本發(fā)明涉及體外核酸檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及焦磷酸測(cè)序領(lǐng)域，具體涉及一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)tollip基因分型的引物對(duì)及試劑盒。
背景技術(shù)：
：特發(fā)性肺纖維化(ipf)是一種慢性、進(jìn)行性、纖維化性間質(zhì)性肺疾病，病變局限在肺臟，好發(fā)于中老年人群，其肺組織學(xué)和/或胸部高分辨率ct(hrct)特征性表現(xiàn)為普通型間質(zhì)性肺炎(uip)，病因不清。按病程有急性、亞急性和慢性之分，多為散發(fā)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年整體人群中的患病率約(2-29)/10萬(wàn)，且呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)，估計(jì)以每年11％的比例增長(zhǎng)。在美國(guó)特發(fā)性肺纖維化患者大約有100000人，歐盟地區(qū)大約有110000人，而且每年歐盟地區(qū)新增ipf患者35000人。日本每年整體人群中的ipf患病率約(2.23-10)/10萬(wàn)，實(shí)際值遠(yuǎn)高于這個(gè)數(shù)目。作為一種慢性間質(zhì)性肺病，ipf起病隱匿、病情逐漸加重，也可表現(xiàn)為急性加重。ipf診斷后的平均生存期僅2.8年，死亡率高于大多數(shù)腫瘤，ipf被稱為一種“類腫瘤疾病”。其中位生存期只有3年，生存率類似于許多癌癥，預(yù)后差且缺乏有效的治療。目前，除肺移植外，尚無(wú)證據(jù)證實(shí)哪一種藥物能夠有效的治療ipf，有少數(shù)研究提示某些藥物對(duì)ipf患者可能有益。近年來(lái)，大規(guī)模的全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)強(qiáng)調(diào)出基因多態(tài)性的重要性，tollip基因已經(jīng)證實(shí)與ipf易感性和生存有關(guān)。具研究標(biāo)明tollip(rs3750920)tt基因型患者與安慰劑組相比改善生存，cc基因型患者nac治療較差，ct基因型與安慰劑組患者生存區(qū)間相似。焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)是基于聚合原理的dna測(cè)序法，具備同時(shí)對(duì)大量樣品進(jìn)行測(cè)序分析的能力，并具有高通量、特異性高、快速、直觀及低成本的優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)有技術(shù)中并沒有利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)tollip基因分型的產(chǎn)品，而其他的檢測(cè)方法靈敏度和特異性均不高，在檢測(cè)tollip基因分型時(shí)不能夠快速準(zhǔn)確的進(jìn)行檢測(cè)，且成本較高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種焦磷酸測(cè)序法對(duì)tollip基因分型進(jìn)行檢測(cè)的引物對(duì)以及試劑盒，能夠快速準(zhǔn)確的檢測(cè)tollip的基因分型，成本低，靈敏度高，針對(duì)tollip的特異性強(qiáng)。本發(fā)明的一方面提供了一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)tollip基因分型的引物對(duì)，所述引物對(duì)包括：tollip正向擴(kuò)增引物：5’-gcgtaggacatgacgaggtt-3’(seqidno.1)；tollip反向擴(kuò)增引物：5’-agccctgttccacagataagac-3’(seqidno.2)；tollip測(cè)序引物：5’-gcctggacccacatcacc-3’(seqidno.3)；其中，所述tollip正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物的5’端分別進(jìn)行生物素標(biāo)記。本發(fā)明的另一方面提供了一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)tollip基因分型的試劑盒，所述tollip基因檢測(cè)的多態(tài)性位點(diǎn)為rs3750920，所述試劑盒包括pcr反應(yīng)液；所述pcr反應(yīng)液包括:tollip正向擴(kuò)增引物：5’-gcgtaggacatgacgaggtt-3’；tollip測(cè)序引物：5’-gcctggacccacatcacc-3’；tollip反向擴(kuò)增引物：5’-agccctgttccacagataagac-3’；其中，所述tollip正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物的5’端分別進(jìn)行生物素標(biāo)記。作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述試劑盒還包括tollip陽(yáng)性對(duì)照品，tollip陽(yáng)性對(duì)照品1為插有seqidno.4所示核苷酸序列的tollip野生純合子質(zhì)粒；tollip陽(yáng)性對(duì)照品2為插有seqidno.5所示核苷酸序列的tollip突變純合子質(zhì)粒；tollip陽(yáng)性對(duì)照品3為tollip野生純合子質(zhì)粒和突變純合子質(zhì)粒組成的混合物；其中，質(zhì)粒載體為pmd18-t，所述tollip陽(yáng)性對(duì)照品3中，tollip野生純合子質(zhì)粒和tollip突變純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述試劑盒還包括質(zhì)控品和空白對(duì)照品，所述質(zhì)控品的controloligo為自帶測(cè)序引物，序列為：tayggtttgca(seqidno.6)；空白對(duì)照品為dnase/rnase-free水。本發(fā)明的再一方面提供了上述引物對(duì)在制備用于檢測(cè)tollip基因分型的試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的又一方面提供了應(yīng)用上述試劑盒檢測(cè)tollip基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟：(1)dna提??；(2)聚合酶鏈反應(yīng)：配制50μlpcr擴(kuò)增體系，包含：10×pcrbuffer8.0μl，dntp5.0μl，tollip正向擴(kuò)增引物0.5μl，tollip反向擴(kuò)增引物0.5μl，rtaq0.5μl，水33.5μl，模板2.0μl；循環(huán)程序?yàn)椋?5℃5min預(yù)變性；依次在95℃30s，57℃30s，72℃45s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃保持3min，最終保持在4℃，得擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)焦磷酸測(cè)序單鏈樣本純化；(4)焦磷酸測(cè)序及結(jié)果分析。