本發(fā)明屬于生物材料制造領(lǐng)域，涉及一種烷氧醚樹形聚合物/明膠復(fù)合冷凍凝膠、其制備方法及其應(yīng)用。屬于高分子水凝膠材料領(lǐng)域，也屬于生物醫(yī)藥中的組織工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

組織工程目的在于利用生命科學(xué)的原理和技術(shù)構(gòu)建生物組織或支持組織和器官構(gòu)建從而提高其功能?；|(zhì)在組織工程中起到至關(guān)重要的作用，主要用于維持和促進(jìn)細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)。理想的組織工程基質(zhì)應(yīng)該具有以下特征：無毒、生物相容性好、具有適合的機(jī)械性能并且降解之后不會(huì)對(duì)周圍的組織和器官產(chǎn)生危害。多孔結(jié)構(gòu)的基質(zhì)由于其有利于細(xì)胞的種植、生長(zhǎng)、分化、同時(shí)能夠向細(xì)胞及時(shí)提供養(yǎng)分及排泄廢物等優(yōu)異特點(diǎn)，近年來得到眾多關(guān)注。水凝膠是一類具有良好生物相容性的多孔基質(zhì)材料，含有超過90％的水分，且具有與人體組織類似的機(jī)械性能，因此廣泛用作細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)。水凝膠的制備方法有多種，其中采用低溫冷凍條件下，以冰晶作為模版制備得到的冷凍凝膠(cryogel)具有連續(xù)貫穿的較大孔洞結(jié)構(gòu)，可以使得傳質(zhì)效應(yīng)加強(qiáng)，是作為一種模擬生物組織和細(xì)胞基質(zhì)的優(yōu)良選擇，在細(xì)胞培養(yǎng)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

明膠是一種成本低、來源廣泛、生物相容性好、可降解、含有促進(jìn)細(xì)胞黏附基團(tuán)的一種天然高分子材料，這些優(yōu)良的特性使得其廣泛應(yīng)用于組織工程和藥物載體等研究中。但是天然明膠的機(jī)械性能不易調(diào)控、穩(wěn)定性比較差且容易被生物體降解，通過化學(xué)鍵的交聯(lián)或者改性增強(qiáng)其力學(xué)性能，比如加入戊二醛、二異氰酸鹽，碳化二亞胺等交聯(lián)劑可以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。戊二醛是使用最廣泛的，但是其存在一定的生物毒性，限制了其在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用。利用甲基丙烯酸酐改性明膠是一種比較綠色安全的方法，可利用光引發(fā)聚合或氧化還原反應(yīng)聚合，可制備成可注射凝膠、多孔材料，薄膜、微球等應(yīng)用于藥物釋放、組織工程、傷口敷料等領(lǐng)域中，但仍存在機(jī)械性能不易調(diào)控，且在生物體內(nèi)不穩(wěn)定降解速度快的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種力學(xué)性能可調(diào)控、具有多孔結(jié)構(gòu)且大小和形貌可調(diào)、具有溫敏響應(yīng)特性、生物相容性良好的水凝膠材料，能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化。

本發(fā)明的目的之二在于提供該水凝膠材料的制備方法，該方法將明膠與甲基丙烯酸酐反應(yīng)引入丙烯酸類官能團(tuán)，與帶有相同官能團(tuán)的烷氧醚樹枝化基元在冷凍溫度控制的條件下，利用氧化還原反應(yīng)制備定向多孔的水凝膠。制得的水凝膠能夠作為細(xì)胞基質(zhì)用于細(xì)胞培養(yǎng)，選擇的細(xì)胞是人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hmsc)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下反應(yīng)機(jī)理示意如下：

