本發(fā)明屬于生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，本發(fā)明涉及一種塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：塞尼卡谷病毒(senecavalleyvirus,svv),又稱為senecavirusa(sva)，是豬原發(fā)性皰疹病(swineidiopathicvesiculardisease，sivd)的主要病原。svv感染豬群后，盡管不會造成較大政治、經(jīng)濟(jì)損失，但所引起的水皰性病變，與口蹄疫病毒、豬水泡病、水泡性口炎、豬水皰疹等造成的病變相似，給臨床鑒別診斷造成了一定的困難。目前，北美、南美地區(qū)以及澳大利亞都有豬群發(fā)生sivd的報道。2015年我國及巴西出現(xiàn)了幾次svv感染豬群并出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床及死亡癥狀，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，我國于2016年也首次分離到了svv。svv是小rna病毒科(picornaviridae)塞尼卡病毒屬(senecavirus)的唯一成員，svv為單股、正鏈、不分節(jié)段的rna病毒。通過對小rna病毒科的12個代表性病毒屬病毒進(jìn)行全基因組序列比對發(fā)現(xiàn)，塞尼卡病毒屬與心肌炎病毒屬遺傳關(guān)系最近。svv為直徑約27nm的二十面體無囊膜單股正鏈不分節(jié)段的rna病毒。病毒基因組含有7280個核苷酸，一個開放閱讀框含有6543個核苷酸，編碼2181個氨基酸的多聚蛋白，可以分割成12個多肽，構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)的小rna病毒科l-4-3-4模式。與所有小rna病毒科成員一樣，p1多肽由3c蛋白酶裂解成vp0、vp3和vp1，構(gòu)成病毒核衣殼。成熟的vp0裂解生成vp2和vp4。病毒vp1～vp4亞基蛋白結(jié)構(gòu)保守，可能與病毒的細(xì)胞嗜性有關(guān)。vp2和vp4某些區(qū)域相互作用參與核酸包裝。由于我國于2016年首次分離到了svv，目前有關(guān)svv抗體檢測的方法尚處于研究階段，svv抗體檢測方法相關(guān)的研究主要有間接elisa和競爭elisa。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體的間接elisa檢測試劑盒，該試劑盒利用塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白vp1、vp2和vp3抗原表位多肽作為包被抗原，建立了一種特異性、敏感性和重復(fù)性好的間接elisa方法，用于檢測豬血清中是否含有塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明首先篩選得到了性能優(yōu)異的塞尼卡谷病毒抗原表位多肽組合物，本發(fā)明提供的塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位多肽組合物，為序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2、序列表中序列3所示的多肽或序列表中序列4所示的多肽中的一種或兩種以上的任意組合。當(dāng)所述多肽組合物為序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽和序列4所示的多肽中的兩種時，兩種多肽的質(zhì)量比為(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；優(yōu)選的，它們的質(zhì)量比為1：1；當(dāng)所述多肽組合物為序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽和序列4所示的多肽中的三種時，任意三種多肽的質(zhì)量比為(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；優(yōu)選的，它們的質(zhì)量比為1：1：1；當(dāng)所述多肽組合物由序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽和序列4所示的多肽組成時，它們的質(zhì)量比為(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；優(yōu)選的，它們的質(zhì)量比為1：1：1：1。本發(fā)明的塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括酶聯(lián)反應(yīng)板、陽性對照血清、陰性對照血清和酶標(biāo)二抗；其中所述酶聯(lián)反應(yīng)板包被有塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位多肽組合物。所述酶聯(lián)反應(yīng)板為可拆卸96孔酶標(biāo)板；所述塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位多肽組合物中的多肽均為化學(xué)人工合成得到。