1.本技術(shù)涉及使用crispr酶、脫氨酶和dna糖基化酶，利用用于單堿基置換的蛋白質(zhì)將胞嘧啶(c)或腺嘌呤(a)置換為任意堿基的技術(shù)。


背景技術(shù)：

2.crispr酶聯(lián)脫氨酶已被用于通過編輯發(fā)生點(diǎn)突變的基因座位來治療遺傳性紊亂，或在人或真核細(xì)胞的基因中誘導(dǎo)靶向的單核苷酸多態(tài)性(snp)。
3.目前報(bào)道的crispr酶聯(lián)脫氨酶包括：
4.1)堿基編輯器(base editor，be)，包括(i)衍生自釀膿鏈球菌(s.pyogenes)的催化缺陷的cas9(dcas9)或d10a cas9切口酶(ncas9)，以及(ii)rapobec1，大鼠的胞苷脫氨酶；
5.2)靶標(biāo)-aid，包括(i)dcas9或ncas9，以及(ii)pmcda1(其為海七鰓鰻或人aid的激活誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶(aid)直系同源物)；
6.3)crispr-x，包括ms2rna發(fā)夾連接的sgrna和dcas9，以募集與ms2結(jié)合蛋白融合的過度活躍的aid變體；以及
7.4)與胞苷脫氨酶融合的鋅指蛋白或轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物(tale)。
8.與傳統(tǒng)dna糖基化酶一起使用的crispr酶聯(lián)脫氨酶可在核苷酸中僅用胸腺嘧啶(t)置換胞嘧啶(c)，或僅用鳥嘌呤(g)置換腺嘌呤(a)。在一個(gè)實(shí)例中，其中融合了cas9、胞苷脫氨酶和尿嘧啶dna糖基化酶抑制劑(ugi)的材料用于將胞嘧啶(c)置換為胸腺嘧啶(t)。該材料用于使用誘導(dǎo)尿嘧啶(u)不被dna糖基化酶去除的機(jī)制來將尿嘧啶(u)置換為胸腺嘧啶(t)。同樣，最近有報(bào)道稱，使用腺苷脫氨酶代替胞苷脫氨酶能夠僅用鳥嘌呤(g)置換腺嘌呤(a)。
9.因此，本技術(shù)的發(fā)明人打算通過使用crispr酶、脫氨酶和dna糖基化酶開發(fā)用于單堿基置換的蛋白質(zhì)，從而用任意堿基置換胞嘧啶(c)或腺嘌呤(a)。該技術(shù)的開發(fā)可用于由突變引起的遺傳疾病的鑒別，以及用于通過分析影響由snp而來的疾病易感性或?qū)λ幬锞哂心退幮缘暮怂嵝蛄羞M(jìn)行的藥物開發(fā)和治療劑，并將在未來更有效地開發(fā)藥物以及提高治療效果。


技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

10.[技術(shù)問題]
[0011]
傳統(tǒng)的crispr酶聯(lián)脫氨酶局限于胞嘧啶(c)或腺嘌呤(a)會被轉(zhuǎn)化為特定的堿基(a或g)。由于這些限制，諸如由突變引起的遺傳疾病的鑒別、由snp而來的疾病易感性以及相關(guān)治療劑的開發(fā)等的研究范圍受到限制。
[0012]
因此，迫切需要開發(fā)能夠用任意堿基(a、t、c、g或u)而非特定堿基來置換胞嘧啶(c)或腺嘌呤(a)的手段。
[0013]
本技術(shù)旨在提供用于單堿基置換的蛋白質(zhì)或用于單堿基置換的復(fù)合物，或包含它
們的用于單堿基置換的組合物，及其用途。
[0014]
本技術(shù)旨在提供編碼用于單堿基置換的蛋白質(zhì)的核酸序列或包含所述核酸序列的載體。
[0015]
本技術(shù)旨在提供用于單堿基置換的方法。
[0016]
本技術(shù)旨在提供用于單堿基置換的蛋白質(zhì)或用于單堿基置換的復(fù)合物或包含它們的用于單堿基置換的組合物的多種用途。
[0017]
[技術(shù)方案]
[0018]
本技術(shù)提供了用于單堿基置換的融合蛋白或編碼該融合蛋白的核酸。
[0019]
本技術(shù)提供了包含編碼用于單堿基置換的融合蛋白的核酸的載體。
[0020]
本技術(shù)提供了用于單堿基置換的復(fù)合物。
[0021]
本技術(shù)提供了用于單堿基置換的組合物。
[0022]
本技術(shù)提供了用于單堿基置換的方法。
[0023]
本技術(shù)提供了使用本技術(shù)的用于單堿基置換的融合蛋白、用于單堿基置換的復(fù)合物、用于單堿基置換的組合物進(jìn)行表位篩選、耐藥基因或蛋白質(zhì)篩選、藥物敏化篩選或病毒抗性基因或蛋白質(zhì)篩選的用途。
[0024]
本技術(shù)提供了用于單堿基置換的融合蛋白或編碼該融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含(a)crispr酶或其變體、(b)脫氨酶、和(c)dna糖基化酶或其變體。其中，用于單堿基置換的融合蛋白誘導(dǎo)任意堿基對靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中包含的胞嘧啶或腺嘌呤的置換。
