本發(fā)明涉及醫(yī)學檢驗領域，具體而言，涉及一種檢測腦炎病毒的引物組合及應用、試劑盒。

背景技術：

病毒性腦炎(ve)已日益成為近代兒科最常見的中樞系統(tǒng)感染性疾病，呈全球性分布，常年散發(fā)，病情嚴重，且有死亡病例，嚴重危害著少年兒童的健康。其病死率及后遺癥發(fā)生率均較高。引起病毒性腦炎(viralencephalitis，ve)的病毒種類很多，由于病毒性腦炎病原的多元性，給臨床的診斷、治療和預防造成了一定困難。大約有100余種病毒可以引起中樞神經系統(tǒng)的急性感染，乙腦病毒腺病毒、腸道病毒皰疹病毒、流行性腮腺炎病毒和腺病毒等是病毒性腦炎的主要病原體。

目前，針對上述腦炎致病病毒的檢查多采用實驗室的方法進行檢測；傳統(tǒng)的實驗室檢測方法大多需要數周的時間才能獲得準確的結果，無法獲得及時的結果；因此，需要一種快速檢測的手段。

技術實現要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種檢測腦炎病毒的引物組合，該引物組合具有針對不同病原體實現同時無差異擴增，靈敏度高，體現良好的優(yōu)點。

本發(fā)明的第二目的在于提供上述引物組合在制備檢測腦炎病毒的試劑盒中的應用。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種檢測腦炎病毒的試劑盒。

本發(fā)明的第四目的在于提供上述檢測腦炎病毒的試劑盒在檢測腦炎病毒rna中的應用。

為了實現本發(fā)明的上述目的，采用以下技術方案：

一種檢測腦炎病毒的引物組合，引物組合包括檢測腸道病毒的第1引物對、檢測乙腦病毒的第2引物對、檢測單純皰疹病毒的第3引物對中的至少一種以及通用引物對；第1-3引物對的堿基序列如seqidno.1-6所示；通用引物對的堿基序列如seqidno.7-8所示。

第1-3引物對的每條引物都由兩部分組成；a通用引物識別的標簽序列，b病原體基因特異性引物識別序列。

整個擴增過程由以下2個階段組成：(1)富集階段:第1-3引物對以比較低的濃度加入反應體系，低濃度的基因特異性引物被給予足夠的時間并在較高的退火溫度下去發(fā)現并結合模板，提高擴增的特異性。這一階段一般進行10個循環(huán)；(2)擴增階段:通用引物對以比較高的濃度加入反應體系，高濃度的通用引物無差異的高效地擴增所有的靶序列。該技術克服了不同引物退火溫度不一致的困難，實現擴增的無差異性。這一階段一般進行30個循環(huán)。

上述的引物組合在制備檢測腦炎病毒的試劑盒中的應用。

一種檢測腦炎病毒的試劑盒，試劑盒包括上述檢測腦炎病毒的引物組合。

上述的檢測試劑盒在檢測病毒rna中的應用。

與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的檢測腦炎病毒的引物組合能準確地、特異地檢測出病毒的種類；將上述引物組合應用于制備檢測試劑盒，可以方便、快速、高效的檢查應用于檢測；通過巢式pcr的方法，將試劑盒應用于檢測，提高檢測的效率。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。

圖1為本發(fā)明實驗例1提供的樣本電泳檢測結果圖；

圖2為本發(fā)明實驗例1提供的樣本電泳檢測結果圖。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產品。

下面對本發(fā)明實施例的一種檢測腦炎病毒的引物組合及應用、試劑盒進行具體說明。

一種檢測腦炎病毒的引物組合，引物組合包括檢測腸道病毒的第1引物對、檢測乙腦病毒的第2引物對、檢測單純皰疹病毒的第3引物對中的至少一種，以及通用引物對；第1-3引物對的堿基序列如seqidno.1-6所示；通用引物對的堿基序列如seqidno.7-8所示。

進一步地，第1-3引物對和通用引物對包括上游引物和下游引物；第1-3引物對的上游引物序列包括通用引物的上游引物序列，第1-3引物對的下游引物序列包括通用引物的下游引物序列。