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于，1、本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，試劑盒適用于對(duì)tollip基因多態(tài)性進(jìn)行快速檢測(cè)，具有定性準(zhǔn)確，靈敏度高及特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；2、本發(fā)明的焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)tollip基因分型的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，樣品處理簡(jiǎn)單，測(cè)序步驟簡(jiǎn)單，測(cè)序速度快，半個(gè)小時(shí)完成一次上機(jī)反應(yīng)，直接給出檢測(cè)位點(diǎn)頻率分析，結(jié)果直觀；3、本發(fā)明的試劑盒針對(duì)tollip基因特異性高，可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行短dna序列分析，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程；具有高通量、低成本等特點(diǎn)；pcr產(chǎn)物即可直接用于測(cè)序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡(jiǎn)便，所需樣品量小。附圖說(shuō)明圖1為臨床樣品tollip野生型的焦磷酸測(cè)序圖；圖2為臨床樣品tollip突變純合型的焦磷酸測(cè)序圖；圖3為臨床樣品tollip突變雜合型的焦磷酸測(cè)序圖；圖4為質(zhì)控品的焦磷酸測(cè)序圖；圖5為空白對(duì)照品的焦磷酸測(cè)序圖。具體實(shí)施方式下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例1試劑盒的制備1、引物設(shè)計(jì)tollip正向擴(kuò)增引物：5’-gcgtaggacatgacgaggtt-3’(seqidno.1)，tollip反向擴(kuò)增引物：5’-agccctgttccacagataagac-3’(seqidno.2)，tollip測(cè)序引物：5’-gcctggacccacatcacc-3’(seqidno.3)；其中，所述tollip正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物的5’端分別進(jìn)行生物素標(biāo)記。2、對(duì)照品的選擇人工合成寡聚核苷酸鏈tayggtttgcacontrololigo為質(zhì)控品3、pcr反應(yīng)液組成：10×pcrbuffer8.0μl，dntp5μl，水33.5μl。實(shí)施例2應(yīng)用上述試劑盒檢測(cè)tollip基因多態(tài)性的方法1、樣品檢測(cè)取pcr反應(yīng)液，加入溶好的引物、taqdna聚合酶，分裝體系，加入樣品dna、空白對(duì)照品或陽(yáng)性對(duì)照品為模板，組成pcr反應(yīng)體系。按照pcr反應(yīng)程序進(jìn)行pcr擴(kuò)增。tollip檢測(cè)體系各主要成分分別如下：pcr反應(yīng)液：10×pcrbuffer8.0μl，dntp5μl，水33.5μl；tollip正、反向擴(kuò)增引物各0.5μl；taq酶0.5μl；檢測(cè)樣品2μl；總體積50μl。該體系反應(yīng)程序如下：擴(kuò)增完成之后，瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)pcr結(jié)果，以進(jìn)行下一步程序。2、焦磷酸測(cè)序按照焦磷酸測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行測(cè)序操作，主要步驟為：樣品的制備和純化，然后將純化后的樣品加入含有退火液和測(cè)序引物的mix中上機(jī)測(cè)序。焦磷酸測(cè)序儀試劑倉(cāng)中加入運(yùn)行程序相應(yīng)的datp、dttp、dctp、dgtp、酶混合物、底物混合物。質(zhì)控品controloligo自帶測(cè)序引物，最終濃度為0.2μm。3、結(jié)果分析質(zhì)控品堿基檢出率為100％；空白對(duì)照品檢測(cè)不到堿基頻率。結(jié)果如圖1-5所示，樣品結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：樣品檢測(cè)結(jié)果報(bào)告結(jié)果1tollip(c≧90％，t≦10％)野生型2tollip(40％≦c≦60％，40％≦t≦60％)雜合突變型3tollip(t≧90％，c≦10％)純合突變型其中，圖1顯示的是臨床樣本檢測(cè)結(jié)果tollip的野生型；圖2顯示的是臨床樣本檢測(cè)結(jié)果tollip的雜合突變型；圖3顯示的是臨床樣本檢測(cè)結(jié)果tollip的純合突變型；圖4顯示的是質(zhì)控品的焦磷酸測(cè)序圖；圖5顯示的是空白對(duì)照的焦磷酸測(cè)序圖，綜上，應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)tollip基因型，能夠滿足臨床檢驗(yàn)實(shí)際工作的要求。序列表<110>山東百茂生物科技有限公司<120>焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)tollip基因分型的引物對(duì)及試劑盒<130>p1170451<141>2017-08-28<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gcgtaggacatgacgaggtt20<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agccctgttccacagataagac22<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gcctggacccacatcacc18<210>4<211>125<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcgtaggacatgacgaggttgatcatgccctccttgtcgtccccctgcctcccgctcagg60ctgtaccacttgtcctccaccttgccctgcctcagggactccgggatggtgatgtgggtc120caggc125<210>5<211>125<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gcgtaggacatgacgaggttgatcatgccctccttgtcgtccccctgcctcccgctcagg60ctgtaccacttgtcctccaccttgccctgcctcagggactctgggatggtgatgtgggtc120caggc125<210>6<211>11<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tayggtttgca11當(dāng)前第1頁(yè)12