本實用新型涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種RNA反義純化試劑盒。
背景技術(shù)：
長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是長達(dá)兩百個核苷酸以上的轉(zhuǎn)錄本，絕大多數(shù)位于細(xì)胞核內(nèi)。雖然lncRNA沒有編碼任何蛋白質(zhì)，但它們在不同組織和發(fā)育階段的表達(dá)依然具有特異性，這說明lncRNA具有重要的生物學(xué)意義。在測序技術(shù)的幫助下，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種lncRNA，但這些lncRNA的生物學(xué)功能依然還是個謎。
2013年，Jesse M.Engreitz教授開發(fā)了RNA反義純化(RNAantisensePurification，RAP)技術(shù)，該技術(shù)可以在轉(zhuǎn)錄后水平鑒定RNA與RNA及相關(guān)DNA和蛋白質(zhì)的互作。其原理如下：首先用紫外交聯(lián)固定細(xì)胞，以維持如lncRNA等調(diào)控RNA與RNA、RBP的相互作用，然后進(jìn)行細(xì)胞裂解，接著用生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針組與靶l(wèi)ncRNA雜交，基于生物素和鏈霉親和素相互作用的原理，用鏈霉親和素磁珠來分離、純化探針-基因或蛋白質(zhì)復(fù)合體，最后從純化的復(fù)合體中分離蛋白質(zhì)或RNA，以進(jìn)行下游的分析。
RAP技術(shù)被不同領(lǐng)域的研究者們廣泛采用。如Engreitz J M等(2013)利用RAP技術(shù)通過研究LncRNA Xist成功地闡釋了Xist使X染色體失活的作用機(jī)理(Engreitz J M,Pandyajones A,Mcdonel P,et al.The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome[J].Science,2013,341(6147):L35-L38.)。隨著人們進(jìn)一步認(rèn)識非編碼RNA在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮的重要作用，研究者對RAP技術(shù)進(jìn)行不斷的完善，旨在闡明lncRNA在機(jī)體內(nèi)與內(nèi)源性RNA、蛋白質(zhì)的互作關(guān)系。2014年，Engreitz J M及其同事們運用RAP技術(shù)研究了核內(nèi)小RNA U1和lncRNA Malat1與前體mRNA互作的作用機(jī)理。通過使用不同交聯(lián)試劑及交聯(lián)條件，改進(jìn)的RAP技術(shù)能夠進(jìn)一步研究體內(nèi)RNA-RNA互作關(guān)系及RNA在染色體上的定位及參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(Engreitz J,Sirokman K,Mcdonel P,et al.RNA-RNA Interactions Enable Specific Targeting of Noncoding RNAs to Nascent Pre-mRNAs and Chromatin Sites[J].Cell,2014,159(1):188-99.)。
然而，現(xiàn)有RAP技術(shù)因磁珠會吸附非特異性的核酸及蛋白質(zhì)、探針組與RNA雜交的效率不高、核酸及蛋白質(zhì)等產(chǎn)品回收效率不高等問題而存在特異性低、靈敏度不佳的缺點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種RNA反義純化試劑盒。
為了實現(xiàn)上述目的，本實用新型采用如下技術(shù)方案：
一種RNA反義純化試劑盒，包含盒體和位于盒體內(nèi)的海綿墊，海綿墊上開設(shè)有多個容器孔，所述容器孔內(nèi)放置EP管和試劑瓶，所述海綿墊上開設(shè)有一個大孔、四個中孔和十四個小孔，大孔用于放置100ml試劑瓶，中孔用于放置20ml試劑瓶，小孔用于放置2ml EP管，所述100ml試劑瓶內(nèi)盛放Wash Buffer，所述四個20ml試劑瓶分別用于盛放Lysis buffer、2×Hybridization Buffer、1×Hybridization Buffer和10mM pH 7.5 Tris-HCl，所述十四個2ml EP管分別用于盛放Streptavidin Beads、RNA Elution Buffer、RNA Elution Buffer、Proteinase K buffer、Glycogen、1×DNase salt stock、20 U Turbo DNase、EDTA、EGTA、DTT、RNase Inhibitor、Proteinase K、RNase-free water、5M NaCl。