檢測腸道病毒第1引物對的上游引物序列如下所示：

seqidno.1：5’-aggtgacactatagaatagatgagtcaccgcattcc-3’；

檢測腸道病毒第1引物對的下游引物序列如下所示：

seqidno.2：5’-gtacgactcactatagggacacaccacgtccgtattag-3’。

檢測乙腦病毒第2引物對的上游引物序列如下所示：

seqidno.3：5’-aggtgacactatagaatagagaatggcatagtcttgga-3’；

檢測乙腦病毒第2引物對的下游引物序列如下所示：

seqidno.4：5’-gtacgactcactatagggacgcaggaatggtcaatct-3’。

檢測單純皰疹病毒第3引物對的上游引物序列如下所示：

seqidno.5：5’-aggtgacactatagaatatgccttcaaccgaatatgt-3’；

檢測單純皰疹病毒第3引物對的下游引物序列如下所示：

seqidno.6：5’-gtacgactcactatagggagatgactcaagtcctccaa-3’。

通用引物對的上游引物序列如下所示：

seqidno.7：5’-aggtgacactatagaata-3’；

通用引物對的下游引物序列如下所示：

seqidno.8：5’-gtacgactcactataggga-3’。

上述的引物組合在制備檢測腦炎病毒的試劑盒中的應用。

一種檢測腦炎病毒的試劑盒，試劑盒包括上述的引物組合。

進一步地，還包括pcr反應緩沖液、taqdna聚合酶、dntps和反轉錄酶中的至少一種。

進一步地，pcr反應緩沖液包括tris·hcl、kcl、mgso4和(nh4)2so4。

進一步地，還包括病毒rna提取試劑。

進一步地，rna提取試劑包括dnase溶液、無水乙醇和rnase溶液。

上述的檢測試劑盒在檢測病毒rna中的應用。

進一步地，包括以待檢樣本為模板，進行pcr反應；

pcr反應程序為：50-51℃逆轉錄30min；95-96℃，預變性15min；95-96℃變性30s，62-68℃復性45s，72-73℃延伸30s，10個循環(huán)；95-96℃，變性30s，52-58℃復性30s，72-73℃延伸30s，30個循環(huán)。

以下結合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述。

實施例1

本實施例提供一種檢測腦炎病毒的引物組合，引物組合包括檢測腸道病毒的第1引物對、檢測乙腦病毒的第2引物對、檢測單純皰疹病毒的第3引物對中的至少一種，以及通用引物對；第1-3引物對的堿基序列如seqidno.1-6所示；通用引物對的堿基序列如seqidno.7-8所示。

第1-3引物對和所述通用引物對包括上游引物和下游引物；第1-3引物對的上游引物序列包括通用引物的上游引物序列，第1-3引物對的下游引物序列包括通用引物的下游引物序列。

