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      單核苷酸多態(tài)性位點rs3129716在篩查皰疹樣皮炎患者中的應用的制作方法

      文檔序號:12030228閱讀:320來源:國知局

      本發(fā)明涉及生物技術領域中,單核苷酸多態(tài)性位點rs3129716在篩查皰疹樣皮炎患者中的應用。



      背景技術:

      皰疹樣皮炎(dermatitisherpetiformis,dh)是一種由谷膠攝入所引起的一種少見的自身免疫性大皰性皮膚病,其主要特征是瘙癢性多形皮損和真皮乳頭iga的沉積。近來,dh被認為是乳糜泄的特異性皮膚表現(xiàn),原因是dh患者體內存在著循環(huán)iga抗體、表皮轉谷氨酰胺酶抗體及與小腸絨毛萎縮類似的典型的組織學特征。在不同的人群中,dh的發(fā)病率和流行率不同。其中,在白種人中dh較為常見,而在亞洲人群中較罕見。對于中國血統(tǒng)的人群,只有在中國大陸,香港和新加坡報道了一些散發(fā)病例。

      dh的遺傳性還沒有得到很好的認知,但是在多個人群中已報道的hlai類和ii類分子的研究表明了dh的遺傳易感性。dh患者早期階段的病例對照研究表明dh和hla-b8,dr3,和dqw2密切相關。在白種人群的克隆恩病中,超過90%的患者有hla-dq2單倍體型,其余大部分表達hla-dq8,nod小鼠模型證實了這一關聯(lián)。相反的,之前研究的文獻已經(jīng)揭示了白種人和亞洲人dh的明顯的差異,這一差異或許可由日本人群中出現(xiàn)了hla-b8/dr3/dq2單倍體型得到解釋。迄今為止,僅有一項關于中國人群dh的遺傳學研究,發(fā)現(xiàn)hla-b*0801和hla-drb1*0301可能為皰疹樣皮炎相關的風險因子,但并未提供可靠的檢測方法預測dh發(fā)生的風險性。



      技術實現(xiàn)要素:

      本發(fā)明所要解決的技術問題是如何篩查皰疹樣皮炎患者與檢測皰疹樣皮炎易感性。

      為解決上述技術問題,本發(fā)明首先提供了下述a1)-b6)中的至少一種用途:

      a1)檢測人基因組中rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質在制備篩查皰疹樣皮炎患者產(chǎn)品中的應用;

      a2)檢測人基因組中rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質在制備檢測皰疹樣皮炎易感性產(chǎn)品中的應用;

      a3)檢測人基因組中rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質在制備檢測與皰疹樣皮炎相關的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應用;

      a4)檢測人基因組中rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質在制備鑒定或輔助鑒定與皰疹樣皮炎相關的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應用;

      a5)人基因組中rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在制備篩查皰疹樣皮炎患者產(chǎn)品中的應用;

      a6)人基因組中rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在制備檢測皰疹樣皮炎易感性產(chǎn)品中的應用;

      b1)檢測人基因組中rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質在篩查皰疹樣皮炎患者中的應用;

      b2)檢測人基因組中rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質在檢測皰疹樣皮炎易感性中的應用;

      b3)檢測人基因組中rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質在檢測與皰疹樣皮炎相關的單核苷酸多態(tài)性的中的應用;

      b4)檢測人基因組中rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質在鑒定或輔助鑒定與皰疹樣皮炎相關的單核苷酸多態(tài)性的中的應用;

      b5)人基因組中rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在篩查皰疹樣皮炎患者中的應用;

      b6)人基因組中rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在檢測皰疹樣皮炎易感性中的應用的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質在制備檢測皰疹樣皮炎易感性產(chǎn)品中的應用。

      rs3129716是人染色體6p21.32上的一個二等位多態(tài)性的snp位點,該變異是轉換(c/t,在其互補鏈上則為g/a)。所述rs3129716基因型是cc、ct或tt。所述cc是rs3129716位點為c的純合型,所述tt是rs3129716位點為t的純合型,所述ct是rs3129716位點為c和t的雜合型。所述檢測人基因組中rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型具體可為檢測rs3129716的核苷酸種類。

      上述用途中,所述檢測人基因組中rs3129716的多態(tài)性或基因型的物質可為擴增包括rs3129716在內的基因組dna片段的pcr引物對和/或單堿基延伸引物。

