本發(fā)明涉及一種多環(huán)芳烴污染土壤中外源降解菌的施加方法，特別涉及一種針對多環(huán)芳烴污染土壤及環(huán)境中外源降解菌定量、特異檢測及施加的方法，屬于土壤微生物檢測技術領域。

背景技術：

有機污染土壤的生物修復法因具有成本低、無二次污染、可大面積應用等優(yōu)點受到廣泛關注。生物強化法是生物修復的重要手段之一，其主體是人為投加有高效降解能力的降解菌或菌群。外源降解菌進入污染環(huán)境后，會受污染物脅迫，并與土著菌競爭，其存活和增殖情況在整個修復期內(nèi)呈現(xiàn)動態(tài)變化。通過對降解菌進行實時定量的追蹤，可準確了解其進入環(huán)境后的存活和增殖情況，從而改進修復時菌劑的投加量和投加方式，提高修復效果。因此有必要開發(fā)出針對特定外源降解菌在環(huán)境中的數(shù)量檢測方法。

傳統(tǒng)的微生物數(shù)量檢測方法有稀釋平板法、血球計數(shù)板法等，但這些方法只能對樣品中的全部微生物進行無差別的計數(shù)，無法對樣品中的微生物進行準確的種屬區(qū)分，因此無法排除環(huán)境樣品中土著微生物的干擾對特定菌株進行數(shù)量檢測。

實時熒光定量pcr技術具有靈敏性高、精確性好、特異性強和安全快速等優(yōu)點，已被應用于檢測環(huán)境樣品中的目標微生物。但目前基于實時熒光定量pcr技術對有機污染土壤及其他環(huán)境樣品中微生物的定量方法多以16s/18srdna或功能基因為目的基因，研究多集中于某類或某幾類土著降解菌，缺少對某種特定外源降解菌進入環(huán)境后的數(shù)量分布情況的關注。其主要技術難點在于針對能夠高效處理有機污染物的外源微生物菌株，需要找到該微生物菌株與土著降解菌及土著同種屬菌具有差異的特異性基因序列及特異性引物。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種多環(huán)芳烴污染土壤中外源降解菌的施加方法。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種多環(huán)芳烴污染土壤中外源降解菌的施加方法，步驟如下：

(1)采集土壤樣品，測定含水率，-20℃以下保存；

(2)提取樣品中的基因組dna，制得dna模板；

(3)對步驟(2)制得的dna模板進行實時熒光定量pcr擴增，上游引物核苷酸序列如seqidno.1所示，下游引物核苷酸序列如seqidno.2所示，然后根據(jù)標準曲線，計算目標菌數(shù)量；所述標準曲線如下：

y＝-3.365x+37.624；

其中：r²＝0.9999，y為實時熒光定量pcr反應的ct值，x為菌的標準質(zhì)?？截悢?shù)對數(shù)值；

(4)調(diào)整土壤含水率至20-50％，疏松土壤，根據(jù)土壤多環(huán)芳烴污染物含量及土壤營養(yǎng)元素含量，添加氮磷肥料，調(diào)節(jié)污染土壤的碳、氮、磷的摩爾比為(100～120)：(5～10)：1，投加外源假單胞菌(psedomonassp.)ppz-1的數(shù)量至10⁹cfu/g土，隔周翻攪一次，維持土壤含水率20～50％，每周檢測外源降解菌的數(shù)量及多環(huán)芳烴殘留量，當外源降解菌數(shù)量低于10⁷cfu/g土時，補加外源假單胞菌(psedomonassp.)ppz-1的數(shù)量至10⁹cfu/g土，直至多環(huán)芳烴殘留量達到處理要求。

所述外源假單胞菌(psedomonassp.)ppz-1分離自多環(huán)芳烴污染土壤，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號cgmccno.12596。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，熒光定量pcr擴增的反應體系如下，總體系20μl：

2×sybrgreenqpcrmastermix10μl；濃度10μm的上游引物0.4μl；濃度10μm的下游引物0.4μl；ddh207.2μl；dna模板2μl；

所述熒光定量pcr擴增的反應條件如下：

95℃預變性3min；95℃變性15s，57℃退火20s，72℃延伸30s，45個循環(huán)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中，多環(huán)芳烴為菲。