檢測腸道病毒第1引物對的上游引物序列如下所示：

seqidno.1：5’-aggtgacactatagaatagatgagtcaccgcattcc-3’；

檢測腸道病毒第1引物對的下游引物序列如下所示：

seqidno.2：5’-gtacgactcactatagggacacaccacgtccgtattag-3’。

第1引物對的產物長度為134bp。

檢測乙腦病毒第2引物對的上游引物序列如下所示：

seqidno.3：5’-aggtgacactatagaatagagaatggcatagtcttgga-3’；

檢測乙腦病毒第2引物對的下游引物序列如下所示：

seqidno.4：5’-gtacgactcactatagggacgcaggaatggtcaatct-3’。

第2引物對的產物長度為394bp。

檢測單純皰疹病毒第3引物對的上游引物序列如下所示：

seqidno.5：5’-aggtgacactatagaatatgccttcaaccgaatatgt-3’；

檢測單純皰疹病毒第3引物對的下游引物序列如下所示：

seqidno.6：5’-gtacgactcactatagggagatgactcaagtcctccaa-3’。

第3引物對的產物長度為512bp。

通用引物對的上游引物序列如下所示：

seqidno.5：5’-aggtgacactatagaata-3’；

通用引物對的下游引物序列如下所示：

seqidno.6：5’-gtacgactcactataggga-3’。

實施例2

本實施例提供一種檢測腦炎病毒的試劑盒，試劑盒含有實施例1提供的檢測腦炎病毒的引物組合。

實施例3

本實施例提供一種檢測腦炎病毒的檢測試劑盒，試劑盒含有實施例1提供的檢測腦炎病毒的引物組合。

還包括pcr反應緩沖液、taqdna聚合酶、dntps和反轉錄酶中的至少一種。

pcr反應緩沖液包括tris·hcl、kcl、mgso4和(nh4)2so4。

實施例4

本實施例提供一種同時檢測多種腦炎病毒的檢測試劑盒，試劑盒含有實施例1提供的檢測腦炎病毒的引物組合。

還包括pcr反應緩沖液、taqdna聚合酶、dntps和反轉錄酶中的至少一種。

pcr反應緩沖液包括tris·hcl、kcl、mgso4和(nh4)2so4。

還包括rna提取試劑，rna提取試劑包括dnase溶液、無水乙醇和rnase溶液。

本實施例提供的試劑盒的使用方法，具體如下：

待測樣本rna的提取(實驗所用試劑與耗材均為rnase-free)，具體方法如下：

1.1取1ml待測者血清樣本，5000rpm離心10min，棄上清，加入1ml的trizol溶液重懸；

1.2漩渦震蕩混勻，室溫放置5-10min；

1.3在4℃，13000g離心15min，取900μl上清至新的離心管中，加入500μl氯仿漩渦混勻；

1.4在4℃，13000g離心15min，取500μl上清至新的離心管中，加入500μl異丙醇震蕩混勻，室溫放置10min；

1.5在4℃，13000g離心15min，棄上清，用75％的乙醇洗滌沉淀3次，棄乙醇，室溫晾干5min；

1.6加入50μl的rnase-free水溶解沉淀，得到樣本rna溶液。

檢測提取的rna溶液的質量，測定od260/od280值，獲得提取的rna的濃度及純度，同時檢測提取的rna的完整性。如果提取的rna有dna污染，可以通過dnase處理樣品。

pcr擴增反應

反應總體系：42μl；加入pcr反應緩沖液5μl，dntp(2mmeach)5μl，堿基序列如seqidno.1-6所示的引物片段(5μm)各1.25μl，通用引物的上下游序列(50μm)1.25μl，taqdna聚合酶0.5μl，反轉錄酶1μl；用ddh2o將反應體系補足到42μl。

pcr反應程序：

50℃逆轉錄30min；95℃，預變性15min；95℃變性30s，62℃復性45s，72℃延伸30s，10個循環(huán)；95℃變性30s；52℃復性30s；72℃延伸30s，30個循環(huán)。

實施例5

本實施例提供一種檢測腦炎病毒的檢測試劑盒，試劑盒含有實施例1提供的檢測腦炎病毒的引物組合。

還包括pcr反應緩沖液、taqdna聚合酶、dntps和反轉錄酶中的至少一種。

pcr反應緩沖液包括tris·hcl、kcl、mgso4和(nh4)2so4。

還包括rna提取試劑，rna提取試劑包括dnase溶液、無水乙醇和rnase溶液。

本實施例提供的試劑盒的使用方法參考實施例4。

pcr反應程序為：51℃逆轉錄30min；96℃，預變性15min；96℃變性30s，63℃復性45s，73℃延伸30s，10個循環(huán)；96℃變性30s；53℃復性30s；73℃，延伸30s，30個循環(huán)。

實施例6

本實施例提供一種檢測腦炎病毒的檢測試劑盒，試劑盒含有實施例1提供的檢測腦炎病毒的引物組合。

還包括pcr反應緩沖液、taqdna聚合酶、dntps和反轉錄酶中的至少一種。

pcr反應緩沖液包括tris·hcl、kcl、mgso4和(nh4)2so4。

還包括rna提取試劑，rna提取試劑包括dnase溶液、無水乙醇和rnase溶液。

本實施例提供的試劑盒的使用方法參考實施例4。

pcr反應程序為：51℃逆轉錄30min；96℃，預變性15min；96℃變性30s，64℃復性45s，73℃延伸30s，10個循環(huán)；96℃變性30s；54℃復性30s；73℃，延伸30s，30個循環(huán)。

