本發(fā)明屬于食品微生物鑒定與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及即食生鮮果蔬生菜中蠟樣芽孢桿菌的dna提取及微滴數(shù)字pcr快速定量篩查方法。

背景技術(shù)：

即食生鮮蔬菜和水果是食源性致病菌傳播的主要載體之一。目前，質(zhì)檢總局將食品安全的風(fēng)險監(jiān)測列入了民生民計的重大解決問題，影響食品安全的因素有很多，而其中由微生物危害導(dǎo)致的食品安全問題達(dá)到了總量的40％。當(dāng)前中國在食源性病原菌微生物方面面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，急需對潛在危害做出合理的風(fēng)險評估，化被動為主動將危害控制在可接受水平。而目前微生物定量監(jiān)測的技術(shù)手段主要為傳統(tǒng)培養(yǎng)法，費時費力，輔助的實時熒光定量pcr方法，雖在時間上有了很大突破，但其定量結(jié)果的準(zhǔn)確性要依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建的準(zhǔn)確性和引物的擴增效率，而微滴數(shù)字pcr技術(shù)在食源性病原菌上的應(yīng)用，彌補了這一缺陷。

微滴數(shù)字pcr技術(shù)作為第三代pcr技術(shù)，是在傳統(tǒng)pcr方法基礎(chǔ)上采用一種全新的方式進行核酸分子的定量，與實時熒光定量pcr相比，無需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，不受擴增效率的影響，其結(jié)果具有更高的精確度、準(zhǔn)確性和靈敏度。微滴數(shù)字pcr的核心是能夠?qū)⒁环輼悠贩殖?0,000個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子，且每個微滴都作為一個獨立的pcr反應(yīng)器。經(jīng)pcr擴增后，采用微滴分析儀逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，最終根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)，以絕對定量的方式直接“數(shù)”出靶分子的個數(shù)。

蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)是一種兼性需氧的革蘭氏陽性菌，廣泛分布于土壤、空氣和污水中，在各類生熟食品中也常見。炒米飯、牛奶和肉類制品等是其主要污染對象，該菌1950年首次在挪威報告會引起食物中毒，目前已被挪威和荷蘭認(rèn)定為食品中最容易檢出的食源性致病微生物。在我國，蠟樣芽孢桿菌也是常見的食源性致病菌之一，其所致中毒癥狀主要表現(xiàn)為嘔吐和腹瀉，引起的中毒事件往往比較嚴(yán)重。根據(jù)我國食品污染物和食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)在2003年的統(tǒng)計，蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒占所有食物中毒事件的4.0％，為細(xì)菌性食物中毒的第四位。蠟樣芽孢桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法是目前常用檢測方法，但其檢測蠟樣芽孢桿菌的檢驗程序復(fù)雜繁瑣、耗時費力，全過程需至少4～7d，才能得出明確的診斷結(jié)果。因而，建立一種準(zhǔn)確快速的定量檢測蠟樣芽孢桿菌的方法一直是研究的熱點，而微滴數(shù)字pcr的應(yīng)用解決了這一難題，并填補了微滴數(shù)字pcr技術(shù)在蠟樣芽孢桿菌定量檢測上的空白。

研究表明，蠟樣芽孢桿菌的gyrb毒力基因與蠟樣芽孢桿菌的致病性密切相關(guān)，因此在前人研究的基礎(chǔ)上根據(jù)gyrb毒力基因序列合成特異性引物和taqman探針，通過特異性、靈敏度等試驗的優(yōu)化摸索，建立微滴數(shù)字pcr蠟樣芽孢桿菌快速定量檢測方法，以其克服傳統(tǒng)致病微生物檢測方法的諸多不便，并與傳統(tǒng)國家標(biāo)準(zhǔn)方法進行比較，為蠟樣芽孢桿菌定量檢測開辟了新的技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于在大樣本定量篩查即食生鮮生菜中的蠟樣芽孢桿菌時能夠快速、簡便的得到篩查結(jié)果，在第一時間控制食源性致病菌的蔓延，為食品安全突發(fā)事件爭取有效的時間。本發(fā)明的快速篩查方法具有高效、快速、精準(zhǔn)、量化、操作簡便等優(yōu)勢。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：

一種基于微滴數(shù)字pcr方法快速定量篩查生菜中蠟樣芽孢桿菌的方法，其特征在于它按如下步驟進行：

(1)參照國標(biāo)gb4789方法稱取生菜樣品25.0g放入帶濾膜的均質(zhì)袋中，再加入225ml磷酸鹽緩沖液，制成1:10的稀釋液，用均質(zhì)器充分均質(zhì)；

(2)取1:10的稀釋液1ml(或根據(jù)樣品帶菌情況富集離心)，13200rpm，離心10min，棄上清，沉淀應(yīng)用硅膠柱試劑盒法提取生菜細(xì)菌dna；