優(yōu)選地，所述大孔和中孔位于海綿墊的左側(cè)，大孔在后，中孔在前，中孔分為兩排，每排兩個；小孔位于海綿墊的右側(cè)，小孔分為四排，前兩排每排三個，后兩排每排四個。
優(yōu)選地，所述100ml試劑瓶中裝有90ml Wash Buffer；四個20ml試劑瓶分別裝有14ml Lysis buffer、12ml 2×Hybridization Buffer、10ml 1×Hybridization Buffer、20ml 10mM pH 7.5Tris-HCl。
優(yōu)選地，所述十四個2ml EP管分別裝有1.2ml Streptavidin Beads、2.0ml RNA Elution Buffer、0.5ml RNA Elution Buffer、0.75ml Proteinase K buffer、60μl Glycogen、50μl 1×DNase salt stock、150μl 20 U Turbo DNase、0.2mlEDTA、0.1ml EGTA、12.5μl DTT、50μl RNase Inhibitor、30μl Proteinase K、0.9ml RNase-free water、0.6ml 5M NaCl。
優(yōu)選地，每個EP管上標(biāo)有編號。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用新型具有如下有益效果：
本實用新型包含了RNA反義純化過程所需的試劑，可以直接使用，不必再另行配制。本實用新型試劑盒通過預(yù)先使用BSA和寡核苷酸隨機(jī)引物封閉磁珠，降低了磁珠的非特異性吸附。BSA和寡核苷酸隨機(jī)引物的大小正合適，既能封閉磁珠增強(qiáng)實驗的特異性，又不會過大而影響探針與RNA的結(jié)合。本實用新型中磁珠首先與探針孵育，去除多余探針后再與RNA孵育，過量探針封閉鏈霉親和素與蛋白質(zhì)、核酸等的非特異性結(jié)合，提高檢測特異性，靈敏度高；雜交后經(jīng)梯度溫度多次洗滌，保證磁珠充分結(jié)合探針并結(jié)合目標(biāo)RNA，提高雜交效率。
附圖說明
圖1為本實用新型結(jié)構(gòu)示意圖。
附圖標(biāo)記為：
盒體 1，海綿墊 2，容器孔 3，蓋子 4，2ml EP管 5，100ml試劑瓶 6、20ml試劑瓶 7。
具體實施方式
為了更好的說明本實用新型，下面結(jié)合附圖和具體實施方式做進(jìn)一步說明。本實用新型中所用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測方法等都是本領(lǐng)域所熟知的，在此不再贅述。
實施例1
如圖1所示，一種RNA反義純化試劑盒，包含盒體1、位于盒體1內(nèi)的海綿墊2和蓋子4，海綿墊2上開設(shè)有多個容器孔3，所述容器孔3內(nèi)放置EP管和試劑瓶，所述海綿墊2上開設(shè)有一個大孔、四個中孔和十四個小孔，大孔用于放置100ml試劑瓶6，中孔用于放置20ml試劑瓶7，小孔用于放置2ml EP管5。所述大孔和中孔位于海綿墊2的左側(cè)，大孔在后，中孔在前，中孔分為兩排，每排兩個；小孔位于海綿墊2的右側(cè)，小孔分為四排，前兩排每排三個，后兩排每排四個。
優(yōu)選地，所述100ml試劑瓶中裝有90ml Wash Buffer；四個20ml試劑瓶分別裝有14ml Lysis buffer、12ml 2×Hybridization Buffer、10ml 1×Hybridization Buffer、20ml 10mM pH 7.5Tris-HCl。所述十四個2ml EP管分別裝有1.2ml Streptavidin Beads、2.0ml RNA Elution Buffer、0.5ml RNA Elution Buffer、0.75ml Proteinase K buffer、60μl Glycogen、50μl 1×DNase salt stock、150μl 20U Turbo DNase、0.2mlEDTA、0.1ml EGTA、12.5μl DTT、50μl RNase Inhibitor、30μl Proteinase K、0.9ml RNase-free water、0.6ml 5M NaCl。每個EP管上標(biāo)有編號，第一至四排分別標(biāo)為A-D排，每排中每個EP管自左自右依次標(biāo)為a-c或d。如第一排第一個空中的EP管標(biāo)為Aa管，依此類推。
下面結(jié)合具體實施例來說明本實用新型試劑盒的使用方法。CTNNB1為編碼catenin beta 1蛋白的mRNA，物種為人類。針對CTNNB1mRNA開展RAP實驗，靶基因為hsa-miR-214。探針的設(shè)計和用生物素標(biāo)記方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，在此不再贅述。鏈霉親和素偶聯(lián)在磁珠(BeaverBeadsTMStreptavidin，海貍生物科技有限公司)上，并和脫硫生物素親和結(jié)合；RNA與磁珠-RNA探針孵育，經(jīng)過洗滌可以將非特異性結(jié)合RNA等去除；最后，再用洗脫液(針對鏈霉親和素)進(jìn)行洗脫，純化后可以驗證RNA類型。具體步驟如下：
