本發(fā)明屬于分子診斷領(lǐng)域，更具體地，涉及一種檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的lamp引物組合物、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

b群鏈球菌(groupbstreptococcus，gbs)又稱無乳鏈球菌，寄生于人類下消化道及泌尿生殖道，新生兒gbs感染與母親生殖道及腸道gbs定植關(guān)系密切，該菌在健康婦女陰道定植率是10％～30％，是圍產(chǎn)期母嬰感染的主要致病菌之一，可引起新生兒肺炎、腦膜炎，甚至敗血癥，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡。gbs感染在歐美國(guó)家發(fā)病率較高，1996年，美國(guó)制定了預(yù)防gbs感染方針，推薦對(duì)妊娠35～37周的孕婦進(jìn)行產(chǎn)前gbs篩查和產(chǎn)時(shí)抗生素預(yù)防。抗生素預(yù)防推薦用藥首選青霉素，對(duì)β-內(nèi)酰胺類過敏的孕婦，大環(huán)內(nèi)酯類藥物(紅霉素)和林可霉素類藥物(克林霉素)被作為替代藥物。隨著抗生素治療時(shí)間的延長(zhǎng)，gbs對(duì)紅霉素、克林霉素的耐藥率逐年升高，對(duì)其是否適宜作為二線預(yù)防藥物存在爭(zhēng)議。因此，對(duì)孕婦攜帶的gbs及其耐藥性進(jìn)行快速鑒定，對(duì)于用藥指導(dǎo)和疾病預(yù)防非常有應(yīng)用價(jià)值。

目前，gbs的檢測(cè)方法主要是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法和pcr檢測(cè)法，現(xiàn)有的檢測(cè)方法普遍存在特異性不強(qiáng)、靈敏度欠佳的問題；其中分離培養(yǎng)法在需要耗時(shí)2～3天，并且假陰性率較高，pcr檢測(cè)法則靈敏度一般是1～100pg/μl細(xì)菌dna，并不是太理想。此外，gbs對(duì)抗生素耐藥性的現(xiàn)有評(píng)價(jià)方法耗時(shí)長(zhǎng)，并且準(zhǔn)確度不高，如藥敏實(shí)驗(yàn)，容易受人為因素、培養(yǎng)基、藥物含量影響較大，以上現(xiàn)有技術(shù)均難以滿足對(duì)gbs及其耐藥性的高準(zhǔn)確度、高靈敏度、高特異性等要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的lamp引物組合物；

本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的試劑盒；

本發(fā)明的再一目的在于提供一種檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的lamp引物組合物，包括：

檢測(cè)b族鏈球菌的cfb基因的lamp引物組，包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物、一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列如下：

fip-cfb：5’-agcttagttatcccaaatcccactattggtagtcgtgtagaagc-3’；

bip-cfb：5’-tccatttgcttcagttgattcatggtagctctatcagttggt-3’；

f3-cfb:5’-aagacttcattgcgtgcc-3’；

b3-cfb:5’-aacgtgtattccaaatttcctt-3’；

lf-cfb:5’-tgattgcttcaatcacatctgt-3’；

lb-cfb:5’-tcaagttaacgatgtaaaggca-3’；

檢測(cè)耐藥基因ermb的lamp引物組，包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物、一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列如下：

fip-ermb:5’-gagcaaccctagtgttcggtgtgcgtctgacatctatctga-3’；

bip-ermb:5’-tgcacactcaagtctcgattcagtttaggatgaaagcattccg-3’；

f3-ermb:5’-gttgggagtattccttaccatt-3’；

b3-ermb:5’-tggtatggcgggtaagtt-3’；

lf-ermb:5’-ggtacgcttgtagaatccttct-3’；

lb-ermb:5’-gcaattgcttaagctgcca-3’；

檢測(cè)耐藥基因ermc的lamp引物組，包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物、一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列如下：

fip-ermc:5’-tggaaattatcgtgatcaacaaccttgaattagtaaagaggtgt-3’；

bip-ermc:5’-aagtacggatataatacgcaaaagtaatgccaatgagcgtt-3’；

f3-ermc:5’-atctgataagtgagctattcac-3’；

b3-ermc:5’-tttgaaatcggctcaggaaa-3’；

lf-ermc:5’-cgtggaatacgggtttgcta-3’；

lb-ermc:5’-atggtctatttcaatggcagtt-3’；

檢測(cè)耐藥基因ermm的lamp引物組，包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物、一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列如下：