所述酶聯(lián)反應(yīng)板的最佳制備方法及條件是將所述塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位多肽組合物溶于ph9.6的碳酸鹽溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板，每孔200ng多肽，2～8℃下放置8～12小時，使多肽抗原與酶聯(lián)反應(yīng)板充分結(jié)合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(bsa)ph7.4的pbs緩沖液，37℃封閉處理2～3小時，甩干后，待酶聯(lián)反應(yīng)板干燥后4℃密封保存。所述陽性對照血清為所述塞尼卡谷病毒人工感染后采集的豬血清；所述陰性對照血清為無特定病原體(spf)的豬血清。所述酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗豬igg抗體。所述試劑盒還包括底物液a、底物液b和終止液，所述底物液a為含0.06％(g/ml)過氧化氫尿素的檸檬酸磷酸鹽緩沖液，所述底物液b為0.2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺溶液，使用時兩者以1:1的比例混合。所述終止液為2mol/l的硫酸溶液。所述試劑盒還包括樣品稀釋液和20倍濃縮洗滌液；樣品稀釋液為含有0.5％(g/100ml)酪蛋白的0.01m、ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液；濃縮洗滌液為含有濃度為0.8％～1.2％(ml/ml)的tween-20的0.01m，ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明試劑盒的檢測程序為：1、平衡：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置室溫平衡30min備用；液體試劑用前混勻。2、配液：將濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋得到洗滌緩沖液；3、設(shè)定：2個陰性對照孔和2個陽性對照孔，其余為待測樣本孔。4、待測標(biāo)本預(yù)稀釋：使用樣品稀釋液將待檢樣品血清、陰性對照血清、陽性對照血清按照1：20的比例稀釋。5、加樣：各孔分別按預(yù)先設(shè)定加100μl稀釋的待測樣本。加樣過程時間跨度應(yīng)盡量短。6、溫育：震蕩混勻，置37℃溫箱中，反應(yīng)30min。7、洗板：棄去反應(yīng)液，每孔加300μl稀釋后的洗滌緩沖液，浸泡15s，甩棄洗液，連續(xù)洗板4次后拍干。8、加酶：各孔加100μl辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗豬igg抗體。9、溫育：置37℃溫箱，反應(yīng)30min。10、洗板：棄去反應(yīng)液，每孔加入稀釋后的洗滌緩沖液300μl，浸泡15s，甩棄洗滌液，連續(xù)洗板4次后拍干。11、顯色每孔加入100μl底物工作液(將底物液a和底物液b等量混合即為底物工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配)，震蕩混勻，置37℃溫箱中，避光反應(yīng)15min。12、每孔加入顯色終止液50μl，振蕩混勻終止反應(yīng)。13、測定每孔的od450nm值(加終止液的反應(yīng)板應(yīng)在15min內(nèi)讀取od450nm值)。檢測結(jié)果的判定：1、陰性對照od450nm平均值應(yīng)該≤0.15，否則無效。2、陽性對照每個檢測值應(yīng)該在1.0～2.5之間，否則無效。3、臨界值的計算：臨界值＝0.17×陽性對照od450nm值平均值。待檢血清測定od450nm值≥臨界值者判為陽性；待檢血清測定od450nm值<臨界值者判為陰性。本發(fā)明的上述試劑盒，可用于檢測塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體，以判斷被檢動物是否存在感染后產(chǎn)生的塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體。在制備檢測是否感染塞尼卡谷病毒病的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；本發(fā)明的積極效果在于：本發(fā)明采用生物信息學(xué)方法對塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白的抗原表位進(jìn)行精確分析，從vp1、vp2、vp3蛋白上的主要抗原表位上篩選出適合elisa檢測用的肽段。該肽段集中了抗原表位，具有靈敏性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點。同時，采用先進(jìn)的固相合成肽技術(shù)合成多肽抗原用于包被酶標(biāo)反應(yīng)板的制備。另外，由于試劑盒中使用的包被抗原是化學(xué)合成多肽，不含雜蛋白，純度高，進(jìn)一步提高了檢測塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體的效率，以判斷被檢動物是否感染塞尼卡谷病毒?？傊驹噭┖胁捎没瘜W(xué)合成結(jié)構(gòu)蛋白vp1、vp2、vp3主要抗原位點的抗原肽包被酶聯(lián)反應(yīng)板，抗原用量少、靈敏度高、特異性強(qiáng)，可以有效地檢測塞尼卡谷病毒病毒感染后產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白抗體，以判斷被檢動物是否感染塞尼卡谷病毒病毒。