(3)采用微滴數(shù)字pcr擴增引物及探針引物，對蠟樣芽孢桿菌的dna進行擴增；

其中的微滴數(shù)字pcr反應(yīng)體系為20μl，各成分含量為：2×ddpcrsupermixforprobes預(yù)混液mix預(yù)混液10μl，上下游引物各1.0μl，探針引物1.0μl，模板1μl，無菌超純水補足20μl，混勻后離心。將其小心轉(zhuǎn)移至微卡發(fā)生器，切忌產(chǎn)生氣泡，同時與微卡發(fā)生器相應(yīng)位置加入重油70μl，蓋上墊片，放入微滴生成器中生成微滴。吸取40μl生成的微滴，小心轉(zhuǎn)移至數(shù)字pcr96孔反應(yīng)板中，170℃熱封后在pcr儀上開始循環(huán)，pcr儀爬坡速度設(shè)置為2℃/s，循環(huán)參數(shù)為：95℃，10min；40cycles(94℃，30s，60℃，1min)；98℃，10min。

(4)根據(jù)微滴數(shù)字pcr總微滴數(shù)、陽性微滴數(shù)和樣品每微升拷貝數(shù)分析微滴生成結(jié)果，應(yīng)用公式待測樣品蠟樣芽孢桿菌濃度cfu/ml＝copies/μl×pcr反應(yīng)總體積×細(xì)菌dna提取回溶體積×稀釋倍數(shù)。

本發(fā)明所述的的蠟樣芽孢桿菌，菌株編號為cmcc(b)63301。

為了能更加清楚的說明本發(fā)明的快速篩查方法，下面以即食生鮮果蔬生菜為樣本實例，對本發(fā)明的快速篩查方法加以說明。

一、材料和引物

(1)樣品：羅生3號生菜樣品，由生菜示范基地購置。

(2)主要儀器：高速冷凍離心機，微滴數(shù)字pcr儀，恒溫水浴鍋。

(3)主要試劑：

pcr引物、探針由上海生工公司合成，引物序列見表1。

2×ddpcrsupermixforprobes預(yù)混液，試劑購自伯樂公司。

表1蠟樣芽孢桿菌鑒定定量pcr引物序列

二、生鮮果蔬生菜中細(xì)菌dna提取

(1)參照國標(biāo)gb4789方法稱取羅生3號生菜樣品25.0g放入帶濾膜的均質(zhì)袋中，再加入225ml磷酸鹽緩沖液，制成1:10的稀釋液，用均質(zhì)器充分均質(zhì)；

(2)取1:10的稀釋液1ml(或根據(jù)樣品帶菌情況富集離心)，13200rpm，離心10min，棄上清，沉淀應(yīng)用硅膠柱試劑盒法提取生菜細(xì)菌dna。

三、生菜中蠟樣芽孢桿菌dna的微滴數(shù)字pcr定量篩查試驗：

1、pcr反應(yīng)體系組成：

2×ddpcrsupermixforprobes預(yù)混液10.0μl，上下游引物各1.0μl，探針引物1.0μl，模板1μl，無菌超純水補足20μl，混勻后離心。

2、微滴生成：

將其小心轉(zhuǎn)移至微卡發(fā)生器，切忌產(chǎn)生氣泡，同時與微卡發(fā)生器相應(yīng)位置加入重油70μl，蓋上墊片，放入微滴生成器中生成微滴。吸取40μl生成的微滴，小心轉(zhuǎn)移至數(shù)字pcr96孔反應(yīng)板中，170℃熱封后在pcr儀擴增，pcr儀爬坡速度設(shè)置為2℃/s。

3、pcr反應(yīng)程序：

95℃預(yù)變性10min；40個擴增循環(huán)(94℃，30sec；60℃，1min)；98℃，10min。

4、微滴數(shù)字pcr擴增結(jié)果：

通過拷貝數(shù)，應(yīng)用公式推算羅生生菜樣品蠟樣芽孢桿菌濃度，結(jié)果見附圖1。擴增結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定結(jié)果基本一致。

本發(fā)明具有的積極效果在于：

(1)采用微滴數(shù)字pcr終點定量方法，有效的克服了因傳統(tǒng)方法費時、費力、繁瑣、且檢測周期過長，難以滿足應(yīng)急預(yù)案處理的需要。

(2)本方法最大的優(yōu)點在于其過程快速，簡便，精準(zhǔn)，充分提高了生鮮果蔬生菜中蠟樣芽孢桿菌鑒定的檢測效率。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定過程需要將近1周的時間相比，采用本方法，4小時即可完成樣本篩查的全過程。

(3)采用本發(fā)明方法對生菜樣品進行定量篩查，一次性可篩查的樣本量相比傳統(tǒng)培養(yǎng)法可大大提高。

附圖說明:

圖1為羅生3號生菜樣品中蠟樣芽孢桿菌微滴數(shù)字pcr擴增圖譜；如圖標(biāo)注分別為陽性對照；空白對照；羅生3號生菜樣品；

圖2為紫羅馬生菜樣品中蠟樣芽孢桿菌微滴數(shù)字pcr擴增圖譜；如圖標(biāo)注分別為陽性對照；空白對照；紫羅馬生菜樣品；

圖3為羅生1號生菜樣品中蠟樣芽孢桿菌微滴數(shù)字pcr擴增圖譜；如圖標(biāo)注分別為陽性對照；空白對照；羅生1號生菜樣品；

具體實施方式

為了能更加清楚的說明本發(fā)明的方法，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的描述。

實施例1

以紫羅馬生菜為樣本，采用本發(fā)明方法快速定量篩查蠟樣芽孢桿菌。制備方法如下：

(1)參照國標(biāo)gb4789方法稱取紫羅馬生菜樣品25.0g放入帶濾膜的均質(zhì)袋中，再加入225ml磷酸鹽緩沖液，制成1:10的稀釋液，用均質(zhì)器充分均質(zhì)；

(2)取1:10的稀釋液1ml(或根據(jù)樣品帶菌情況富集離心)，13200rpm，離心10min，棄上清，沉淀應(yīng)用硅膠柱試劑盒法提取生菜細(xì)菌dna。

微滴數(shù)字pcr定量篩查：

1、pcr反應(yīng)體系組成：

2×ddpcrsupermixforprobes預(yù)混液10.0μl，上下游引物各1.0μl，探針引物1.0μl，模板1μl，無菌超純水補足20μl，混勻后離心。

2、微滴生成：

將其小心轉(zhuǎn)移至微卡發(fā)生器，切忌產(chǎn)生氣泡，同時與微卡發(fā)生器相應(yīng)位置加入重油70μl，蓋上墊片，放入微滴生成器中生成微滴。吸取40μl生成的微滴，小心轉(zhuǎn)移至數(shù)字pcr96孔反應(yīng)板中，170℃熱封后在pcr儀擴增，pcr儀爬坡速度設(shè)置為2℃/s。

3、pcr反應(yīng)程序：

95℃預(yù)變性10min；40個擴增循環(huán)(94℃，30sec；60℃，1min)；98℃，10min。

4、微滴數(shù)字pcr擴增結(jié)果：

通過拷貝數(shù)，應(yīng)用公式推算紫羅馬生菜樣品蠟樣芽孢桿菌濃度，結(jié)果見附圖2。擴增結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定結(jié)果基本一致。

實施例2

以羅生1號生菜為樣本，采用本發(fā)明方法快速定量篩查蠟樣芽孢桿菌。制備方法如下：

(1)參照國標(biāo)gb4789方法稱取羅生1號生菜樣品25.0g放入帶濾膜的均質(zhì)袋中，再加入225ml磷酸鹽緩沖液，制成1:10的稀釋液，用均質(zhì)器充分均質(zhì)；

(2)取1:10的稀釋液1ml(或根據(jù)樣品帶菌情況富集離心)，13200rpm，離心10min，棄上清，沉淀應(yīng)用硅膠柱試劑盒法提取生菜細(xì)菌dna。

微滴數(shù)字pcr定量篩查：

1、pcr反應(yīng)體系組成：

2×ddpcrsupermixforprobes預(yù)混液10.0μl，上下游引物各1.0μl，探針引物1.0μl，模板1μl，無菌超純水補足20μl，混勻后離心。

2、微滴生成：

將其小心轉(zhuǎn)移至微卡發(fā)生器，切忌產(chǎn)生氣泡，同時與微卡發(fā)生器相應(yīng)位置加入重油70μl，蓋上墊片，放入微滴生成器中生成微滴。吸取40μl生成的微滴，小心轉(zhuǎn)移至數(shù)字pcr96孔反應(yīng)板中，170℃熱封后在pcr儀擴增，pcr儀爬坡速度設(shè)置為2℃/s。

3、pcr反應(yīng)程序：

95℃預(yù)變性10min；40個擴增循環(huán)(94℃，30sec；60℃，1min)；98℃，10min。

4、微滴數(shù)字pcr擴增結(jié)果：

通過拷貝數(shù)，應(yīng)用公式推算羅生1號生菜樣品蠟樣芽孢桿菌濃度，結(jié)果見附圖3。擴增結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定結(jié)果基本一致。

序列表

<110>天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所

<120>一種基于微滴數(shù)字pcr方法快速定量篩查生菜中蠟樣芽孢桿菌的方法

<160>3

<210>1

<211>22bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctggtatgtatattggatctac22

<210>2

<211>23bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cttcgatactaacattaatttca23

<210>3

<211>27bp

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

acaataacctgcaagtgcttcatcaat27