fip-ermm:5’-tggaaattatcgtgatcaacaaccttgaattagtacagaggtgt-3’；

bip-ermm:5’-aagtacggatataatacgcaaaaataatgcgaatgagcgtt-3’；

f3-ermm:5’-tttgaaatcggctcaggaaa-3’；

b3-ermm:5’-atctgataagtgagctattcac-3’；

lf-ermm:5’-atggtctatttcaatggcagtt-3’；

lb-ermm:5’-cgtggaatacgggtttgcta-3’；

檢測(cè)耐藥基因ermtr的lamp引物組，包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物、一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列如下：

fip-ermtr:5’-cgtggcatgacataaaccttcattaccaaggaacttgtggaa-3’；

bip-ermtr:5’-tgcttttgatagtcaagcgaaacctaaagctcgttgggtatt-3’；

f3-ermtr:5’-aatagaaattgggtcaggaaa-3’；

b3-ermtr:5’-catttccaccattaacagcaaa-3’；

lf-ermtr:5’-tctctatagcattcacccgttg-3’；

lb-ermtr:5’-agctaccttattgtagagaggg-3’；

檢測(cè)耐藥基因mefa/e的lamp引物組，包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物、一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列如下：

fip-mefa/e:5’-aagctgttccaatgctacggatcttgctattgttgcattctgt-3’；

bip-mefa/e:5’-actcaatgcggttacaccacttagactgactatagcctgcg-3’；

f3-mefa/e:5’-tgtgctagtggatcgtca-3’；

b3-mefa/e:5’-cccaaacggagtataagagtg-3’；

lf-mefa/e:5’-tccagacaggtagctccat-3’；

lb-mefa/e:5’-gtaccagaagaacagctaacga-3’；

檢測(cè)耐藥基因linb的lamp引物組，包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物、一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列如下：

fip-linb:5’-aactacctctgttccgtactcatgattcatccaactggttgtt-3’；

bip-linb:5’-ttcctgatacgaaggctatgctcttgcaccacttatctctgat-3’；

f3-linb:5’-aggagaaggtgaccaatact-3’；

b3-linb:5’-aagagttctaatgaacgagcat-3’；

lf-linb:5’-aagcatcaagtacggagc-3’；

lb-linb:5’-acgatgaaacagggcaattaga-3’。

一種檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的檢測(cè)b族鏈球菌的cfb基因的lamp引物組、檢測(cè)耐藥基因ermb的lamp引物組、檢測(cè)耐藥基因ermc的lamp引物組、檢測(cè)耐藥基因ermm的lamp引物組、檢測(cè)耐藥基因ermtr的lamp引物組、檢測(cè)耐藥基因mefa/e的lamp引物組、檢測(cè)耐藥基因linb的lamp引物組。

作為上述試劑盒的優(yōu)選，各所述lamp引物組中的內(nèi)引物：外引物：環(huán)引物的摩爾比為：(6～10)：1：(3～5)。

作為上述試劑盒的優(yōu)選，還包括：lamp反應(yīng)液、dna聚合酶、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

作為上述試劑盒的優(yōu)選，lamp反應(yīng)液包括dntps、甜菜堿、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸銨、tris-hcl、tween-20，七者的比例為：(1.4～1.8)mmol/l：(0.8～1.2)mmol/l：(6～10)mmol/l：10mmol/l：10mmol/l：20mmol/l：10g/l。

作為上述試劑盒的優(yōu)選，dna聚合酶為bstdna聚合酶。

非疾病診斷目的的一種b族鏈球菌及其耐藥性的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

(1)提取待測(cè)樣本dna；

(2)利用權(quán)利要求1所述的lamp引物組合物中的各引物組分別對(duì)待檢樣本dna進(jìn)行恒溫pcr擴(kuò)增；

(3)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷：

如果cfb基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，則鑒定為含有b群鏈球菌，反之，則鑒定為不含有b群鏈球菌；

如果同時(shí)cfb基因和erm基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，則鑒定為含有對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物、林可酰胺類藥物及鏈陽(yáng)菌素b均有耐藥性的b群鏈球菌；

如果同時(shí)cfb基因和mefa/e基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，則鑒定為含有對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的b群鏈球菌；

如果同時(shí)cfb基因和linb基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，則鑒定為含有對(duì)林可酰胺類藥物耐藥的b群鏈球菌；