[0025]
本技術(shù)提供了用于單堿基置換的融合蛋白或編碼該融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含以下的任一組分：(i)n末端-[crispr酶]-[脫氨酶]-[dna糖基化酶]-c末端；(ii)n末端-[crispr酶]-[dna糖基化酶]-[脫氨酶]-c末端；(iii)n末端-[脫氨酶]-[crispr酶]-[dna糖基化酶]-c末端；(iv)n末端-[脫氨酶]-[dna糖基化酶]-[crispr酶]-c末端；(v)n末端-[dna糖基化酶]-[crispr酶]-[脫氨酶]-c末端；以及(vi)n末端-[dna糖基化酶]-[脫氨酶]-[crispr酶]-c末端。
[0026]
本技術(shù)提供了用于單堿基置換的復(fù)合物，所述復(fù)合物包含(a)crispr酶或其變體；(b)脫氨酶；(c)dna糖基化酶；和(d)兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其中，用于單堿基置換的融合蛋白誘導(dǎo)任意堿基對靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中包含的胞嘧啶或腺嘌呤的置換。
[0027]
根據(jù)本技術(shù)，在用于單堿基置換的復(fù)合物中，crispr酶、脫氨酶和dna糖基化酶中的每一個(gè)與一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。其中，所述crispr酶、所述脫氨酶和所述dna糖基化酶通過結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的相互作用形成所述復(fù)合物。
[0028]
根據(jù)本技術(shù)，在用于單堿基置換的復(fù)合物中，選自于crispr酶、脫氨酶和dna糖基化酶中的任一種與第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。其中，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域與另一組分的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)橄嗷プ饔脤Γ⑶业诙Y(jié)合結(jié)構(gòu)域與再一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)橄嗷プ饔脤?。其中，所述?fù)合物通過所述對形成。
[0029]
根據(jù)本技術(shù)，用于單堿基置換的復(fù)合物包含(i)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包含選自于crispr酶、脫氨酶和dna糖基化酶的兩種組分以及第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及(ii)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含以上未被選擇的另一組分以及第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其中，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)橄嗷プ饔脤Γ⑶宜鰪?fù)合物通過所述對形成。
[0030]
根據(jù)本技術(shù)，用于單堿基置換的復(fù)合物包含(i)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包含脫氨酶、dna糖基化酶和第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及(ii)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含crispr酶和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0031]
其中，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)閱捂溈勺兤?scfv)，并且第二融合蛋白進(jìn)一步包含至少一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述進(jìn)一步包含的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)間cn4肽。其中，第一融合蛋白中的兩個(gè)或更多個(gè)可通過與gcn4肽中的任一個(gè)相互作用形成復(fù)合物。
