本發(fā)明具體涉及一種通過與固定化微生物共培養(yǎng)利用淀粉異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

微藻自養(yǎng)培養(yǎng)過程中存在光限制問題，使得光合反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和運(yùn)行比較困難，而且自養(yǎng)生長下由于細(xì)胞的生長受到光限制，細(xì)胞生長通常比較緩慢，培養(yǎng)周期較長，且最終生物量濃度較低，而較低的生物量濃度會進(jìn)一步增加后續(xù)細(xì)胞采收過程的難度。部分藻類可以在無光源的條件下異養(yǎng)利用外源有機(jī)碳源進(jìn)行生長，在異養(yǎng)培養(yǎng)，外源有機(jī)碳源的添加可以顯著促進(jìn)微藻培養(yǎng)過程中細(xì)胞的生長速率，大大縮短培養(yǎng)周期，并且可以達(dá)到較高的生物量濃度，此外，異養(yǎng)培養(yǎng)過程無需光照，反應(yīng)器的設(shè)計(jì)、放大和運(yùn)行比較簡單。

在微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)過程中，有機(jī)碳源是細(xì)胞生長唯一的能量來源，現(xiàn)有的異養(yǎng)培養(yǎng)過程通常應(yīng)用純的葡萄糖作為微藻培養(yǎng)的碳源，另外，也有部分應(yīng)用甘油、乙酸鹽等碳源的報(bào)道。但是，碳源的添加使得培養(yǎng)基的成本大大增加，碳源成本甚至可占到培養(yǎng)基總成本的80％。因此，尋找低廉高效的碳源對于降低微藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程的成本，促進(jìn)微藻異養(yǎng)培養(yǎng)的產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。

淀粉是地球上天然生成的數(shù)量巨大的一類高分子碳水化合物，淀粉的結(jié)構(gòu)是由單一的葡萄糖單元共價(jià)結(jié)合形成的高分子多糖，在自然界中，以顆粒形式廣泛存在植物的種子、塊莖或根部中。淀粉作為一類來源廣泛、價(jià)格低廉的碳水化合物，是一種比較理想的碳源，但是由于微生物難以直接利用高分子的淀粉，且包括藻類在內(nèi)的眾多微生物不能分泌淀粉酶，因此，在許多微生物的培養(yǎng)過程中，難以直接利用淀粉。當(dāng)前，有少許關(guān)于利用淀粉進(jìn)行微藻異養(yǎng)/兼養(yǎng)培養(yǎng)的報(bào)道，但是上述研究中均需先將淀粉通過化學(xué)或酶法水解成葡萄糖或寡糖后再用于微藻的培養(yǎng)中，水解過程增加了微藻培養(yǎng)過程的單元操作，進(jìn)而增加了生產(chǎn)成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對微藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程中碳源成本較高，同時(shí)難以直接利用價(jià)格低廉的淀粉作為碳源生長的問題，本發(fā)明提供了一種通過與固定化微生物共培養(yǎng)利用淀粉異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法，先將具有胞外淀粉酶分泌能力的微生物進(jìn)行固定化，然后將固定化的微球與微藻進(jìn)行共培養(yǎng)，在該體系中，固定在介質(zhì)中的微生物可以正常的分泌淀粉酶將淀粉水解為低聚糖、寡糖、葡萄糖等，微藻可以利用固定化細(xì)胞產(chǎn)生的單糖或寡糖進(jìn)行生長，有效解決了微藻在異養(yǎng)培養(yǎng)下難以直接利用淀粉的問題，同時(shí)，細(xì)胞的固定化使得培養(yǎng)體系中微藻處于純培養(yǎng)狀態(tài)，在培養(yǎng)結(jié)束后，通過簡單的過濾或沉降即可獲得純培養(yǎng)的藻液，可廣泛適用于各種藻基生物產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一種通過與固定化微生物共培養(yǎng)利用淀粉異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法包括以下步驟：