如果同時(shí)cfb基因、erm基因和mefa/e基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，或同時(shí)cfb基因、erm基因和linb基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，或同時(shí)cfb基因、mefa/e基因和linb基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，或同時(shí)cfb基因、erm基因、mefa/e基因和linb基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，則鑒定為含有對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物和林可酰胺類均耐藥的b群鏈球菌；

所述erm基因選自ermb、ermc、ermm、ermtr基因。

作為上述方法的優(yōu)選，恒溫pcr擴(kuò)增的25μl體系含有：內(nèi)引物各(1.2～2.0)μmol/l、外引物各0.2μmol/l，環(huán)引物各(0.6～1.0)μmol/l、dntps(1.4～1.8)mmol/l、甜菜堿(0.8～1.2)mmol/l、硫酸鎂(6～10)mmol/l、氯化鉀10mmol/l、硫酸銨10mmol/l、tris-hcl20mmol/l、tween-2010g/l、bstdna聚合酶7～9u，待測(cè)樣本dna1μl，余量為水。

作為上述方法的優(yōu)選，恒溫pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：61～65℃擴(kuò)增40～50min。

作為上述方法的優(yōu)選，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法選自凝膠電泳法、可視化熒光檢測(cè)法、熒光定量檢測(cè)法。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的lamp引物組合物是針對(duì)b群鏈球菌的特異性基因cfb和大環(huán)內(nèi)酯類相關(guān)耐藥基因mefa/e、ermb、ermc、ermm、ermtr、linb的保守序列設(shè)計(jì)的特異性lamp引物，其檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高，能根據(jù)檢測(cè)結(jié)果直觀評(píng)價(jià)耐藥性，有望應(yīng)用于b族鏈球菌預(yù)防及感染的用藥指導(dǎo)中。

附圖說明

圖1：實(shí)施例3結(jié)果判讀參照?qǐng)D，圖中，綠色為擴(kuò)增陽(yáng)性，橙色為擴(kuò)增陰性；

圖2：實(shí)施例3檢測(cè)方法檢測(cè)b群鏈球菌的特異性測(cè)試，圖中：1.b群鏈球菌；2.肺炎鏈球菌；3.變形鏈球菌；4.血鏈球菌；5.釀膿鏈球菌；6.金黃色葡萄球菌；7.表皮葡萄球菌；8.大腸桿菌；9.屎腸球菌；10.產(chǎn)氣腸桿菌；11.銅綠假單胞菌；12.肺炎克雷伯菌；13.痢疾桿菌；n.陰性對(duì)照，其中，綠色為擴(kuò)增陽(yáng)性，橙色為擴(kuò)增陰性；

圖3：實(shí)施例3檢測(cè)方法檢測(cè)耐藥基因的特異性測(cè)試，圖中：p.陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品；1.攜帶耐藥基因mefa/egbs菌株的基因組dna；2～5.4個(gè)不攜帶耐藥基因mefa/e的gbs菌株的基因組dna；n.陰性對(duì)照，其中，綠色為擴(kuò)增陽(yáng)性，橙色為擴(kuò)增陰性；

圖4：實(shí)施例3檢測(cè)方法對(duì)質(zhì)粒dna的檢測(cè)靈敏度，圖中：1.n×10¹ng/μl；2.n×10⁰ng/μl；3.n×10^-1ng/μl；4.n×10^-2ng/μl；5.n×10^-3ng/μl；6.n×10^-4ng/μl；7.n×10^-5ng/μl；8.n×10^-6ng/μl；n.陰性對(duì)照；

圖5：實(shí)施例3檢測(cè)方法對(duì)細(xì)菌純培養(yǎng)物的檢測(cè)靈敏度，圖中：1：陰性對(duì)照；2:6.3×10⁸cfu/ml；3：6.3×10⁷cfu/ml；4：6.3×10⁶cfu/ml；5：6.3×10⁵cfu/ml；6：6.3×10⁴cfu/ml；7：6.3×10³cfu/ml；8：6.3×10²cfu/ml；9：6.3×10¹cfu/ml；10：6.3×10⁰cfu/ml；11：6.3×10^-1cfu/ml；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)菌株收集自東莞市東華醫(yī)院微生物室門診及住院的300例孕產(chǎn)婦陰道、肛門拭子，標(biāo)準(zhǔn)菌株由廣東醫(yī)科大學(xué)病原微生物室保存。

實(shí)施例1、一種檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的lamp引物組合物的設(shè)計(jì)