      上述用途中,所述cc和所述ct基因型的個體在皰疹樣皮炎患者群體中的比例分別高于對應的基因型在正常人群體中的比例。

      上述用途中,所述皰疹樣皮炎具體可為中國人群皰疹樣皮炎。

      為解決上述技術問題,本發(fā)明還提供了含有檢測人基因組中rs3129716的多態(tài)性或基因型的物質的產(chǎn)品,所述產(chǎn)品為a)-d)中的任一種產(chǎn)品:

      a)檢測與皰疹樣皮炎相關的單核苷酸多態(tài)性(即等位基因)或基因型的產(chǎn)品;

      b)鑒定或輔助鑒定與皰疹樣皮炎相關的單核苷酸多態(tài)性(即等位基因)或基因型的產(chǎn)品;

      c)篩查皰疹樣皮炎患者產(chǎn)品;

      d)檢測皰疹樣皮炎易感性產(chǎn)品。

      上述產(chǎn)品中,所述檢測人基因組中rs3129716的多態(tài)性或基因型的物質可為擴增包括rs3129716在內的基因組dna片段的pcr引物對和/或單堿基延伸引物。

      上述產(chǎn)品中,所述皰疹樣皮炎具體可為中國人群皰疹樣皮炎。

      為解決上述技術問題,本發(fā)明還提供了下述m1)或m2)的方法:

      m1)篩查皰疹樣皮炎患者的方法,包括:檢測待測對象基因組中rs3129716位點的基因型,如rs3129716位點的基因型為cc基因型,所述待測對象為或候選為皰疹樣皮炎患者;如rs3129716位點的基因型為ct基因型,所述待測對象為或候選為皰疹樣皮炎患者;如rs3129716位點的基因型為tt基因型,所述待測對象為或候選為或非皰疹樣皮炎患者;

      m2)檢測皰疹樣皮炎易感性的方法,包括:檢測待測對象基因組中rs3129716位點的基因型,如rs3129716位點的基因型為cc基因型,所述待測對象易感或候選易感皰疹樣皮炎;如rs3129716位點的基因型為ct基因型,所述待測對象易感或候選易感皰疹樣皮炎;如rs3129716位點的基因型為tt基因型,所述待測對象不易感或候選不易感皰疹樣皮炎。

      上述方法中,檢測待測對象基因組中rs3129716位點的基因型可采用所述檢測rs3129716的多態(tài)性或基因型的物質進行。

      上述方法中,所述皰疹樣皮炎具體可為中國人群皰疹樣皮炎。

      實驗證明,rs3129716的風險等位基因為c,該等位基因在皰疹樣皮炎患者群體中的比例顯著高于該等位基因在正常健康人群中的比例。rs3129716的p值是2.10×10-13,且rs3129716的相對危險度是9.7,說明rs3129716是與皰疹樣皮炎相關的單核苷酸多態(tài)性。rs3129716的三個基因型中,ct基因型的個體在皰疹樣皮炎患者群體中的比例高于該基因型的個體在正常人群體中的比例,tt基因型的個體在皰疹樣皮炎患者群體中的比例低于該基因型的個體在正常人群體中的比例。

      本發(fā)明在實際應用中,可將檢測rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質與其它物質(如檢測其它的與皰疹樣皮炎相關的單核苷酸多態(tài)性或基因型的物質)聯(lián)合在一起制備篩查皰疹樣皮炎患者的產(chǎn)品。

      其中,檢測人基因組中rs3129716的多態(tài)性或基因型的物質可為通過下述至少一種方法確定rs3129716的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器:dna測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性、單鏈構象多態(tài)性、變性高效液相色譜、snp芯片、taqman探針技術和sequenommassarray技術。其中,利用sequenommassarray技術確定rs3129716的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器包括pcr引物對、基于單堿基延伸反應的延伸引物、磷酸酶、樹脂、芯片、maldi-tof(matrix-assistedlaserdesorption/ionization–timeoffligh,基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜)和/或sequenommassarray技術所需要的其他試劑和儀器;利用taqman探針技術確定rs3129716的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器包括taqman探針、pcr引物對、定量pcr儀、進行基因分型的模塊和/或taqman探針技術所需要的其他試劑;snp芯片包括基于核酸雜交反應的芯片、基于單堿基延伸反應的芯片、基于等位基因特異性引物延伸反應的芯片、基于“一步法”反應的芯片、基于引物連接反應的芯片、基于限制性內切酶反應的芯片、基于蛋白dna結合反應的芯片和/或基于熒光分子dna結合反應的芯片。在本發(fā)明的一個實施例中,利用的是illumina公司的infiniumhumanexomebeadchip芯片。