實施例7

本實施例提供一種檢測腦炎病毒的檢測試劑盒，試劑盒含有實施例1提供的檢測腦炎病毒的引物組合。

還包括pcr反應緩沖液、taqdna聚合酶、dntps和反轉錄酶中的至少一種。

pcr反應緩沖液包括tris·hcl、kcl、mgso4和(nh4)2so4。

還包括rna提取試劑，rna提取試劑包括dnase溶液、無水乙醇和rnase溶液。

本實施例提供的試劑盒的使用方法參考實施例4。

pcr反應程序為：51℃逆轉錄30min；96℃，預變性15min；96℃變性30s，65℃復性45s，72℃延伸30s，10個循環(huán)；96℃變性30s；55℃復性30s；73℃，延伸30s，30個循環(huán)。

實施例8

本實施例提供一種檢測腦炎病毒的檢測試劑盒，試劑盒含有實施例1提供的檢測腦炎病毒的引物組合。

還包括pcr反應緩沖液、taqdna聚合酶、dntps和反轉錄酶中的至少一種。

pcr反應緩沖液包括tris·hcl、kcl、mgso4和(nh4)2so4。

還包括rna提取試劑，rna提取試劑包括dnase溶液、無水乙醇和rnase溶液。

本實施例提供的試劑盒的使用方法參考實施例4。

pcr反應程序為：51℃逆轉錄30min；96℃，預變性15min；96℃變性30s，66℃復性45s，72℃延伸30s，10個循環(huán)；96℃變性30s；56℃復性30s；72℃，延伸30s，30個循環(huán)。

實施例9

本實施例提供一種檢測腦炎病毒的檢測試劑盒，試劑盒含有實施例1提供的檢測腦炎病毒的引物組合。

還包括pcr反應緩沖液、taqdna聚合酶、dntps和反轉錄酶中的至少一種。

pcr反應緩沖液包括tris·hcl、kcl、mgso4和(nh4)2so4。

還包括rna提取試劑，rna提取試劑包括dnase溶液、無水乙醇和rnase溶液。

本實施例提供的試劑盒的使用方法參考實施例4。

pcr反應程序為：51℃逆轉錄30min；96℃，預變性15min；96℃變性30s，67℃復性45s，72℃延伸30s，10個循環(huán)；96℃變性30s；57℃復性30s；73℃，延伸30s，30個循環(huán)。

實施例10

本實施例提供一種檢測腦炎病毒的檢測試劑盒，試劑盒含有實施例1提供的檢測腦炎病毒的引物組合。

還包括pcr反應緩沖液、taqdna聚合酶、dntps和反轉錄酶中的至少一種。

pcr反應緩沖液包括tris·hcl、kcl、mgso4和(nh4)2so4。

還包括rna提取試劑，rna提取試劑包括dnase溶液、無水乙醇和rnase溶液。

本實施例提供的試劑盒的使用方法參考實施例4。

pcr反應程序為：51℃逆轉錄30min；96℃，預變性15min；96℃變性30s，68℃復性45s，73℃延伸30s，10個循環(huán)；96℃變性30s；58℃復性30s；72℃延伸30s，30個循環(huán)。

實驗例1

本實驗例對實施例4提供的試劑盒的特異性進行檢測。

待檢樣本包括：

陽性毒株：日本腦炎病毒(37010411333)、人類腸病毒71型(0311s035f)、單純皰疹陽性標本(20120403)。

陰性毒株：陰性對照病毒株11株：腎綜合癥出血熱病毒ⅰ型hfrsv(z10)，綜合癥出血熱病毒ⅱ型hfrsv(z37)，黃熱病(2006年(54)天壇生物0239)，柯薩奇病毒a16(2511s034f)，甲型流感(h1n1)(sd11716)病毒，輪狀病毒(0411f008f)，甲型h1n1(sdswl92)，甲型流感h3(sdtq1188)(by_sdtq1100)，流感(bv_sdzq1171)。

本測試中所有病毒滴度均大于或等于10⁴tcid50ml^-1。

樣本rna提取及pcr反應體系和反應程序參考實施例4。

如圖1所示，圖中泳道1-3是乙腦病毒，泳道4-6是人類腸病毒71，泳道7-9單純皰疹病毒，泳道10是marker(100bpladder)，泳道11-13是乙腦病毒、腸道病毒和單純皰疹病毒rna混合液，泳道14是陰性對照。泳道15是漢坦病毒，泳道16是黃熱病毒，泳道17是甲型流感h1病毒，泳道18是甲型流感h1n1病毒，泳道19是甲型流感h3病毒，泳道20是b型流感病毒(yamagata)，泳道21是是b型流感病毒(victoria)，泳道22是輪狀病毒，泳道23是hep2細胞、mdck細胞和rd細胞混合rna溶液。marker(100bpladder)由下到上依次為：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、1000bp和1500bp。