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的試劑盒重復(fù)性好，特異性強(qiáng)，靈敏度高。能滿足不同層次人員的需要，具有廣闊的市場前景和良好的經(jīng)濟(jì)、社會效益。本發(fā)明所涉及的塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒用于檢測動物是否感染塞尼卡谷病毒，有利于我國塞尼卡谷病毒防控體系的建立。具體實施方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1、塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒包被抗原的制備本試驗采用生物信息學(xué)方法對塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白vp1、vp2、vp3的主要抗原表位進(jìn)行精確分析，篩選出合適的肽段，用全自動多肽合成儀分別合成出四條肽，序列分別為序列表中序列1、序列2、序列3和序列4所示，制成純度約80％的更新更全的包被抗原，能夠覆蓋塞尼卡谷病毒病毒的主要中和抗原表位，提高抗體陽性的檢出率。多肽合成方法可為常規(guī)方法，本發(fā)明使用如下方法合成本發(fā)明的四條多肽，作為本發(fā)明試劑盒的包被原。本發(fā)明的包被抗原可使用appliedbiosystem全自動多肽合成儀(型號433a)制備。運用merrifield固相合成法，采用的是fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，9-芴甲氧羰基)修飾的氨基酸，使用rinkamidembha樹脂做為固相載體。生產(chǎn)過程包括多肽抗原固相合成、多肽裂解和鑒定、抗原純化、冷凍干燥以及保存五部分。以下分別進(jìn)行說明：一、包被抗原固相合成1、合成試劑的準(zhǔn)備合成包被抗原氨基酸序列如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4所示。依據(jù)包被抗原序列以及合成規(guī)模準(zhǔn)備合適的fmoc修飾的氨基酸(購自nova公司)，加入至相應(yīng)的cartridge中。同樣按要求合成規(guī)模稱樹脂5g，放入反應(yīng)腔，將上下蓋子擰緊，貼標(biāo)簽，記錄所合成肽的名稱，批號，反應(yīng)腔的tare及所稱樹脂的重量。將反應(yīng)腔裝入合成儀。配制適量的合成試劑包括100％的nmp、3％的aim(已酰咪唑)、35％的pip(哌啶)、100％的meoh(甲醇)等放置到相對應(yīng)的試劑瓶中。2、合成儀狀態(tài)的檢測檢查433a多肽合成儀器是否正常運行，開機(jī)后，運行runselftest程序，儀器自檢各項指標(biāo)是否正常。另外檢查氮氣是否充足，系統(tǒng)表壓是否正常(433a正常表壓10.2psi)。合成前應(yīng)對儀器的性能有所了解，所以要對每種合成試劑的流速進(jìn)行測定。433a合成儀：發(fā)送flowrate1-18到合成儀，選擇mainmenu—moduletest—按prer或next找modulea、moduled、modulei、modulei、modulea)—按start—按more進(jìn)行測量或觀察，若流量不合適，則調(diào)節(jié)下閥門壓力，直至達(dá)到要求(具體檢測要求見下表1)。表1.多肽合成儀流速檢測標(biāo)準(zhǔn)表試劑瓶號module標(biāo)準(zhǔn)范圍35％piperidine1a1.0～1.2ml3％aim4d1.0～1.2ml100％meoh9i3.5～4.0mldic8i0.45～0.55g100％nmp10a2.6～2.8ml3、包被抗原合成開始在433a合成儀的程序中將要合成的氨基酸序列發(fā)送stdfmoc1.0soldic90到合成儀上。file-new-sequence-編輯合成肽的序列，保存。file-new-run，檢查chemistry是否為stdfmoc1.0soldic90；sequence是否為所存名字；設(shè)定cycles；保存。最后發(fā)送到合成儀上。mainmenu—cyclemonitor—begin，開始運行。4、包被抗原合成進(jìn)行fmoc基團(tuán)的脫除，fmoc基團(tuán)的芴環(huán)系的吸電子作用使9-h具有酸性，易被較弱堿除去，反應(yīng)時用哌啶(pip)進(jìn)攻9-h,β消除形成二苯芴烯，很容易被二級環(huán)胺進(jìn)攻形成穩(wěn)定的加成物。fmov基團(tuán)的脫除后暴露出“－nh2”基團(tuán)以進(jìn)行合成反應(yīng)。然后加入活化的下一個fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸和1-羥基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole，hobt)至反應(yīng)器內(nèi)。如上述的多肽序列，合成的時候是從c端開始至n端，依照特定的順序，依次不斷地重復(fù)合成步驟(合成儀按程序自動完成，具體循環(huán)步驟如下表2)。期間觀察記錄試劑用量及運行情況。表2.包被抗原合成循環(huán)步驟5、包被抗原合成結(jié)束包被抗原合成結(jié)束后合成儀將自動停止，并且肽樹脂(肽現(xiàn)在還連接在樹脂上)基本洗滌干凈。