分別針對(duì)b族鏈球菌的特異性基因cfb和大環(huán)內(nèi)酯類相關(guān)耐藥基因mefa/e、ermb、ermc、ermm、ermtr、linb的保守序列設(shè)計(jì)lamp引物，經(jīng)過引物的篩選、優(yōu)化，獲得下述檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的lamp引物組合物，包括：

檢測(cè)b族鏈球菌的cfb基因的lamp引物組，包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物、一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列如下：

fip-cfb：5’-agcttagttatcccaaatcccactattggtagtcgtgtagaagc-3’(seqidno:1)；

bip-cfb：5’-tccatttgcttcagttgattcatggtagctctatcagttggt-3’(seqidno:2)；

f3-cfb:5’-aagacttcattgcgtgcc-3’(seqidno:3)；

b3-cfb:5’-aacgtgtattccaaatttcctt-3’(seqidno:4)；

lf-cfb:5’-tgattgcttcaatcacatctgt-3’(seqidno:5)；

lb-cfb:5’-tcaagttaacgatgtaaaggca-3’(seqidno:6)；

檢測(cè)耐藥基因ermb的lamp引物組，包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物、一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列如下：

fip-ermb:5’-gagcaaccctagtgttcggtgtgcgtctgacatctatctga-3’(seqidno:7)；

bip-ermb:5’-tgcacactcaagtctcgattcagtttaggatgaaagcattccg-3’(seqidno:8)；

f3-ermb:5’-gttgggagtattccttaccatt-3’(seqidno:9)；

b3-ermb:5’-tggtatggcgggtaagtt-3’(seqidno:10)；

lf-ermb:5’-ggtacgcttgtagaatccttct-3’(seqidno:11)；

lb-ermb:5’-gcaattgcttaagctgcca-3’(seqidno:12)；

檢測(cè)耐藥基因ermc的lamp引物組，包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物、一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列如下：

fip-ermc:5’-tggaaattatcgtgatcaacaaccttgaattagtaaagaggtgt-3’(seqidno:13)；

bip-ermc:5’-aagtacggatataatacgcaaaagtaatgccaatgagcgtt-3’(seqidno:14)；

f3-ermc:5’-atctgataagtgagctattcac-3’(seqidno:15)；

b3-ermc:5’-tttgaaatcggctcaggaaa-3’(seqidno:16)；

lf-ermc:5’-cgtggaatacgggtttgcta-3’(seqidno:17)；

lb-ermc:5’-atggtctatttcaatggcagtt-3’(seqidno:18)；

檢測(cè)耐藥基因ermm的lamp引物組，包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物、一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列如下：

fip-ermm:5’-tggaaattatcgtgatcaacaaccttgaattagtacagaggtgt-3’(seqidno:19)；

bip-ermm:5’-aagtacggatataatacgcaaaaataatgcgaatgagcgtt-3’(seqidno:20)；

f3-ermm:5’-tttgaaatcggctcaggaaa-3’(seqidno:21)；

b3-ermm:5’-atctgataagtgagctattcac-3’(seqidno:22)；

lf-ermm:5’-atggtctatttcaatggcagtt-3’(seqidno:23)；

lb-ermm:5’-cgtggaatacgggtttgcta-3’(seqidno:24)；

檢測(cè)耐藥基因ermtr的lamp引物組，包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物、一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列如下：

fip-ermtr:5’-cgtggcatgacataaaccttcattaccaaggaacttgtggaa-3’(seqidno:25)；

bip-ermtr:5’-tgcttttgatagtcaagcgaaacctaaagctcgttgggtatt-3’(seqidno:26)；

f3-ermtr:5’-aatagaaattgggtcaggaaa-3’(seqidno:27)；

b3-ermtr:5’-catttccaccattaacagcaaa-3’(seqidno:28)；

lf-ermtr:5’-tctctatagcattcacccgttg-3’(seqidno:29)；

lb-ermtr:5’-agctaccttattgtagagaggg-3’(seqidno:30)；

檢測(cè)耐藥基因mefa/e的lamp引物組，包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物、一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列如下：

fip-mefa/e:5’-aagctgttccaatgctacggatcttgctattgttgcattctgt-3’(seqidno:31)；

bip-mefa/e:5’-actcaatgcggttacaccacttagactgactatagcctgcg-3’(seqidno:32)；

f3-mefa/e:5’-tgtgctagtggatcgtca-3’(seqidno:33)；

b3-mefa/e:5’-cccaaacggagtataagagtg-3’(seqidno:34)；

lf-mefa/e:5’-tccagacaggtagctccat-3’(seqidno:35)；

lb-mefa/e:5’-gtaccagaagaacagctaacga-3’(seqidno:36)；

檢測(cè)耐藥基因linb的lamp引物組，包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物、一對(duì)環(huán)引物，其核苷酸序列如下：