有益效果

本發(fā)明首次通過利用實時熒光定量pcr的方法特異性監(jiān)測土壤中外源多環(huán)芳烴降解菌假單胞菌(psedomonassp.)ppz-1，并通過控制土壤中的外源多環(huán)芳烴降解菌的菌量實現(xiàn)快速降解土壤中多環(huán)芳烴的目的。

附圖說明

圖1、瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中：1、2、3、4分別對應實施例1中引物組1、引物組2、引物組3和引物組4，土1為濟南土，土2為浙江土；

圖2、實時熒光定量pcr擴增曲線圖；

圖3、實時熒光定量pcr熔解曲線圖；

圖4、實時熒光定量pcr標準曲線圖；

圖5、土壤中ppz-1數(shù)量變化圖。

具體實施方式

下面結合實施例本發(fā)明的技術方案做進一步說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。

生物材料來源

假單胞菌(psedomonassp.)ppz-1分離自多環(huán)芳烴污染土壤，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號cgmccno.12596；

土壤基因組dna抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

實施例1特異性基因序列的篩選與引物設計

根據(jù)菌株ppz-1基因組測序結果，將編碼基因分別在通用功能數(shù)據(jù)庫go(geneontology)、kegg(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)、cog(clusteroforthologousgroupsofproteins)、nr(non-redundantproteindatabase)、pfam和swiss-prot等進行blast比對，篩選未注釋到的基因序列，這些序列即為該菌株可能的特異性基因序列；標記為基因片段1、基因片段2、基因片段3、基因片段4。序列分別如seqidno.4、seqidno.1、seqidno.5和seqidno.6所示。

針對以上基因序列分別設計引物，基因片段1的引物記為引物組1，核苷酸序列如下所示：

f：tctccgccgcccagataa；r：tggatgtcccgttgaagc

基因片段2的引物記為引物組2，核苷酸序列如下所示：

f：gcgggaggtgttgctgtt；r：cctattgcccttgcgttc

基因片段3的引物記為引物組3，核苷酸序列如下所示：

f：cgggttatgggcagcaga；r：ggttggcaaacaggaagtca

基因片段4的引物記為引物組4，核苷酸序列如下所示：

f：ccctgagcagcgtgaaag；r：cattgcccaccgccatac

實施例2

分別利用上述引物對假單胞菌(psedomonassp.)ppz-1及2種多環(huán)芳烴污染土樣dna進行pcr擴增，擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。

基因組dna采用土壤基因組dna抽提試劑盒進行抽提制備模板dna。

所述pcr擴增體系如下，總體系共25μl：

模板dna0.5μl；濃度10μm的引物f0.5μl；濃度10μm的引物r0.5μl；濃度10mm的dntp0.5μl；10×taqbuffer2.5μl；濃度25mm的mgcl22μl；濃度5u/μl的taq酶0.2μl；h2o18.3μl；

pcr反應條件為：95℃預變性3min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃修復延伸8min。

電泳條件為：1.5wt％瓊脂糖凝膠，1×tae，150v，100ma，20min。

結果如圖1所示，1、2、3、4分別對應上述引物組1、2、3、4，土1、土2分別為濟南土和浙江土。結果表明，引物組2具有較好的特異性。

對引物組2通過ncbiblast進行了特異性檢驗，無顯著匹配結果，表明該組引物在ncbi數(shù)據(jù)庫中是特異的，基因序列具體如下：

atgttctcccatgagtctcgcaggccccgtgccgggtgggtagtgacggttcacctctggtggcagatgcgtggaatgttggaccaagtggcgcacttccacttggaaaaattcatcagcgcaggtttgcgcgggtttttctcgggggcgggaggtgttgctgttcaggcagcgtgtttgttcggcgcgaacttgcagttcggtaattttgagggggtaatgcttcctgctaatcagttcgttgtaccctgcatcgttgccttgatagagttcagtgaacgcaagggcaataggccccgcacaatggttggccactttccctaccccgtcagtgtctag。