[0032]
本技術(shù)可提供用于單堿基置換的組合物，所述組合物包含(a)向?qū)na或編碼所述向?qū)na的核酸，以及(b)i)如權(quán)利要求1所述的用于單堿基置換的融合蛋白或編碼所述融合蛋白的核酸，或ii)如權(quán)利要求13所述的用于單堿基置換的復(fù)合物。其中，所述向?qū)na與靶核酸序列互補(bǔ)結(jié)合，其中，與所述向?qū)na結(jié)合的靶核酸序列為15bp至25bp。其中，用于單堿基置換的融合蛋白或用于單堿基置換的復(fù)合物誘導(dǎo)任意堿基對包含靶核酸序列的靶區(qū)域中存在的一個(gè)或多個(gè)胞嘧啶或腺嘌呤的置換。
[0033]
根據(jù)本技術(shù)，用于單堿基置換的組合物可包括一個(gè)或多個(gè)載體。
[0034]
本技術(shù)可提供用于單堿基置換的方法，所述方法包括：使(i)和(ii)在體外(in vitro)或離體(ex vivo)與包含靶核酸序列的靶區(qū)域接觸，其中，(i)為向?qū)na，(ii)為如權(quán)利要求1所述的用于單堿基置換的融合蛋白或如權(quán)利要求12所述的用于單堿基置換的復(fù)合物。其中，所述向?qū)na與靶核酸序列互補(bǔ)結(jié)合，其中，與所述向?qū)na結(jié)合的靶核酸序列為15bp至25bp，并且其中，用于單堿基置換的融合蛋白或用于單堿基置換的復(fù)合物誘導(dǎo)任意堿基對包含靶核酸序列的靶區(qū)域中存在的一個(gè)或多個(gè)胞嘧啶或腺嘌呤的置換。
[0035]
其中，所述脫氨酶為胞苷脫氨酶，并且所述dna糖基化酶為尿嘧啶-dna糖基化酶或其變體。其中，用于單堿基置換的融合蛋白誘導(dǎo)任意堿基對靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中包含的c(胞嘧啶)的置換。
[0036]
其中，所述胞苷脫氨酶可為apobec，激活誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶(aid)或其變體。
[0037]
其中，所述脫氨酶可為腺苷脫氨酶，并且所述dna糖基化酶可為烷基腺嘌呤dna糖基化酶或其變體。其中，用于單堿基置換的融合蛋白可誘導(dǎo)任意堿基對靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中包含的腺嘌呤的置換。
[0038]
其中，所述腺苷脫氨酶可為tada、tad2p、ada、ada1、ada2、adar2、adat2、adat3或它們的變體。
[0039]
其中，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為選自于frb結(jié)構(gòu)域、fkbp二聚化結(jié)構(gòu)域、內(nèi)含肽、ert結(jié)構(gòu)域、vpr結(jié)構(gòu)域、gcn4肽、單鏈可變片段(scfv)中的任一種，或形成異二聚體的結(jié)構(gòu)域中的任一種。
[0040]
其中，在用于單堿基置換的復(fù)合物中，所述對可為選自于以下(i)至(vi)中的任一種：(i)frb結(jié)構(gòu)域和fkbp二聚化結(jié)構(gòu)域；(ii)第一內(nèi)含肽和第二內(nèi)含肽；(iii)ert結(jié)構(gòu)域和vpr結(jié)構(gòu)域；(iv)gcn4肽和單鏈可變片段(scfv)；以及(v)用于形成異二聚體的第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域。
[0041]
[有益效果]
[0042]
本技術(shù)提供了用于單堿基置換的蛋白和/或編碼所述蛋白的核酸。
[0043]
本技術(shù)提供了用于單堿基置換的組合物，所述組合物包含用于單堿基置換的蛋白和/或編碼所述蛋白的核酸。
[0044]
本技術(shù)提供了用于單堿基置換的蛋白或包含所述蛋白的用于單堿基置換的組合物的各種用途。
附圖說明
[0045]
圖1為說明使用用于單堿基置換的蛋白將靶核酸區(qū)域中的胞嘧啶(c)置換為n(a、t或g)的方法的圖。
[0046]
圖2為說明使用用于單堿基置換的蛋白將靶核酸區(qū)域中的腺嘌呤(a)置換為n(c、t或g)的方法的圖。
[0047]
圖3為說明用于單堿基置換的融合蛋白誘導(dǎo)任意堿基置換胞嘧啶的各種設(shè)計(jì)的圖。
[0048]
圖4為說明用于單堿基置換的融合蛋白誘導(dǎo)任意堿基置換腺嘌呤的各種設(shè)計(jì)的圖。
[0049]
圖5(a)為具有融合至羧基端的10個(gè)相同gcn4肽的ncas9；以及，圖5(b)和圖5(c)為復(fù)合物(scfv-apobec-ung和scfv-ung-apobec)的各種設(shè)計(jì)，其中單鏈可變片段(scfv)分別與apobec和ung融合。