      所述產(chǎn)品可為試劑或試劑盒,還可為由試劑或試劑盒和儀器組成的系統(tǒng),如由引物和dna測序儀組成的系統(tǒng),由pcr試劑和dna測序試劑和dna測序儀組成的系統(tǒng),由taqman探針、pcr引物對、定量pcr儀和進行基因分型的模塊以及taqman探針技術所需要的其他試劑組成的系統(tǒng),由探針、pcr引物對以及連接酶檢測反應(ldr)所需要的其他試劑和儀器組成的系統(tǒng),由pcr引物對、單堿基延伸引物、芯片、pcr儀、進行基因分型的模塊和/或sequenommassarray技術所需要的其他試劑和儀器組成的系統(tǒng)。

      采用pcr引物擴增包括rs3129716在內的基因組dna片段,以得到的pcr擴增產(chǎn)物為模板,采用單堿基延伸引物進行單堿基延伸反應,對得到的延伸產(chǎn)物的序列進行檢測,確定rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)和基因型。所述pcr引物在序列上沒有特殊要求,只要能擴增出包括rs3129716在內的基因組dna片段即可,具體可為序列表中序列1和序列2所示的單鏈dna。所述延伸引物根據(jù)人基因組中rs3129716上游(不包括該snp位點)設計,所述延伸引物的最后1位核苷酸對應于人基因組中rs3129716的前1位核苷酸。

      本發(fā)明中,所述pcr引物對可由rs3129716_w1_f和rs3129716_w1_r組成;

      所述rs3129716_w1_f是如下a1)至a4)中的任一種單鏈dna:

      a1)序列表中序列1所示的單鏈dna;

      a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈dna;

      a3)與a1)或a2)限定的單鏈dna具有85%以上的同一性的單鏈dna;

      a4)在嚴格條件下與a1)或a2)限定的單鏈dna雜交的單鏈dna;

      所述rs3129716_w1_r是如下b1)至b4)中的任一種單鏈dna:

      b1)序列表中序列2所示的單鏈dna;

      b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈dna;

      b3)與b1)或b2)限定的單鏈dna具有85%以上的同一性的單鏈dna;

      b4)在嚴格條件下與b1)或b2)限定的單鏈dna雜交的單鏈dna。

      所述單堿基延伸引物(rs3129716_w1_e)可為如下c1)至c4)中的任一種單鏈dna:

      c1)序列表中序列3所示的單鏈dna;

      c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈dna;

      c3)與c1)或c2)限定的單鏈dna具有85%以上的同一性的單鏈dna;

      c4)在嚴格條件下與c1)或c2)限定的單鏈dna雜交的單鏈dna。

      所述添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈dna可為添加一至十個核苷酸得到的單鏈dna。

      這里使用的術語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?!巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的序列1、序列2或序列3所示的核苷酸序列具有85%或更高,或90%或更高,或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件,兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(%)表示,其可以用來評價相關序列之間的同一性。

      所述嚴格條件是在2×ssc,0.1%sds的溶液中,在68℃下雜交并洗膜2次,每次5min,又于0.5×ssc,0.1%sds的溶液中,在68℃下雜交并洗膜2次,每次15min;或,0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1%sds的溶液中,65℃條件下雜交并洗膜。

      上述85%以上同一性,可為85%、90%或95%以上的同一性。

      在本發(fā)明的實施例中,rs3129716應用sequenom基因分型平臺即分子量陣列技術,sequenomsnp檢測過程結合多重pcr技術、massarrayiplex單堿基延伸技術,和基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析質譜技術(matrix-assistedlaserdesorption/ionization–timeofflight,maldi-tof)進行分型檢測。將包含snp位點區(qū)域的dna模板通過pcr技術擴增,再使用特異的延伸引物與pcr產(chǎn)物進行單堿基延伸反應。由于多態(tài)性位點堿基不同,延伸產(chǎn)物不同的末端堿基將導致延伸后的產(chǎn)物分子量的差異,因此由snp多態(tài)性引起的堿基差異通過分子量的差異而體現(xiàn),通過基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析質譜技術,檢測延伸產(chǎn)物分子量的大小,應用專用的分析軟件,通過判斷分子量的差異而進行snp分型檢測。

      本發(fā)明在一個來自中國人群的樣本(36例皰疹樣皮炎患者和720例健康者)中發(fā)現(xiàn)rs3129716是與皰疹樣皮炎相關的單核苷酸多態(tài)性。可將檢測rs3129716的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質與其它物質(如檢測其它的與皰疹樣皮炎相關的單核苷酸多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質)聯(lián)合在一起制備篩查皰疹樣皮炎患者的產(chǎn)品。

      具體實施方式

      下面結合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述,給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明,而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