fip-linb:5’-aactacctctgttccgtactcatgattcatccaactggttgtt-3’(seqidno:37)；

bip-linb:5’-ttcctgatacgaaggctatgctcttgcaccacttatctctgat-3’(seqidno:38)；

f3-linb:5’-aggagaaggtgaccaatact-3’(seqidno:39)；

b3-linb:5’-aagagttctaatgaacgagcat-3’(seqidno:40)；

lf-linb:5’-aagcatcaagtacggagc-3’(seqidno:41)；

lb-linb:5’-acgatgaaacagggcaattaga-3’(seqidno:42)。

實(shí)施例2、一種檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的試劑盒的建立

一種檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的試劑盒，包括：實(shí)施例1設(shè)計(jì)的檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的lamp引物組合物、lamp反應(yīng)液、dna聚合酶、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

其中，檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的lamp引物組合物中，各引物組中內(nèi)引物：外引物：環(huán)引物的摩爾比為：8：1：4；

其中，lamp反應(yīng)液包括：dntps、甜菜堿、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸銨、tris-hcl、tween-20，七者的比例為：1.6mmol/l：1.0mmol/l：8mmol/l：10mmol/l：10mmol/l：20mmol/l：10g/l；

其中，dna聚合酶為bstdna聚合酶；

其中，陰性對(duì)照為ddh2o，陽(yáng)性對(duì)照為攜帶各基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

實(shí)施例3、一種檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的方法

一種檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測(cè)樣本dna

按照minibestbacteriagenomicdna提取試劑盒說明書操作，提取待測(cè)樣本的基因組dna，作為lamp擴(kuò)增模版。

(2)利用實(shí)施例1所示的lamp引物組合物中的各引物組分別對(duì)待檢樣本dna進(jìn)行恒溫pcr擴(kuò)增

恒溫pcr擴(kuò)增的25μl體系含有：內(nèi)引物各1.6μmol/l、外引物各0.2μmol/l，環(huán)引物各0.8μmol/l、dntps1.6mmol/l、甜菜堿1mmol/l、硫酸鎂8mmol/l、氯化鉀10mmol/l、硫酸銨10mmol/l、tris-hcl20mmol/l、tween-2010g/l、bstdna聚合酶8u，待測(cè)樣本dna1μl，余量為水；恒溫pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：61～65℃擴(kuò)增40～50min。

(3)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷：

可使用3種方法檢測(cè)lamp擴(kuò)增產(chǎn)物：①瓊脂糖凝膠電泳法：取擴(kuò)增產(chǎn)物5μl，用2％的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線分析儀中可以看到明顯的梯狀lamp特征性電泳圖譜；②可視化熒光檢測(cè)法：反應(yīng)前向試管蓋上加入1μl核酸染料sybrgreeni，由于lamp的擴(kuò)增效率極高，所以反應(yīng)結(jié)束后稍微離心，使染料與擴(kuò)增產(chǎn)物混勻，肉眼即可根據(jù)溶液顏色變化進(jìn)行判定：如果發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)，染料與產(chǎn)物混合后顏色變綠；反之，混合物顏色為橙色不變；③熒光定量檢測(cè)法：在上述的反應(yīng)體系中加入0.5μlsyto-9熒光染料，并加入適量甘油進(jìn)行密封，混勻離心后放入羅氏lightcycler96熒光定量pcr儀中63℃恒溫45min，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)。

參照?qǐng)D1(可視化熒光檢測(cè)為例)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷：

如果cfb基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，則鑒定為含有b群鏈球菌，反之，則鑒定為不含有b群鏈球菌，如圖1中1號(hào)樣品；

如果同時(shí)cfb基因和erm基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，則鑒定為含有對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物、林可酰胺類藥物及鏈陽(yáng)菌素b均有耐藥性的b群鏈球菌，如圖1中2～5號(hào)樣品；

如果同時(shí)cfb基因和mefa/e基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，則鑒定為含有對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的b群鏈球菌，如圖1中6號(hào)樣品；

如果同時(shí)cfb基因和linb基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，則鑒定為含有對(duì)林可酰胺類藥物耐藥的b群鏈球菌，如圖1中7號(hào)樣品；

