苯酚-硫酸法檢測，以試管號為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線，收集第66-71管，合并后經(jīng)濃縮、透析、冷凍干燥得多糖a-2。

多糖a-2配置成濃度為100mg/ml的溶液，上樣量為2ml，經(jīng)sephadexg-100柱分離，用0.1mol/lnacl溶液洗脫，自動部分收集器收集，流速為1ml/min，4min每管；采用苯酚-硫酸法檢測，以試管號為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線，收集第14-19管，合并后經(jīng)濃縮、透析、冷凍干燥得鐵皮石斛葉多糖a-22。

實施例3兩種鐵皮石斛葉多糖的表征

一)多糖平均相對分子量的測定

a-11和a-22的平均相對分子量分別通過waters2695(7.8×300mm)凝膠滲透色譜系統(tǒng)(gpc)測定，該系統(tǒng)配備hr3，hr4，hr5柱和waters2414折射率檢測器。上樣50μl，流動相為純水，流速1ml/min，柱溫40℃，peg為標樣做標準曲線。

表1鐵皮石斛葉多糖a-11和a-22的gpc測定的結果

二)多糖的單糖組成分析

1、水解多糖為單糖：準確稱取鐵皮石斛葉純化多糖a-11、a-22各5.0mg，分別放入兩個安瓿瓶中，加入2.0ml三氟乙酸(tfa)溶液，密封，120℃水解8h。將水解產(chǎn)物置于減壓真空干燥箱中快速干燥，依次加入甲醇2ml，減壓蒸干，重復三次，直至tfa無殘留，干燥產(chǎn)物備用。

2、水解單糖的衍生化：上述水解產(chǎn)物中依次加入0.1ml吡啶、5mg鹽酸羥胺，通風櫥中90℃加熱30min，小心混勻冷卻至室溫，加入1.0ml乙酸酐，繼續(xù)水浴30min，完成乙?；苌鬁p壓濃縮干燥。每管加入色譜級氯仿1ml,振蕩溶解，0.45μl微孔濾膜過濾后，進樣上機分析。標準品單糖(鼠李糖，阿拉伯糖，巖藻糖，木糖，阿洛糖，甘露糖，葡萄糖和半乳糖)衍生化同以上操作。

3、上機分析條件gc-ms體系agilent，77890a-5975c,usa；db-5ms(30mm×0.25mm×0.25μm,agilent)；n2流速1ml/min，溫度程序設置為：進樣口溫度為270℃，離子源溫度230℃，柱溫100℃保持2min，然后以20℃/min增加到190℃，再以20℃/min增加到260℃，最終以10℃/min升溫到300℃，保持4min。

表2鐵皮石斛葉多糖a-11的gc-ms分析的結果

表3鐵皮石斛葉多糖a-22的gc-ms分析的結果

三)紫外光譜分析

取一定量除去蛋白的多糖溶于重蒸水中，制成濃度為0.5mg/ml溶液，在紫外可見光譜記錄儀上掃描分析，波長范圍：190nm-700nm；結果如圖5，其在260nm和280nm處均無特征吸收峰，表明多糖無蛋白質和核酸。

四)紅外光譜分析

準確稱取干燥a-11和a-22各2mg，加入干燥的溴化鉀粉末混勻研磨，倒入壓片模具壓片1min，置于樣品掃描窗口，在4000～400cm^-1的范圍內進行紅外光譜掃描。結果如圖6所示，可以看出：紅外光譜分析顯示，組分a-11和a-22都在3300～3500cm^-1有糖分子-oh伸縮振動引起的特征峰，是-oh形成的分子內、間氫鍵；2800cm^-1左右出現(xiàn)了較強吸收峰，是糖分子-ch、-ch2、-ch3伸縮振動引起的信號峰，這兩組峰都為糖類的特征吸收峰，所以兩種組分都是糖類物質；在1000～1200cm^-1處，兩種組分都有明顯的吸收峰，為c-o-c環(huán)內醚中的c-o伸縮振動，和c-o-h的o-h變角振動是c-h的變角振動，由圖譜可知多糖中可能含有3,6-內醚橋；812cm^-1處是c-o-s伸縮振動的特征吸收峰，組分中存在半乳糖；872cm^-1是d-man的吸收峰；775cm^-1波數(shù)處出現(xiàn)比較弱的葡萄吡喃糖環(huán)殘基吸收峰；在1875～1835cm^-1沒有糖醛酸的特征峰，表明多糖為中性糖。

實施例4兩種鐵皮石斛葉多糖的用途

材料與試劑：鐵皮石斛葉多糖a-11，a-22(實施例1、實施例2制備)，dmem培養(yǎng)基(sigma)，lps(sigma)，胚牛血清(sigma)，胰蛋白酶(sigma)，griess試劑(sigma)。

儀器恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)公司)，酶標儀(日本corona公司)，顯微鏡(上海光學儀器廠)，96孔板(美國bd公司)。

一、a-11，a-22對巨噬細胞raw264.7吞噬中性紅功能的影響

巨噬細胞raw264.7加入到96孔板中(5×10⁵個/孔)，隨后每孔分別添加pbs，不同濃度的組分多糖a-11(5、25、125、250、和500μg/ml)和a-22(50、100、200、400、和800μg/ml)進行處理，每個濃度3個平行組，在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)24h。隨后，棄上清液，pbs洗滌2次，再逐孔添加100μl0.075％中性紅，搖勻，置于37℃、5％co2條件下培養(yǎng)30min。隨后每孔再棄上清液，并用pbs洗滌3次，添加100μl細胞裂解液至每孔，37℃裂解細胞6h，在酶標儀490nm波長測定吸光值，od值表示為吞噬作用。結果如圖7、圖8所示，鐵皮石斛葉多糖a-11，a-22在高濃度時都可顯著得促進巨噬細胞raw264.7吞噬中性紅能力。

二、a-11，a-22對巨噬細胞raw264.7產(chǎn)生一氧化氮(no)的影響

raw264.7細胞加入到96孔板中(5×10⁵個/孔)，隨后每孔分別添加dmso(空白對照組)，lps(陽性對照組)，不同濃度的組分多糖a-11(5、25、125、250、和500μg/ml)和a-22(50、100、200、400、和800μg/ml)進行處理，每個濃度3個平行組，在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)24h。之后加入100μlgriess試劑至100μl上清液樣品中，混勻后，靜置10min。用酶標儀在570nm處測定吸光度值，通過亞硝酸鈉標準曲線計算上清液no的產(chǎn)生量。結果如圖9、圖10所示，說明鐵皮石斛葉多糖a-11，a-22可以顯著增強巨噬細胞raw264.7no的產(chǎn)生量。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發(fā)明的保護范圍。