S1、細(xì)胞的交聯(lián)、裂解及基因組DNA的消化，得到RNA樣品
S11、培養(yǎng)和收集細(xì)胞
本實施例中使用cCL-RAP細(xì)胞培養(yǎng)或PAR-CL細(xì)胞培養(yǎng)方式。采用15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)，cCL-RAP細(xì)胞的培養(yǎng)使用含10v/v％FCS DMEM，PAR-CL細(xì)胞的培養(yǎng)使用含100μM 4SU及10v/v％FCS DMEM。培養(yǎng)結(jié)束時每皿約2×107個細(xì)胞，每次實驗需要5皿細(xì)胞，共計約1×108個細(xì)胞。
S12、交聯(lián)細(xì)胞
去除培養(yǎng)基后，向培養(yǎng)皿中加入0.3ml PBS，搖動洗滌一次后，充分去除殘余PBS并將培養(yǎng)皿置于冰上；將培養(yǎng)皿置于紫外燈10～15cm距離，0.15J cm2254nm UV交聯(lián)約1min(cCL)，或者365nm UV交聯(lián)約1min(4SU-labeled，PAR-CL)。交聯(lián)結(jié)束后，盡快向培養(yǎng)皿中加入15ml預(yù)冷的PBS并短暫靜置于冰上；用細(xì)胞刮收集細(xì)胞；4℃400g離心3min收集細(xì)胞沉淀，去除上清。
S13、裂解細(xì)胞
向細(xì)胞沉淀中加入1.4ml預(yù)冷的Lysis buffer、5μl RNase Inhibitor，并充分吹打充分裂解；使用0.4mm針頭口徑注射器，抽動混勻3次，冰浴靜置裂解10min；裂解樣品立即使用或-80℃保存一周內(nèi)使用。
S14、消化基因組DNA
向細(xì)胞裂解液中添加4.8μl 1×DNase salt stock、15μl DNase(20U)，37℃溫育10min；轉(zhuǎn)移樣品到冰浴環(huán)境，快速加入20μl 0.5M EDTA、10μl 0.5M EGTA、5μl 1M DTT并充分混勻；將細(xì)胞裂解液按0.5ml、0.5ml、0.2ml及0.05ml分為四管，分別為標(biāo)示實驗組1樣品、實驗組2樣品(平行試驗)、NC組樣品和input組樣品；向NC組和各實驗組樣品中分別加入等體積2×Hybridization Buffer，充分混勻后冰上靜置10min；4℃16,000g離心10min轉(zhuǎn)移上清至新無RNase離心管中；NC組、input組和各實驗組樣品-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
S2、探針組溶液的制備：將生物素標(biāo)記的各探針溶解后混合，于85℃變性3min，快速轉(zhuǎn)移冰浴，得到探針組溶液。本實施例中，實驗組的探針組含有8條探針，NC組的探針組含有3條探針。具體序列如表1和表2所示。
表1、實驗組用探針序列
表2、NC組用探針序列
以實驗組為例說明探針組溶液的制備：向各條探針中加入100倍nmol數(shù)μl的1×TE，假如探針為1nmol的粉末，則加入100μl的TE，充分渦旋混勻后微離心后，都轉(zhuǎn)移到同一離心管中，加入1×TE調(diào)整每條探針濃度為10pmol/μl，得到探針混合液；取5μl探針混合液，其中每條探針含量為50pmol，探針總量為n×50pmol，n為探針數(shù)目；85℃變性3min后，快速轉(zhuǎn)移冰浴，得到實驗組用探針組溶液。采用相同的方法可以制備NC組用探針組溶液。
S3、磁珠預(yù)處理：使用BSA和寡核苷酸隨機(jī)引物封閉鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠。
磁珠濃度為400pmol/100μl，每1pmol探針需要1pmol磁珠，按n(探針數(shù)目)×100μl/(400pmol/50pmol)鏈霉親和素磁珠標(biāo)準(zhǔn)，為實驗組準(zhǔn)備磁珠，磁力架上收集磁珠并去上清；加入1ml 10mM Tris-HCl pH 7.5充分重懸后，顛倒混勻10次，磁力架上收集磁珠并去上清，重復(fù)洗滌2次；加入1ml 1×Hybridization Buffer充分重懸后，顛倒混勻10次，磁力架收集磁珠并去上清。向磁珠加入1ml含0.05～0.5wt％BSA和10～20μmol/L寡核苷酸隨機(jī)引物的1×TES，室溫孵育30min后置于磁力架上去除TES溶液。采用相同的方法可以制備NC組用磁珠。
S4、探針組-磁珠復(fù)合物的制備：將探針組溶液加入到預(yù)處理后的磁珠中，得到探針組-磁珠復(fù)合物。
將制備的實驗組探針組溶液加入實驗組用預(yù)處理后的磁珠中，并加入100μl2×TES，25℃旋轉(zhuǎn)溫和混合30min，磁力架上收集磁珠并去上清，加入0.35ml1×TES，溫和旋轉(zhuǎn)洗滌磁珠，置于磁力架上去除洗滌液，重復(fù)洗滌一次，得到實驗組用探針組-磁珠復(fù)合物。采用相同的方法制備NC組用探針組-磁珠復(fù)合物。
S5、反義純化