(1)配置培養(yǎng)基：在培養(yǎng)裝置中，加入以淀粉作為有機(jī)碳源的常規(guī)的微藻培養(yǎng)基，滅菌冷卻后待接種；

(2)接種：將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的微藻細(xì)胞以一定的接種量接入；

(3)微生物細(xì)胞的固定化：將培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期的具有胞外淀粉水解能力的微生物細(xì)胞進(jìn)行固定化，然后將含固定化微生物的微球以特定的量添加到步驟(2)的培養(yǎng)液中，開始培養(yǎng)；

(4)培養(yǎng)及細(xì)胞收集：在適宜的溫度及通氣條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，將含微生物的微球分離，獲得純藻液。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述培養(yǎng)裝置是不同規(guī)格的搖瓶，板式反應(yīng)器，氣升式反應(yīng)器，鼓泡塔反應(yīng)器，但不包括機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐等剪切力較高的反應(yīng)器；所述淀粉包括玉米淀粉，小麥淀粉，米粉，薯類淀粉，野生植物來源的淀粉；所述淀粉的添加量為5～100g/l。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述微藻為小球藻、柵藻、衣藻、布朗葡萄藻、雨生紅球藻等可以利用葡萄糖的淡水藻以及微擬球藻、三角褐指藻等海洋藻；微藻的接種量為2％～20％(v/v)。

進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述微生物為具有胞外淀粉水解能力的微生物，包括野生型的扣囊覆膜酵母(saccharomycopsisfibuligera)、黑曲霉(aspergillusniger)，毛霉，或者是利用基因工程改造后的工程菌株；所述固定化方法包括常規(guī)的吸附、包埋、交聯(lián)；添加的固定化微球中含有的微生物干重為微藻細(xì)胞干重的5％～20％(w/w)。

進(jìn)一步地，步驟(4)中，所述培養(yǎng)的溫度為15～30℃；通氣量為0.1～15vvm；培養(yǎng)的ph為6.5～9.5。

本發(fā)明提供的一種通過與固定化微生物共培養(yǎng)利用淀粉異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法，解決了微藻難以利用成本低廉的淀粉類原料異養(yǎng)培養(yǎng)的問題，為降低微藻異養(yǎng)培養(yǎng)的碳源成本提供了新的途徑，且可得到高濃度的純藻液。

與現(xiàn)有的微藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程相比，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)及先進(jìn)性在于：

(1)本發(fā)明提供的方法可以有效地解決了微藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程中不能直接利用淀粉的問題，使得微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)可以利用比較低廉的淀粉類原料進(jìn)行，有效地降低了微藻培養(yǎng)過程的碳源成本；

(2)本發(fā)明提供的方法通過將微生物細(xì)胞固定化，實(shí)現(xiàn)了微藻的純培養(yǎng)，與常規(guī)的共培養(yǎng)工藝相比，可以通過簡單的過濾實(shí)現(xiàn)藻-菌的分離，最終獲得純培養(yǎng)的微藻細(xì)胞，可廣泛適用于各種藻基生物產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中。

具體實(shí)施方式

為了更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制的實(shí)施例如下：

實(shí)施例1

(1)在2l氣升式反應(yīng)器中，加入含80g/l小麥淀粉的培養(yǎng)基，滅菌并冷卻；

(2)將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的橢圓小球藻以10％(v/v)的接種量接入；

(3)扣囊覆膜酵母培養(yǎng)至對數(shù)期后，通過海藻酸鈣包埋的方法將其固定化，將固定化的微球以微藻細(xì)胞干重5％的酵母細(xì)胞含量添加到培養(yǎng)液中開始培養(yǎng)；

(4)在25℃、2vvm的通氣量以及ph7.0的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集藻液。

處理效果測試：

培養(yǎng)過程中未發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞的泄露，微藻的最終濃度達(dá)到了3.8g/l。