      下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。

      下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。

      實施例1、rs3129716是與皰疹樣皮炎相關的單核苷酸多態(tài)性

      研究對象

      全基因組關聯(lián)分析(genome-wideassociationstudy,gwas)發(fā)現(xiàn)階段的研究對象包括24例皰疹樣皮炎患者(dh患者)和480例正常對照,驗證階段包括12例皰疹樣皮炎患者(dh患者)和244例正常對照。所有研究對象均來自于中國人群。

      病例組所有皰疹樣皮炎患者符合以下3條:1)臨床特點:紅斑基礎上的簇集性小水皰;2)免疫學檢查包括皮膚活檢組織的直接免疫熒光與血漿樣本的間接免疫熒光證實其為皰疹樣皮炎患者;3)elisa分析證實其為皰疹樣皮炎患者。

      對照組所有正常對照都被臨床證實無自身免疫性疾病。

      所有患者和對照的特點見表1。年齡分布、性別比例在病例組和對照組中均無顯著差異。

      表1、研究設計的樣本臨床資料

      注:表1中na表示無相應的病程、檢測或癥狀。

      本研究經(jīng)山東省皮膚病性病防治研究所倫理審查委員會批準。所有研究對象都已簽署知情同意書。

      所用樣本為每位患者的大約2ml全血,提取基因組dna用于基因型分析。

      發(fā)現(xiàn)階段(第一階段)

      對發(fā)現(xiàn)階段的24例dh患者、480例正常對照應用涵蓋900015個snps的illuminaomnizhonghua芯片進行基因分型。在進一步分析時排除了總體基因分型率<96%或雜合體率超過平均值±3s.d.的樣本(4例對象);通過繼承等同分析(ibd)(pi_hat>0.25)確定可能的重復樣本或親戚樣本也被排除。滿足下列條件的snps也被排除:(i)沒有映射到常染色體;(ii)callrate<90%;(iii)maf<0.01;(iv)對照中snp的基因型分布與hardy-weinberg平衡的預測值(p<10-5)相偏離。在對樣本和snp進行質量過濾后,得到了包含24例dh患者及476例對照中的43826個常見獨立的snps(r2<0.1)的數(shù)據(jù)集,將這些數(shù)據(jù)以及來自yri(來自尼日利亞,伊巴丹的約魯巴人;n=90),ceu(來自北歐和西歐的猶太人;n=90),chb(n=45)和jpt(n=44)的hapmap樣本一起進行pca分析,排除了0個異常的樣本。發(fā)明人對剩余的病例和對照樣本進行了另一輪pca,結果顯示病例和對照都匹配很好。經(jīng)過質量控制階段,一共有24例dh及476例對照的806342個snps被納入到全基因組snp推算。對于那些基于千人組計劃的基準(2012年3月發(fā)布)而未分型的snps,發(fā)明人應用shapeit(delaneauetal.,2013)和impute_v2(howieetal.,2009)來定相和推算。低推算置信度(infoscore<0.8),顯著的hardy-weinberg連鎖不平衡(p<10-5)或maf<5%的snps被排除于進一步的分析之外。最終,在gwas發(fā)現(xiàn)階段一共有24例dh及476例對照對照中的5546030個snps被分型和推算。

      snp驗證階段(第二階段)

      發(fā)明人選取了32個發(fā)現(xiàn)階段關聯(lián)分析中p<10-4的snps,在另一獨立樣本中選擇12例dh患者和244例正常對照的獨立樣本中進行驗證。在32個snps中,一共有21個snps被成功分型,callrate>90%且無顯著hwe偏離(p>0.0003)。

      其中,屬于21個snps中的rs3129716為是人染色體6p21.32上的一個二等位多態(tài)性的snp位點,該變異是轉換(c/t,在其互補鏈上則為g/a),rs3129716進行snp分型所用引物序列如下:

      rs3129716_w1_f(正向引物):acgttggatggaaggtggatgtattttgcc(序列1)

      rs3129716_w1_r(反向引物):acgttggatggatgccagaaatgagcaacc(序列2)

      rs3129716_w1_e(延伸引物):cctcctactttgggatg(序列3)

      rs3129716snp分型的具體操作步驟如下:

      采用sequenommassarray(sandiego,usa)平臺驗證,每個樣本約用到15ngdna。首先提取外周血的基因組dna,標準化后,樣本dna經(jīng)多重pcr反應擴增包括snp位點在內的基因組dna片段,擴增產(chǎn)物進行snp位點特異性單一鏈的延伸,延伸產(chǎn)物脫鹽并轉移到384孔的芯片上。質譜儀(maldi-tofms)進行等位基因的檢測,采用sequenommassarray分型軟件對檢測結果進行分析。