然后從多肽合成儀上取下反應(yīng)器，再用100％甲醇洗滌肽樹脂3次后，在通風(fēng)櫥內(nèi)吹干，然后將多肽樹酯全部轉(zhuǎn)移至棕色的聚乙烯瓶內(nèi)，放入-20℃冰箱內(nèi)，封口膜密封備用。二、包被抗原的裂解及鑒定1、多肽抗原的裂解經(jīng)上述反應(yīng)所得到的多肽是與固相載體通過化學(xué)鍵結(jié)合在一起的，必須通過特定的有機(jī)強(qiáng)酸的酸解把多肽與固相載體分離。酸解的同時也除去了各個氨基酸官能團(tuán)上的保護(hù)基。步驟如下：從冰箱內(nèi)取出合成的多肽樹酯(指肽還連接在樹脂上)，放入一只2l的圓底燒瓶內(nèi)，在通風(fēng)櫥內(nèi)向燒瓶中加入90ml三氟乙酸(trifluoroaceticacid,tfa)、10ml的三丙基硅烷(tis)和磁攪拌子，然后穩(wěn)定地將燒瓶放置在磁力攪拌器上，室溫下持續(xù)攪拌1h至反應(yīng)完全。反應(yīng)結(jié)束后，使用帶冷阱的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀持續(xù)蒸發(fā)30～120min除去粗產(chǎn)品中的tfa。然后用二甲基甲酰氨(dmf)多次清洗多肽抗原的粗品，最后將混合在一起的樹脂用砂心漏斗過濾出來，既得到包被抗原。2、包被抗原的鑒定多肽抗原合成完畢后用基質(zhì)輔助激光解吸飛試時間質(zhì)譜法(modal-tof)和反相高壓液相色譜法(rp-hplc)進(jìn)行定性定量分析，用常見的氨基酸分析來鑒定所合成的肽。3、包被抗原純化將環(huán)化后的多肽抗原使用循環(huán)式切向過濾膜包進(jìn)行超濾(用pall公司生產(chǎn)的tangentialflowdevice循環(huán)式切向過濾膜包以及與其配套的蠕動泵)，多肽抗原作為大分子不能通過一定孔徑的濾膜，而前期合成過程以及后期環(huán)化反應(yīng)形成或引進(jìn)的小分子雜質(zhì)則可以通過濾膜。然后再通過孔徑為0.2μm過濾器除菌，將最后所得溶液分裝到無菌塑料瓶內(nèi)，貼上標(biāo)簽。標(biāo)簽上注明多肽的名稱、編號、生產(chǎn)批號、濃度、生產(chǎn)日期、保存期限及保存條件，分裝后，儲存于-20℃或-40℃?zhèn)溆谩?、包被抗原冷凍干燥為了便于長期保存和運輸，需要將包被抗原進(jìn)行冷凍干燥以得到固體狀態(tài)的多肽。將預(yù)先冷凍好的包被抗原放置于labconco的冷凍干燥機(jī)上進(jìn)行干燥，得到固體狀態(tài)的包被抗原。包裝后貼上標(biāo)簽。標(biāo)簽上注明多肽的名稱、編號、生產(chǎn)批號、濃度、生產(chǎn)日期、保存期限及保存條件。實施例2、塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒包括：(1)包被有塞尼卡谷病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板；2×96孔。(2)陽性對照血清：是以塞尼卡谷病毒人工感染后采集豬血清，作為試劑盒的陽性對照血清(1管，1.5ml/管)。(3)陰性對照血清：是無特定病原體(spf)的豬血清，作為試劑盒的陰性對照血清(1管，1.5ml/管)。(4)酶標(biāo)二抗：是以辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗豬igg(購自sigma公司，貨號a5670)作為原液進(jìn)行1:30000稀釋后制得，2瓶(12ml/瓶)。(5)樣品稀釋液：為含有0.5％(g/100ml)酪蛋白的0.01m、ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液，1瓶(24ml/瓶)。(6)底物液a：為含0.6mg/ml過氧化氫尿素的檸檬酸磷酸鹽緩沖液(1瓶，12ml/瓶)(7)底物液b：為0.2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺(tmb)溶液(1瓶，12ml/瓶)。(8)終止液：2mol/l的硫酸溶液(1瓶，12ml/瓶)。(9)20倍濃縮洗滌液：為含有濃度為0.8％～1.2％(ml/ml)的tween-20的0.01m，ph值為7.4的磷酸鹽緩沖液(50ml/瓶，2瓶)。根據(jù)需要，試劑盒中還可以有血清稀釋板(2塊，96孔/塊)，用于血清樣品的稀釋。其中，包被有塞尼卡谷病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板的制備方法為：1.將實施例1制備的多肽抗原溶于ph9.6的碳酸鹽溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板，每孔200ng多肽(其中序列表中序列1所示的多肽為50ng，序列表中序列2所示的多肽為50ng，序列表中序列3所示的多肽為50ng，序列表中序4所示的多肽為50ng)，2～8℃下放置8～12小時，使多肽抗原與酶聯(lián)反應(yīng)板充分結(jié)合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(bsa)ph7.4的pbs緩沖液，37℃封閉處理2～3小時，甩干后，待酶聯(lián)反應(yīng)板干燥后4℃密封保存。