實(shí)施例2

(1)在500ml三角瓶中，加入含100g/l玉米淀粉的培養(yǎng)基，滅菌并冷卻；

(2)將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的微擬球藻以20％(v/v)的接種量接入；

(3)黑曲霉培養(yǎng)至對數(shù)期后，通過卡拉膠包埋的方法將其固定化，將固定化的微球以微藻細(xì)胞干重20％的黑曲霉細(xì)胞含量添加到培養(yǎng)液中開始培養(yǎng)；

(4)在15℃、15vvm的通氣量以及ph9.5的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集藻液。

處理效果測試：

培養(yǎng)過程中未發(fā)現(xiàn)黑曲霉細(xì)胞的泄露，微藻的最終濃度達(dá)到了42.2g/l。

實(shí)施例3

(1)在1l鼓泡塔反應(yīng)器中，加入含50g/l紅薯淀粉的培養(yǎng)基，滅菌并冷卻；

(2)將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的雨生紅球藻以5％(v/v)的接種量接入；

(3)具有淀粉水解活性的大腸桿菌工程菌培養(yǎng)至對數(shù)期后，通過戊二醛交聯(lián)的方法將其固定化，將固定化的微球以微藻細(xì)胞干重12％的菌含量添加到培養(yǎng)液中開始培養(yǎng)；

(4)在30℃、0.1vvm的通氣量以及ph6.5的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集藻液。

處理效果測試：

培養(yǎng)過程中未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞的泄露，微藻的最終濃度達(dá)到了24.1g/l。

實(shí)施例4

(1)在5l板式反應(yīng)器中，加入含5g/l木薯淀粉的培養(yǎng)基，滅菌并冷卻；

(2)將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的三角褐指藻以15％(v/v)的接種量接入；

(3)微小毛霉培養(yǎng)至對數(shù)期后，通過中空纖維包埋的方法將其固定化，將固定化的微球以微藻細(xì)胞干重10％的毛霉含量添加到培養(yǎng)液中開始培養(yǎng)；

(4)在18℃、5vvm的通氣量以及ph7.5的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集藻液。

處理效果測試：

培養(yǎng)過程中未發(fā)現(xiàn)微小毛霉細(xì)胞的泄露，微藻的最終濃度達(dá)到了1.4g/l。

實(shí)施例5

(1)在10l氣升式反應(yīng)器中，加入含30g/l大米淀粉的培養(yǎng)基，滅菌并冷卻；

(2)將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的萊茵衣藻以2％(v/v)的接種量接入；

(3)扣囊覆膜酵母培養(yǎng)至對數(shù)期后，通過角叉菜膠包埋的方法將其固定化，將固定化的微球以微藻細(xì)胞干重15％的酵母含量添加到培養(yǎng)液中開始培養(yǎng)；

(4)在26℃、10vvm的通氣量以及ph8.0的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集藻液。

處理效果測試：

培養(yǎng)過程中未發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞的泄露，微藻的最終濃度達(dá)到了7.6g/l。

實(shí)施例6

(1)在2l三角瓶中，加入含60g/l野生植物塊莖淀粉的培養(yǎng)基，滅菌并冷卻；

(2)將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的布朗葡萄藻以8％(v/v)的接種量接入；

(3)具有淀粉水解活性的釀酒酵母工程菌培養(yǎng)至對數(shù)期后，通過殼聚糖吸附的方法將其固定化，將固定化的微球以微藻細(xì)胞干重8％的菌含量添加到培養(yǎng)液中開始培養(yǎng)；

(4)在28℃、8vvm的通氣量以及ph8.5的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集藻液。

處理效果測試：

培養(yǎng)過程中未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞的泄露，微藻的最終濃度達(dá)到了18.3g/l。

以上實(shí)施例中，微藻的終濃度受微藻種類、反應(yīng)器類型、培養(yǎng)條件的綜合影響，但是綜合各因素沒有明顯的規(guī)律可循。