      1、全血標本采集

      在患者知情同意,并簽署書面同意書的情況下采集研究對象外周靜脈血5ml,放置于edtana2抗凝管中,置-80℃冰柜儲存?zhèn)溆谩?/p>

      2、dna濃度標準化包括如下步驟:

      1)利用nanodrop-1000濃度測試儀準確測定每一份需要標準化的樣本dna濃度和od比值(a260/a280、a260/a230)。

      2)建立電子表格,排定每個樣本孔需要加入的dna編號。

      進行sequenommassarray分型的樣本,在每96孔板上留有空白對照和重復樣本對照。

      3)按照電子表格的順序,加入已測定濃度的dna。

      對于進行sequenommassarray分型的樣本要求實驗濃度為12-30ng/μl,一般以18ng/μl為佳。并且a260/a280比值介于1.5-2.0之間、a260/230介于1.5-2.3,如dna濃度高于18ng/μl則加入適量fg3,將濃度標化至18ng/μl;如dna濃度低于12ng/μl,則重新從血液提取合格的dna。濃度在12—18ng/μl間直接加入。

      離心后貼上粘性錫箔紙,并用標記筆標上樣本板標號、樣本類型、來源地等信息。

      4)在平板離心機上,3000g離心3分鐘,存放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

      3、利用正向引物和反向引物進行pcr。

      4、利用延伸引物進行snp位點特異性單一鏈的延伸反應。

      其中,延伸引物根據(jù)人基因組中snp位點上游(不包括該snp位點)設計,所述延伸引物的最后1位核苷酸對應于人基因組中該snp位點的前1位核苷酸。

      5、數(shù)據(jù)質量控制

      1)對分型的snp進行callrate計算,去除callrate<95%的snp或等位基因頻率<0.01的snps;

      2)對snp進行遺傳平衡檢驗,去除偏離遺傳平衡定律的snp(對照樣本中hardy-weinberg平衡檢驗的p≦0.001)。

      3)在sequenommassarray系統(tǒng)中查看snp的分型聚類圖,去除聚類圖分堆不清的snp。

      4)樣本質控:直接去除分型失敗的樣本。

      將通過質控的樣本和snp進行統(tǒng)計分析。

      6、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

      利用plink1.07軟件對分型成功并通過質控的snp在病例組和對照組做基因表型相關性分析,用cochran-armitagetrend檢驗每個樣本的基因型和表型的關聯(lián)性,然后用cochran-mantel-haenszel綜合分析所有樣本的基因型和表型的相關性。用q檢驗來評價個體間的異質性,本次實驗中,以p<0.05作為檢驗水準。多重logistic回歸分析用于檢測區(qū)域內的信號的獨立性。檢驗水準α以0.05除以通過質量控制的snp數(shù)目為檢驗水準。q檢驗用于評估遺傳異質性的顯著性,對snp校正檢測后p值小于0.05者視為有顯著遺傳異質性。

      在共計36例皰疹樣皮炎(dh)患者和720例正常對照中,通過分析rs3129716與皰疹樣皮炎的相關性,結果發(fā)現(xiàn)rs3129716是與皰疹樣皮炎相關的風險位點,rs3129716的p值是2.10×10-13,or值為9.7。

      表2、snp在dh患者和正常對照群體中的等位基因頻率(%)

      表2中,f_a為等位基因a在dh患者中的頻率,f_u為等位基因t在dh患者中的頻率。

      由表2可知,rs3129716的三個基因型中,ct基因型的個體在dh患者群體中的比例高于該基因型的個體在正常人群體中的比例,tt基因型的個體在dh患者群體中的比例低于該基因型的個體在正常人群體中的比例。

      rs3129716的風險等位基因為c,該等位基因在發(fā)現(xiàn)階段dh患者中的基因頻率為25.0%,在正常對照中的基因頻率為3.5%;c等位基因在第二階段dh患者中的基因頻率為25.0%,在正常對照中的基因頻率為2.9%;合并分析發(fā)現(xiàn)c等位基因在dh患者中的基因頻率為25.0%,在正常對照中的基因頻率為3.3%,c等位基因在dh患者中的比例顯著高于其在正常對照中的比例,顯著性分析p值為2.10e-13,or為9.7?;仡櫺灶A測分析發(fā)現(xiàn)其預測敏感度為50.0%,特異度為93.3%。實驗結果表明,rs3129716多態(tài)性或基因型或等位基因頻率可用于dh患者的篩查。

      <110>山東省皮膚病性病防治研究所

      <120>單核苷酸多態(tài)性位點rs3129716在篩查皰疹樣皮炎患者中的應用

      <160>3

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