1.明膠改性的反應(yīng)式：

2.水凝膠的合成：

根據(jù)上述反應(yīng)機(jī)理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種烷氧醚樹形聚合物/明膠復(fù)合冷凍凝膠,其特征在于該冷凍凝膠是利用甲基丙烯酸酐改性后的明膠和樹型烷氧醚單體具有相同的丙烯酸官能團(tuán)，以過硫酸銨為氧化劑，n,n-四甲基乙二胺為催化劑，通過自由基引發(fā)鏈增長(zhǎng)的方式，通過單向冷凍的方法得到的具有定向多孔結(jié)構(gòu)的溫度響應(yīng)型的水凝膠，其固含量為6％mg/ml，孔徑大小在20～150微米，所述的樹型烷氧醚單體和甲基丙烯酸酐改性后的明膠的單體質(zhì)量比例為5～7：5～3；所述的烷氧醚樹形聚合物的結(jié)構(gòu)式為：

所述的甲基丙烯酸酐改性后的明膠的結(jié)構(gòu)式為：

一種制備上述的烷氧醚樹形聚合物/明膠復(fù)合冷凍凝膠的方法,其特征在于該方法的具體步驟為：

a.將樹型烷氧醚單體、甲基丙烯酸酐改性后的明膠、氧化劑過硫酸銨、催化劑四甲基乙二胺5-7:5-3:0.05:0.05的質(zhì)量比溶于水中，控制固含量為6％mg/ml；

b.將步驟a所得溶液在液氮環(huán)境下冷凍，待凝膠體系完全凍住轉(zhuǎn)移至-22℃中反應(yīng)過夜即得到烷氧醚樹形聚合物/明膠復(fù)合冷凍凝膠。

一種上述的烷氧醚樹形聚合物/明膠復(fù)合冷凍凝膠作為細(xì)胞基質(zhì)的應(yīng)用。

準(zhǔn)備合適尺寸大小的薄片狀凝膠，并采用熒光染料對(duì)其進(jìn)行修飾以方便觀察其結(jié)構(gòu)，將其放入多孔板中，并將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植黏附在凝膠上面進(jìn)行培養(yǎng)，最后加入活細(xì)胞熒光染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色以觀測(cè)其生長(zhǎng)狀態(tài)。

本發(fā)明采用的烷氧醚樹形聚合物是一類典型的非線形結(jié)構(gòu)聚合物，具有較大的分子尺寸以及結(jié)構(gòu)可調(diào)的優(yōu)點(diǎn)，且具有屏蔽效應(yīng)和溫敏響應(yīng)行為，本發(fā)明結(jié)合明膠和烷氧醚樹形聚合物的優(yōu)點(diǎn)制備一類復(fù)合冷凍凝膠，作為細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，采用單向冷凍的方法通過控制溶液體系的冷凍速度從而使得冰晶按照一個(gè)生長(zhǎng)方向，利用單向的冰晶可形成高度有序的多孔結(jié)構(gòu)，材料的孔徑大小可以通過控制冰晶的大小來控制，而冰晶的大小又可以利用溶液的濃度來調(diào)控。通過對(duì)孔徑大小的調(diào)控以及定向形貌特征，可對(duì)細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、分化產(chǎn)生影響，從而影響其在組織和器官中扮演的角色。此外，利用烷氧醚樹形聚合物的溫敏響應(yīng)特性，以溫度為調(diào)控參數(shù)，也可在藥物控釋方面具有應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于

1.其工藝簡(jiǎn)單可行，聚合條件溫度溫和。

2.原料成本低，生物相容性好具有溫敏行為、可模仿生物體的微環(huán)境

3.本實(shí)驗(yàn)發(fā)明的凝膠具有定向的孔結(jié)構(gòu)、可控的可降解性質(zhì)，且對(duì)細(xì)胞具有較好的黏附性，使細(xì)胞保持較高存活綠和生長(zhǎng)成不同形態(tài)。該材料在組織工程和藥物負(fù)載和控釋領(lǐng)域均具有重要的研究?jī)r(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的烷氧醚與改性明膠質(zhì)量比例為5:5、7:3和純改性明膠凝膠以及非定向方法制備凝膠樣品在共聚焦激光顯微鏡和掃描電鏡的形貌。