實施例3、塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的敏感性試驗一、塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法1、平衡：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置室溫平衡30min備用；液體試劑用前混勻。2、配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水20倍稀釋得到洗滌緩沖液；3、設(shè)定：2個陰性對照孔和2個陽性對照孔，其余為待測樣本孔。4、待測標(biāo)本預(yù)稀釋：使用樣品稀釋液將待檢樣品血清、陰性對照血清、陽性對照血清按照1：20的比例稀釋。5、加樣：各孔分別按預(yù)先設(shè)定加100μl稀釋的待測樣本。加樣過程時間跨度應(yīng)盡量短。6、溫育：震蕩混勻，置37℃溫箱中，反應(yīng)30min。7、洗板：棄去反應(yīng)液，每孔加300μl洗滌緩沖液，浸泡15s，甩棄洗液，連續(xù)洗板4次后拍干。8、加酶：各孔加100μl辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗豬igg抗體。9、溫育：置37℃溫箱，反應(yīng)30min。10、洗板：棄去反應(yīng)液，每孔加入洗滌緩沖液300μl，浸泡15s，甩棄洗滌液緩沖液，連續(xù)洗板4次后拍干。11、顯色每孔加入100μl底物工作液(將底物液a和底物液b等量混合即為底物工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配)，震蕩混勻，置37℃溫箱中，避光反應(yīng)15min。12、每孔加入顯色終止液50μl，振蕩混勻終止反應(yīng)。13、測定每孔的od450nm值(加終止液的反應(yīng)板應(yīng)在15min內(nèi)讀取od450nm值)。檢測結(jié)果的判定：1、陰性對照od450nm平均值應(yīng)該≤0.15，否則無效。2、陽性對照每個檢測值應(yīng)該在1.0～2.5之間，否則無效。3、臨界值的計算：臨界值＝0.17×陽性對照od450nm值平均值。待檢血清測定od450nm值≥臨界值者判為陽性；待檢血清測定od450nm值<臨界值者判為陰性。二、對已知陽性血清的敏感性試驗使用按照實施例2的方法制備的三批塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(批次zm2017001、zm2017002、zm2017003)，分別依照上述塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒使用方法對塞尼卡谷病毒感染豬血清35份(塞尼卡谷病毒感染出現(xiàn)臨床癥狀后不同時間采集的豬血清)進(jìn)行敏感性試驗，實驗結(jié)果見表3，本發(fā)明的塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒共檢測出34份，有1份未檢出，結(jié)果表明本試劑盒對35份已知陽性血清的敏感性為97.1％。表3.塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的敏感性檢測結(jié)果試劑盒批號檢出率敏感性zm201700134/3597.1％zm201700234/3597.1％zm201700334/3597.1％三、最低檢測限量試驗選取塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體陽性的豬血清3份，進(jìn)行倍比稀釋1:20、1:40～1:320，使用實施例2制備的三批塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(批次zm2017001、zm2017002、zm2017003)，依照上述塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒使用方法對倍比稀釋豬血清進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒的可以檢測到1:160倍稀釋的陽性血清，其中，表4是其中一個批次的實驗結(jié)果。表4中，陽性對照：是以塞尼卡谷病毒人工感染后采集豬血清，作為試劑盒的陽性對照血清(1管，1.5ml/管)。陰性對照：是無特定病原體(spf)豬血清，作為試劑盒的陰性對照血清(1管，1.5ml/管)。臨界值(cut-off值)＝0.17×陽性對照od450nm值平均值。表4塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的最低檢測限量試驗檢測結(jié)果實施例4、塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的特異性試驗使用實施例2中的三批試劑盒依照實施例3中所述的塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法對50份健康豬血清(中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供)、2份豬口蹄疫病毒o型(fmd-o)陽性血清(中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供)、2份豬口蹄疫病毒a型(fmd-a)陽性血清(中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠提供)、2份豬水泡病陽性血清(svd)(中牧實業(yè)股份有限公司提供)、2份豬水泡性口炎病毒(vsv)陽性血清(中牧實業(yè)股份有限公司提供)，分別進(jìn)行檢測。