[0050]
圖6(a)為說明復(fù)合物的設(shè)計(jì)的圖，其中，5個(gè)相同的gcn4肽與ncas9的n末端和c末端各自融合，一個(gè)scfv與apobec融合，另一個(gè)scfv與ung融合。圖6(b)為說明復(fù)合物的設(shè)計(jì)的圖表，其中，5個(gè)相同的gcn4肽與ncas9的c末端融合，一個(gè)scfv與apobec融合，另一個(gè)scfv與ung融合。
[0051]
圖7(a)示出了be3 wt和bpnls be3的設(shè)計(jì)；以及，圖7(b)為示出了在hek細(xì)胞中使用be3 wt和bpnls be3進(jìn)行的單堿基置換效率的圖表。
[0052]
圖8為示出了在hela細(xì)胞中使用be3 wt、ncas-delta ugi、ung-ncas和ncas-ung進(jìn)行的c至g、c至t或者c至a的置換率的圖。ncas-delta ugi為從be3 wt中移除尿嘧啶dna-糖基化酶抑制劑(ugi)的蛋白。
[0053]
圖9示出了在靶區(qū)域中誘導(dǎo)堿基置換的核酸序列(seq id no：1)。此外，圖9還示出了在hela細(xì)胞中使用be3 wt、bpnls be3、ncas-delta ugi、ung-ncas和ncas-ung進(jìn)行的核酸序列(seq id no：1)中第15位胞嘧啶和第16位胞嘧啶的堿基置換率。
[0054]
圖10為確認(rèn)在hek細(xì)胞中靶向gx20 sgrna的hemx1靶核酸序列中的胞嘧啶置換的圖表。
[0055]
圖11為示出了在hek細(xì)胞中使用ung-ncas和ncas-ung進(jìn)行的單堿基置換效率的一組圖表。左圖示出了gx20 sgrna靶向的hemx1靶核酸序列中的c至n置換率。右圖示出了gx20 sgrna靶向的hemx1靶核酸序列中13c、15c、16c和17c位置的c至g或c至a的置換率。
[0056]
圖12為確認(rèn)nureki ncas9是否在hek細(xì)胞中的ng pam處具有c至n堿基置換的一組圖表。
[0057]
圖13為確認(rèn)使用圖5的用于單堿基置換的復(fù)合物是否發(fā)生c至n堿基置換的圖表。
[0058]
圖14為鑒別使用圖5的用于單堿基置換的復(fù)合物在pc9細(xì)胞中靶向hemx1gx19sgrna的核酸序列中發(fā)生置換的c的圖表。
[0059]
圖15為示出了在pc9細(xì)胞中使用圖5的用于單堿基置換的復(fù)合物在靶向hemx1sgrna的序列中的16c位置處的c至g、c至t或者c至a置換率的圖表。
[0060]
圖16示出了編碼使用ncas9的用于單堿基置換的蛋白的質(zhì)粒的設(shè)計(jì)。用于單堿基置換的編碼蛋白在圖3(a)的1)中予以說明。
[0061]
圖17示出了使用nureki ncas9的用于單堿基置換的crispr蛋白的質(zhì)粒的設(shè)計(jì)。用于單堿基置換的編碼蛋白在圖3(c)的2)中予以說明。
[0062]
圖18示出了編碼使用ncas9的用于單堿基置換的蛋白的質(zhì)粒的設(shè)計(jì)。用于單堿基置換的編碼蛋白在圖3(a)的3)中予以說明。
[0063]
圖19示出了編碼圖4(a)中所示的用于單堿基置換的蛋白的質(zhì)粒的設(shè)計(jì)。
[0064]
圖20示出了編碼圖4(b)中所示的用于單堿基置換的蛋白的質(zhì)粒的設(shè)計(jì)。
[0065]
圖21為說明包含單鏈可變片段(scfv)的融合堿基置換結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)的圖。
[0066]
圖22至圖24為示出在hek細(xì)胞中使用用于單堿基置換的復(fù)合物的單堿基置換效率的圖表，其中，圖22示出了gx20 sgrna靶向的hemx1靶核酸序列(seq id no：1)中11c位置處的c至g、c至a或者c至g的置換率，圖23示出了gx20 sgrna靶向的hemx1靶核酸序列(seq id no：1)中15c位置處的c至g、c至a或者c至g置換率，以及圖24示出了gx20 sgrna靶向的hemx1靶核酸序列(seq id no：1)中16c位置處的c至g、c至a或者c至g置換率。
[0067]
圖25示出了sgrna(seq id no：2-seq id no：20)中的三種(seq id no：2、seq id no：3和seq id no：19)，其顯示于發(fā)表在科學(xué)雜志《nature》上標(biāo)題為“base editing of a,t to g,c in genomic dna without dna cleavage”的文章的擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2中。