圖2為烷氧醚與改性明膠質(zhì)量比例為5:5、7:3和純改性明膠凝膠的流變力學(xué)。

圖3為烷氧醚與改性明膠質(zhì)量比例為5:5、7:3和純改性明膠凝膠的平行與和垂直冰晶生長(zhǎng)方向的流變力學(xué)。

圖4為烷氧醚與改性明膠質(zhì)量比例為5:5、7:3和純改性明膠凝膠的壓縮模量。

圖5為共聚焦顯微鏡觀測(cè)利用凝膠樣品(5:5)培養(yǎng)干細(xì)胞1天后和生長(zhǎng)4天后的細(xì)胞形態(tài)。

具體實(shí)施方式

甲基丙烯酸酸酐改性明膠的制備方法請(qǐng)參見：biomacromolecules2000,1,31-38。

樹型烷氧醚的合成參照參考文獻(xiàn)：macromolecules,2008,41,3659-3667。

預(yù)先將各組分配制成水溶液，烷氧醚單體20％(1g/5ml)、改性明膠10％(500mg/5ml)、氧化劑過硫酸銨5％(40mg/800ml)、催化劑四甲基乙二胺5％(40mg/800ml)。單向冷凍裝置：至少提前半小時(shí)將邊長(zhǎng)為5厘米的正方形銅塊放置于液氮中，始終保持一面在液氮液面上，使銅塊與液氮溫度保持一直。

本發(fā)明提出以下實(shí)例作為進(jìn)一步說明，但并非限制本發(fā)明權(quán)利保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：烷氧醚與改性明膠質(zhì)量比例為5:5凝膠樣品的制備：從組分母液中移取烷氧醚單體溶液300μl、改性明膠600μl、去離子水800μl，氧化劑和催化劑各80μl，整個(gè)體系成膠固含量為6w/v％。依次加入內(nèi)徑為14毫米的聚丙烯塑料磨具中，震蕩均勻并利用聚丙烯塑料泡沫隔絕周圍熱量迅速與銅面接觸(模具不能接觸到液氮)待凝膠體系完全凍住轉(zhuǎn)移至-22度冰箱中得到烷氧醚:明膠＝5:5的凝膠樣品。

實(shí)施例2:烷氧醚與改性明膠質(zhì)量比例為7:3的凝膠樣品的制備:從各組分母液中移取烷氧醚單體溶液400μl、改性之后的明膠360μl、去離子水1000μl，氧化劑和催化劑各80μl依次加入內(nèi)徑為14毫米的聚丙烯塑料磨具中，震蕩均勻并利用泡沫隔絕周圍熱量迅速與銅面接觸(模具不能接觸到液氮)待凝膠體系完全凍住轉(zhuǎn)移至-22度冰箱中反應(yīng)過夜即可得到烷氧醚:明膠＝7:3的凝膠樣品。

實(shí)施例3：利用非單向冷凍方法制備烷氧醚與改性明膠質(zhì)量比例為5:5的凝膠樣品

從組分母液中取烷氧醚單體300μl、改性明膠600μl、去離子水800μl，氧化劑和催化劑各80μl，整個(gè)體系成膠固含量為6w/v％。依次加入內(nèi)徑為14毫米的玻璃樣品瓶中，震蕩均勻迅速放置到-22度冰箱中反應(yīng)過夜。

實(shí)施例4：純改性明膠凝膠樣品的制備。從各組分母液中取明膠1200μl、去離子水560μl，氧化劑過硫酸銨120μl、催化劑過硫酸銨120μl依次加入內(nèi)徑為14毫米的聚丙烯塑料模具中，震蕩均勻并利用泡沫隔絕周圍熱量迅速與銅面接觸(模具不能接觸到液氮)待凝膠體系完全凍住轉(zhuǎn)移至-22度冰箱中反應(yīng)過夜即可得到純改性明膠凝膠樣品。