如果同時(shí)cfb基因、erm基因和mefa/e基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，或同時(shí)cfb基因、erm基因和linb基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，或同時(shí)cfb基因、mefa/e基因和linb基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，或同時(shí)cfb基因、erm基因、mefa/e基因和linb基因lamp擴(kuò)增陽(yáng)性，則鑒定為含有對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物和林可酰胺類均耐藥的b群鏈球菌，如圖1中8～11號(hào)樣品；

所述erm基因選自ermb、ermc、ermm、ermtr基因。

實(shí)施例4、特異性試驗(yàn)

(1)鑒定b群鏈球菌的特異性試驗(yàn)：選擇不同種的鏈球菌和其他泌尿生殖道常見的細(xì)菌(的基因組dna作為模板，ddh2o為陰性對(duì)照，驗(yàn)證實(shí)施例3的方法的特異性(以可視化熒光檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物為例)，特異性實(shí)驗(yàn)菌株樣品如表1所示。

表1、特異性實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，只有b群鏈球菌呈陽(yáng)性，其他細(xì)菌都是陰性，說明本發(fā)明檢測(cè)方法對(duì)鑒定b群鏈球菌有良好的特異性。

(2)檢測(cè)耐藥基因的特異性試驗(yàn)(以mefa/e耐藥基因?yàn)槔?：選擇1株攜帶mefa/e基因的b群鏈球菌和4株不含mefa/e基因的b群鏈球菌基因組dna作為模板，mefa/e基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，ddh2o為陰性對(duì)照，利用檢測(cè)mefa/e基因的lamp引物組進(jìn)行檢測(cè)(結(jié)果以可視化熒光檢測(cè)為例)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，mefa/e基因陽(yáng)性質(zhì)粒和含有mefa/e基因的b群鏈球菌呈陽(yáng)性反應(yīng)，其他不含有mefa/e基因的b群鏈球菌陰性反應(yīng)，其他耐藥基因特異性情況與mefa/e耐藥基因一致，說明本發(fā)明檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)b群鏈球菌耐藥基因有良好的特異性。

實(shí)施例5、靈敏度試驗(yàn)

(1)使用質(zhì)粒dna檢測(cè)靈敏度：將含cfb的基因組dna和分別含有mefa/e、ermb、ermc、ermm、ermtr、linb基因的質(zhì)粒dna進(jìn)行10倍梯度稀釋，作為dna模版，ddh2o為陰性對(duì)照，采用實(shí)施例3的方法進(jìn)行靈敏度檢測(cè)(以熒光定量檢測(cè)為例)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，本發(fā)明檢測(cè)方法對(duì)質(zhì)粒dna的檢測(cè)限為10^-5ng/ul。

(2)細(xì)菌純培養(yǎng)檢測(cè)靈敏度：取經(jīng)37℃，14～16h培養(yǎng)的菌液2ml，用生理鹽水從10⁰～10^-9進(jìn)行10倍倍比稀釋，經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)，推算原菌液濃度；取系列梯度的菌液1ml提取dna，取1μl作為模版進(jìn)行l(wèi)amp檢測(cè)靈敏度(以熒光定量檢測(cè)為例)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，本發(fā)明方法檢測(cè)細(xì)菌純培養(yǎng)物的靈敏度為6.3×10¹cfu/ml。

實(shí)施例6、臨床樣品檢測(cè)

分別使用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法、現(xiàn)有pcr法、本發(fā)明實(shí)施例3的lamp引物檢測(cè)臨床300份孕產(chǎn)婦陰道直腸拭子標(biāo)，同時(shí)使用藥敏試驗(yàn)、pcr、lamp方法檢測(cè)其耐藥情況。

結(jié)果顯示：300份臨床樣品中檢測(cè)b群鏈球菌，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢出20株，pcr法檢出34株，本發(fā)明lamp方法檢出39株；20份b群鏈球菌樣品中，藥敏試驗(yàn)檢出4株耐藥菌株，pcr法檢出10株耐藥菌株，本發(fā)明lamp方法檢出12株，可見本發(fā)明的lamp引物組、試劑盒及其檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品的檢出率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)及常規(guī)的pcr檢測(cè)法，并且具有更高的靈敏度和特異性。

sequencelisting

<110>廣東醫(yī)科大學(xué)

<120>一種檢測(cè)b族鏈球菌及其耐藥性的lamp引物組合物、試劑盒及方法

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