由上述基因序列設計的特異性引物序列為：

f：gcgggaggtgttgctgtt；seqidno.1

r：cctattgcccttgcgttc；seqidno.2

實施例3實時熒光定量pcr標準曲線的制備

構建質(zhì)粒，10倍梯度稀釋構建好的各質(zhì)粒，90μl稀釋液+10μl質(zhì)粒。

實時熒光定量pcr擴增體系如下，總體系20μl：

2×sybrgreenqpcrmastermix10μl；10μm濃度的引物f0.4μl；10μm濃度的引物r0.4μl；ddh2o7.2μl；dna模板2μl。

實時熒光定量pcr反應條件為：

95℃預變性3min；95℃變性15s，57℃退火20s，72℃延伸30s，45個循環(huán)。

梯度稀釋樣品擴增曲線如圖2所示，從左到右標準品濃度依次為1.73×10⁸、1.73×10⁷、1.73×10⁶、1.73×10⁵、1.73×10⁴、1.73×10³copies/μl。

梯度稀釋樣品擴增曲線如圖2所示，曲線較光滑，為典型s型，各循環(huán)ct值間隔均勻。

梯度稀釋樣品熔解曲線如圖3所示，曲線峰值單一，峰值在84.73℃。

標準曲線結果如圖4所示，縱坐標是ct值；橫坐標logco，logco是指log濃度即取濃度的對數(shù)，slope＝-3.365；

擴增效率：e＝10^-1/斜率-1＝10^-1/-3.365-1＝98.233％；

相關系數(shù)：r²＝0.9999y-inter＝37.624。

實施例4

定量檢測多環(huán)芳烴污染土壤中降解菌假單胞菌(psedomonassp.)ppz-1數(shù)量

向多環(huán)芳烴污染土1(濟南土，sj)和土2(浙江土，sz)中分別投加活化后的ppz-1菌液并混合均勻，投加量分別為2×10⁹、2×10⁷、2×10⁵、2×10³cfu/g，樣品編號分別為0、2、4、6，同時設不加菌的土樣對照，記作ck。使用上海生工b618763磁珠法土壤基因組dna抽提試劑盒提取dna，將其稀釋適當倍數(shù)上機進行實時熒光定量pcr檢測。檢測結果如下：

表1土壤中ppz-1的數(shù)量

結果顯示該定量方法所檢測出的多環(huán)芳烴降解菌ppz-1的數(shù)量與理論投加量基本一致，且土壤背景中檢測不到該菌存在，說明該檢測方法能較準確地反映土壤中ppz-1的數(shù)量。

實施例5

定量方法在污染土壤生物修復過程中的應用

從濟南農(nóng)田中采集土樣，按重量比0.1％加入菲，混勻。添加氮磷肥料，調(diào)節(jié)污染土壤的碳、氮、磷的摩爾比為(100-120)：(5-10)：1，調(diào)整土壤含水率至20-50％，疏松土壤，按10⁹cfu/g土的比例加入外源降解菌劑，混合均勻。隔周翻攪一次，維持土壤含水率20-50％。同時設置自然衰減對照(不添加肥料，不添加外源降解菌劑)。每周檢測外源降解菌的數(shù)量及菲殘留量。

按照如下處理方法進行處理：

處理一：當外源降解菌數(shù)量低于初始投加量2個數(shù)量級時，補加與初始劑量相同的菌劑；

處理二：不補加菌劑。

經(jīng)過2個月的修復，處理一的菲去除率為91.5％，處理二的菲去除率為73.2％。2個月間土壤中外源菌數(shù)量變化見圖5。

結果分析

圖5顯示，ppz-1在投加入土壤之后，數(shù)量有緩慢下降趨勢，在第6周時，數(shù)量由初始的2.0e+09降至3.2e+07，此時處理一補加ppz-1(2.0e+09cfu/g土)強化修復，處理二未補加。修復至第8周，處理一的菲去除率比處理二高出18.3％。在修復過程中對投加的外源降解菌進行實時監(jiān)測，可以通過及時補加保證外源降解菌數(shù)量維持在較高水平，從而在相同修復時間內(nèi)使外源菌發(fā)揮最大效果，獲得更高的污染物去除率，而在其他節(jié)點投加效果均較差，無法達到較處理二高出18.3％的技術效果。

sequencelisting

<110>山東省科學院生態(tài)研究所

<120>一種多環(huán)芳烴污染土壤中外源降解菌的施加方法

<160>2

<170>patentinversion3.5

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<213>人工合成

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