試劑盒的特異性檢測結(jié)果如下表(表5)顯示，對50份健康豬血清的檢測結(jié)果顯示，zm2017001試劑盒的特異性為100.0％，zm2017002試劑盒的特異性為100.0％，zm2017003試劑盒的特異性為100.0％。對2份豬口蹄疫病毒o型(fmd-o)陽性血清、2份豬口蹄疫病毒a型(fmd-a)陽性血清、2份豬水泡病(svd)陽性血清、2份豬水泡性口炎病毒(vsv)陽性血清的檢測結(jié)果均顯示為陰性，因此三個試劑盒對這8份相關(guān)病原陽性血清檢測的特異性均為100％。表5塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒特異性檢測結(jié)果實施例5、塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的符合率試驗一、病毒中和試驗(vnt)方法目前塞尼卡谷病毒公認(rèn)的檢測方法是病毒中和試驗(vnt)，因此用本試劑盒同病毒中和試驗進(jìn)行符合率試驗。1.材料1.1感染豬血清，24份(血清編號i1～i24)，為塞尼卡谷病毒感染后出現(xiàn)臨床癥狀后采集的豬血清，經(jīng)56℃30min滅活，由中牧實業(yè)股份有限公司提供。1.2健康豬血清，24份(血清編號n1～n24)，經(jīng)56℃30min滅活，由中牧實業(yè)股份有限公司提供。1.3試驗用病毒(svv病毒)為塞尼卡谷病毒的pk15細(xì)胞毒，調(diào)整其毒價至400tcid50/0.1ml，置于-20℃保存待用。2.方法病毒中和試驗方法如下：血清滅活后，用dmem培養(yǎng)基進(jìn)行倍比稀釋(25μl/孔)，每個稀釋度做3個重復(fù)；每孔加入等體積(25μl/孔)100tcid50的svv病毒(對照除外)，置于37℃孵育1小時；然后每孔加入用dmem培養(yǎng)基稀釋的100μlpk15細(xì)胞(2～3×104)，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，72小時后觀察細(xì)胞病變(cpe)。cpe被抑制的最后一個稀釋度(90～100％被抑制)被認(rèn)為是病毒中和試驗(vnt)效價，效價≥1:64判為陽性。二、符合率試驗結(jié)果：利用實施例2制備的塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒與病毒中和試驗(vnt)分別檢測24份塞尼卡谷病毒豬血清和24份健康血清。塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對24份感染豬血清的檢測結(jié)果見表6，本發(fā)明試劑盒的敏感性為95.8％，而病毒中和試驗的敏感性為87.5％，在24份感染豬血清中，兩種方法檢測結(jié)果一致的為22份。因此，本發(fā)明試劑盒和病毒中和試驗的符合率為91.7％，本發(fā)明試劑盒具有較高的敏感性。對健康豬血清的測試兩者的符合率為100％，檢測結(jié)果均為陰性(見表6)。塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒與病毒中和試驗一共檢測48份豬血清，其中46份豬血清兩種方法檢測結(jié)果一致，2份豬血清檢測結(jié)果有差異，符合率為95.8％。表6塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及病毒中和試驗法對感染豬血清和健康豬血清的檢測結(jié)果以上對本發(fā)明具體實施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。序列表<110>中牧實業(yè)股份有限公司<120>塞尼卡谷病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒<130>whoi170051<160>4<210>1<211>37<212>prt<213>人工序列<220><223><400>1seraspleugluvalthrvalvalserleugluproaspleugluphe151015alavalglytrppheproserglyserglutyrglnalaserserphe202530valtyraspglnleu35<210>2<211>36<212>prt<213>人工序列<220><223><400>2thrlysseraspproproserserserthraspglnprothrthrthr151015phethralaileaspargtrptyrthrglyargleuasnsertrpthr202530lysalavallys35<210>3<211>38<212>prt<213>人工序列<220><223><400>3protyrileglygluthrprothrglnsersergluthrglnasnser151015trpthrleuleuvalmetvalleuvalproleuasptyrlysglugly202530alathrthraspproglu35<210>4<211>34<212>prt<213>人工序列<220><223><400>4thrleuserglualametglncysthrtyrseriletrpaspilegly151015leuasnsersertrpthrphevalvalprotyrileserproserasp202530tyrarg當(dāng)前第1頁12