實(shí)施實(shí)例5：利用共聚焦激光顯微鏡和掃面電鏡顯微鏡觀測(cè)凝膠樣品的微觀形貌。

共聚焦激光顯微鏡觀測(cè)：利用刀片切取凝膠中間部分切成圓片，用去離子水充分洗脫后，加入少量異硫氰酸熒光素染料溶于二甲基亞砜和水的混合溶液中并利用該溶液對(duì)凝膠切片進(jìn)行染色，兩小時(shí)后將未吸附的染料洗掉，利用激光共聚焦顯微鏡20倍物鏡對(duì)凝膠形貌進(jìn)行觀測(cè)。

掃面電鏡顯微鏡觀測(cè)：將所得水凝膠樣品用去離子水充分洗脫后，凍干，同樣切取凝膠中間部分切成圓片，噴金后利用掃描電鏡進(jìn)行觀測(cè)形貌。如圖1所示，采用定向方法制備的凝膠形貌分布比較有規(guī)律，純明膠凝膠孔徑分布有一定程度的有序性，但較差。當(dāng)烷氧醚與明膠比例為5:5時(shí)，孔結(jié)構(gòu)分布有序，大小在10-50微米，當(dāng)烷氧醚增多時(shí)孔徑分布范圍變大，大小在20-100微米。采用非定向方法制備的凝膠形貌分布無規(guī)律，大小20-200微米。

實(shí)施實(shí)例6：水凝膠力學(xué)性能表征

根據(jù)上述實(shí)例1，2，3，4中的方法，制得不同烷氧醚單體和改性明膠比例為5:5和7:3、以及純改性明膠凝膠3個(gè)凝膠樣品。直徑為14毫米,高度4毫米,使用旋轉(zhuǎn)流變儀對(duì)各凝膠樣品進(jìn)行應(yīng)變掃描時(shí)，設(shè)定掃描頻率為1rad/s,掃描應(yīng)變范圍為0.01-100％。力學(xué)性能如圖2所示，純改性明膠的儲(chǔ)能模量為3kpa左右，5：5的為2kpa左右，7：3的為300pa。

實(shí)施實(shí)例7：壓縮模量測(cè)試

對(duì)實(shí)例1，2，3的方法制得水凝膠進(jìn)行壓縮測(cè)試。凝膠樣品高度12毫米直徑14毫米,測(cè)試模式應(yīng)力應(yīng)變模式、室溫，初始力為0.01n，應(yīng)變速率為10％每分鐘,形變率為20％。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)形變率為20％時(shí)，純改性明膠凝膠的儲(chǔ)能模量為9kpa左右，5：5的為2kpa左右，7：3的為400pa左右。

實(shí)施實(shí)例8：利用凝膠樣品模擬細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)

首先將凝膠切成厚度為1mm、直徑為5mm的圓形片狀，每種凝膠準(zhǔn)備4個(gè)樣品進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，采用熒光染料羅丹明對(duì)凝膠樣品進(jìn)行修飾，之后將帶有熒光標(biāo)記的凝膠放入48孔板中，分別經(jīng)70％乙醇消毒，pbs溶液洗滌，細(xì)胞培養(yǎng)液浸泡，去除培養(yǎng)液后，加入含有培養(yǎng)液的細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，于1天后加入綠色熒光活細(xì)胞示蹤劑(celltrackergreencmfdadye)進(jìn)行活細(xì)胞染色，并采用共聚焦顯微鏡對(duì)培養(yǎng)不同天數(shù)后的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行觀察。由圖5可知，凝膠基質(zhì)的微觀形貌會(huì)影響細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)行為，當(dāng)微觀形貌尺寸狹長(zhǎng)有序時(shí)，細(xì)胞沿著基質(zhì)生長(zhǎng)為狹長(zhǎng)的狀態(tài)，細(xì)胞黏附效率也下降。而無規(guī)分布的凝膠樣品細(xì)胞生長(zhǎng)形貌偏圓形，細(xì)胞分化能力很強(qiáng)。