[0068]
圖26為示出了使用圖25中選擇的sgrna1(seq id no：2)在hek293t細(xì)胞中的a至n堿基置換率的一組圖表。
[0069]
圖27為示出了使用圖25中選擇的sgrna2(seq id no：3)在hek293t細(xì)胞中的a至n堿基置換率的一組圖表。
[0070]
圖28為示出了使用圖25中選擇的sgrna3(seq id no：19)在hek293t細(xì)胞中的a至n堿基置換率的一組圖表。
[0071]
圖29為示出了使用分別能夠與egfr基因的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合的sgrna1(seq id no：21)和sgrna2(seq id no：22)在pc9細(xì)胞中的c至n堿基置換率的圖表。
[0072]
圖30為示出了使用能夠與egfr基因的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合的sgrna1(seq id no：21)和sgrna2(seq id no：22)在pc9細(xì)胞中的c至a、c至t或者c至g堿基置換率的一組圖表。
[0073]
圖31為分析在胞嘧啶的隨機(jī)堿基置換后在補(bǔ)充有奧希替尼(osimertinib)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)下存活的細(xì)胞的結(jié)果。
具體實(shí)施方式
[0074]
除非另有定義，本說明書中使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或?qū)嶒?yàn)中可使用與本說明書中描述的方法和材料相似或等效的方法和材料，下文描述了合適的方法和材料。本說明書中提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)均通過引用的方式以其整體被并入。此外，所述材料、方法和實(shí)施例僅為說明性的而非限制。
[0075]
本技術(shù)提供了用于單堿基置換的蛋白(單堿基置換蛋白)，所述蛋白包含(a)crispr酶或其變體、(b)脫氨酶、以及(c)dna糖基化酶或其變體。
[0076]
本技術(shù)提供了用于單堿基置換的組合物，所述組合物包含用于單堿基置換的蛋白
和(d)向?qū)na。
[0077]
此處，用于單堿基置換的蛋白可與向?qū)na同時(shí)作用以誘導(dǎo)任意含氮堿基(nitrogenous base)對靶核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸中包含的胞嘧啶(c)或腺嘌呤(a)的置換。
[0078]
根據(jù)本技術(shù)提供的用于單堿基置換的蛋白的(a)crispr酶和(d)向?qū)na的組合可特異性地將所述用于單堿基置換的蛋白引導(dǎo)至包含靶核酸序列的靶區(qū)域。
[0079]
此處，用于單堿基置換的蛋白的(b)脫氨酶和(c)dna糖基化酶的組合可誘導(dǎo)另一堿基對靶區(qū)域中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的堿基的置換。
[0080]
含氮堿基
[0081]
本文使用的“含氮堿基”是指嘌呤堿基或嘧啶堿基，其為核苷酸或核堿基的一種組成成分。
[0082]
本文使用的含氮堿基可簡稱為堿基，并且所述堿基可指腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)、羥基嘌呤(h)、鳥嘌呤(g)或胞嘧啶(c)。
[0083]
本技術(shù)中堿基的縮寫，例如a、t、c、g、u或h，在與堿基置換相關(guān)的上下文中使用時(shí)指含氮堿基。此外，當(dāng)在與說明書中設(shè)定的seq id no、通用核酸、或核苷酸序列相關(guān)的上下文中使用時(shí)，它們是指本領(lǐng)域中通常使用的核酸或核苷酸。
[0084]
在一個(gè)實(shí)例中，“用鳥嘌呤(g)置換腺嘌呤(a)”可意指將核酸序列上相同位置或相同類型的核苷酸中的含氮堿基從a置換為g。
[0085]
在一個(gè)實(shí)例中，“用胸腺嘧啶(t)置換腺嘌呤(a)”可意指將核酸序列上相同位置或相同類型的核苷酸中的含氮堿基從a置換為t。
[0086]
在一個(gè)實(shí)例中，“用胞嘧啶(c)置換腺嘌呤(a)”可意指將核酸序列上相同位置或相同類型的核苷酸中的含氮堿基從a置換為c。
[0087]
在一個(gè)實(shí)例中，“用鳥嘌呤(g)置換胞嘧啶(c)”可意指核酸序列上相同位置或相同類型的核苷酸中的含氮堿基從c置換為g。
[0088]
在一個(gè)實(shí)例中，“用胸腺嘧啶(t)置換胞嘧啶(c)”可意指核酸序列上相同位置或相同類型的核苷酸中的含氮堿基從c置換為t。