結果顯示實施例4提供的試劑盒可有效的鑒別出陽性毒株日本腦炎病毒(37010411333)、人類腸病毒71型(0311s035f)、單純皰疹陽性標本(20120403)，而11株陰性毒株檢測結果均為陰性。

因此可以看出，實施例4提供的試劑盒具有較好的特異性。

實驗例2

本實驗例提供驗證實施例4提供的試劑盒的靈敏度。

選取濃度為10⁴tcid50ml^-1的乙腦病毒、腸道病毒和單純皰疹病毒毒株，提取rna(提取方法參考實施例4)，然后調整濃度至20ng/μl；然后以10倍梯度濃度稀釋，分別稀釋10²、10³和10⁴倍。進行pcr反應(反應體系和反應程序參考實施例4)；反應結束后，取5μl的反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

結果如圖2所示，圖中，泳道1表示陰性對照，泳道2表示乙腦病毒、腸道病毒和單純皰疹病毒樣本稀釋10⁴倍的混合樣本，泳道3表示乙腦病毒、腸道病毒和單純皰疹病毒樣本稀釋10³倍的混合樣本，泳道4表示乙腦病毒、腸道病毒和單純皰疹病毒樣本稀釋10²倍的混合樣本，泳道5表示marker，泳道6表示單純皰疹病毒樣本稀釋10⁴倍的，泳道7表示單純皰疹病毒樣本稀釋10³倍的，泳道8表示單純皰疹病毒樣本稀釋10²倍的，泳道9表示腸道病毒樣本稀釋10⁴倍的，泳道10表示腸道病毒樣本稀釋10³倍的，泳道11表示腸道病毒樣本稀釋10²倍的，泳道12表示乙腦病毒樣本稀釋10⁴倍的，泳道13表示乙腦病毒樣本稀釋10³倍的，泳道14表示乙腦病毒樣本稀釋10²倍的；其中marker同實驗例1。

可以看出，腸道病毒、單純皰疹病毒在稀釋10⁴倍以后；即濃度達到2pg/μl，依然能夠檢測到；而乙腦病毒在20pg/μl的濃度也依然能檢測到。

可以看出，本發(fā)明實施例4提供的試劑盒具有較高的靈敏度。

實驗例3

本實驗例對2011-2013年收集的1102份實際樣本進行檢測，檢測結果統(tǒng)計見表1。

表1實際樣本檢測結果

從表1可以看出，實際樣本總的陽性檢出236份，陽性率21.05％，腦脊液單純皰疹病毒和腸道病毒雙陽性者18例。本檢測方法的靈敏度為92.5％，其中乙腦病毒104份陽性標本的檢測結果為94份陽性，8份陰性；單純皰疹87份標本的檢測結果為80份陽性，7份陰性；腸道病毒42份陽性的檢測結果為40份陽性，2份陰性；單純皰疹和腸道病毒合并感染22份陽性，檢測結果為18份陽性，4份陰性。

在該測試中，本檢測方法的特異性為100％，847份陰性標本的檢測結果全為陰性，無假陽性結果。

檢測診斷準確率為98.27％。在所有847個非乙腦、單純皰疹和腸道病毒標本的檢測中均無假陽性擴增，證明了本方法的高度特異性。本檢測法的陰性預測值(npv)為97.8％，陽性預測值(ppv)為100％。

綜上所述，本發(fā)明提供的檢測腦炎病毒的引物組合具有較好的特異性和較高的靈敏度，使用該引物組合應用于檢測腦炎病毒的試劑盒同樣也具有較好的特異性和較高的靈敏度；該試劑盒方便提取病毒樣本并進行鑒定，具有較高的實用性和較高的推廣應用價值。

以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

sequencelisting

<110>濟南市疾病預防控制中心

<120>一種檢測腦炎病毒的引物組合及應用、試劑盒

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