實驗組樣品中加入準(zhǔn)備的實驗組用探針組-磁珠復(fù)合物；垂直混勻器上65℃溫育變性10min，37℃孵育雜交180min，37℃洗滌2次、42℃洗滌2次、45℃洗滌2次，每次垂直混勻器搖動洗滌5min，洗滌用Wash Buffer，在使用前預(yù)熱到相應(yīng)洗滌溫度并加入0.5mM PMSF，洗滌后在磁力架上靜置1min收集磁珠棄上清；最后一次洗滌后加入500μl Wash Buffer懸浮磁珠，35℃搖動洗滌2～4min后磁力架上收集磁珠并去上清，并重復(fù)3～6次，得到實驗組用RNA-探針組-磁珠復(fù)合物。采用相同的方法制備NC組用RNA-探針組-磁珠復(fù)合物。
S6、RNA的洗脫
實驗組用RNA-探針組-磁珠復(fù)合物樣品磁珠加入50μl RNA Elution Buffer充分混勻后，95℃加熱2min；磁力架收集磁珠并轉(zhuǎn)移上清至新無RNase離心管中，重復(fù)上述步驟一次；加入25μl 5×Proteinase K buffer、1μg proteinase K，50℃溫育消化1h，得到實驗組用洗脫后的RNA樣品。采用相同的方法洗脫NC組用RNA-探針組-磁珠復(fù)合物，得到NC組用洗脫后的RNA樣品。
向input組樣品中加入25μl 5×Proteinase K buffer、1μg proteinase K、50μl RNA Elution Buffer，50℃溫育消化1h，得到input組用RNA樣品。
S7、RNA的純化
向?qū)嶒灲M用洗脫后的RNA樣品中加入等洗脫體積的(125μl)苯酚-氯仿-異戊醇混合液，顛倒混勻15s；13000g 4℃離心10min，收集上層水相并轉(zhuǎn)移到新無RNA酶離心管中；加入20μl 5M NaCl、2μl Glycogen、600μl無水乙醇，充分顛倒混勻后-80℃沉淀1～16h；4℃16100g離心30min，棄上清；加入1ml預(yù)冷的80％乙醇，4℃16100g離心10min，棄上清；室溫靜置風(fēng)干10min；加入20～30μl RNase-free water，冰上靜置保存；65℃溫育15min，充分溶解RNA及去除殘余DNA酶活性，得到純化后的實驗組樣品。采用相同的方法處理NC組用洗脫后的RNA樣品和input組用RNA樣品，分別得到純化后的NC組樣品和input組樣品。
對純化后的RNA樣品進(jìn)行了miRNA檢測，具體方法如下。取5μl RNA樣品開展1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA富集效果，結(jié)果顯示檢測到明顯的RNA富集。取2μl RNA樣品Agilent 2100檢測RNA濃度及片段大小范圍，檢測結(jié)果顯示富集得到的RNA濃度為6.9ng/μl，大小范圍為200～700bp，均在正常范圍之內(nèi)。取2μl RNA樣品nanodrop檢測RNA純度及濃度，結(jié)果顯示其純度為：OD260/280為1.91，濃度為8.9ng/μl，兩次檢測結(jié)果相近，說明已成功完成RNA的富集及純化。
為了更好的說明本實用新型的效果，實用新型人還進(jìn)行了兩組對照，對照組1采用傳統(tǒng)方法(Jesse Engreitz.RNA Antisense Purification(RAP):Experimental Protocols.2014.)檢測has-MiR-214基因；對照組2采用本實用新型RAP試劑盒檢測內(nèi)參U6基因。
使用QiagenmiScript Reverse Transcription Kit(218061)逆轉(zhuǎn)錄RNA樣品，具體方法參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書；參考2×Taq PCR試劑盒說明書配置20μl PCR擴(kuò)增體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5～10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物開展瓊脂糖凝膠電泳(2％～3％)。靶基因hsa-miR-214擴(kuò)增片段長度為約90bp，與對照組1的結(jié)果相比，均處于正確范圍，但比傳統(tǒng)方法有更好的濃度和純度。F引物序列為ACAGCAGGCACAGACAGGCAG，R引物為試劑盒自帶引物。對照組2中U6擴(kuò)增片段長度為94bp，F(xiàn)引物序列為：CTCGCTTCGGCAGCACA；R引物序列為：AACGCTTCACGAATTTGCGT。
以上所述實施例僅表達(dá)了本實用新型的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本實用新型專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本實用新型構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本實用新型的保護(hù)范圍。因此，本實用新型專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。