[0089]
在一個(gè)實(shí)例中，“用腺嘌呤(a)置換胞嘧啶(c)”可意指核酸序列上相同位置或相同類型的核苷酸中的含氮堿基從c置換為a。
[0090]
在一個(gè)實(shí)例中，“3'-atgcaaa-5'”并非指含氮堿基，而是代表本領(lǐng)域通常使用的核酸序列或核苷酸序列。
[0091]
堿基置換或堿基修飾
[0092]
本文使用的“堿基置換”意指將靶基因中核苷酸的堿基置換為另一堿基。更具體而言，將靶區(qū)域中核苷酸的堿基用另一堿基來置換。
[0093]
在一個(gè)實(shí)例中，堿基置換可意指將腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)、羥基嘌呤或尿嘧啶(u)變?yōu)榱硪粔A基。
[0094]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，堿基置換可意指將腺嘌呤用胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、羥基嘌呤或鳥嘌呤置換。
[0095]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，堿基置換可意指將胞嘧啶用腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、羥基嘌呤或鳥嘌呤置換。
[0096]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，堿基置換可意指將鳥嘌呤用胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、羥基嘌呤或腺嘌呤置換。
[0097]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，堿基置換可意指將胸腺嘧啶用腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、羥基嘌呤或鳥嘌呤置換。
[0098]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，堿基置換可意指將尿嘧啶用胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、羥基嘌呤或鳥嘌呤置換。
[0099]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，堿基置換可意指將羥基嘌呤用腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或鳥嘌呤置換。
[0100]
然而，本發(fā)明不限于此。
[0101]
本文使用的“堿基置換”可為包含“堿基修飾”的概念。此處，修飾可意指通過堿基結(jié)構(gòu)的修飾而變?yōu)榱硪粔A基，并且堿基置換可意指堿基類型的改變。
[0102]
在一個(gè)實(shí)例中，堿基修飾是改變腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)、羥基嘌呤或尿嘧啶(u)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0103]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，堿基修飾可為通過腺嘌呤的脫氨基將腺嘌呤變?yōu)榇吸S嘌呤。
[0104]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，堿基修飾可為次黃嘌呤變?yōu)轼B嘌呤。
[0105]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，堿基修飾可為通過胞嘧啶的脫氨基將胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏ぁ?br/>[0106]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，堿基修飾可為尿嘧啶變?yōu)樾叵汆奏ぁ?br/>[0107]
然而，本發(fā)明不限于此。
[0108]
靶核酸序列——與向?qū)na互補(bǔ)結(jié)合的核酸序列
[0109]
靶核酸序列意指可以或能夠與向?qū)na互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸序列，所述向?qū)na為用于單堿基置換的組合物的組成成分。
[0110]
在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)雙鏈dna經(jīng)受單堿基置換時(shí)，所述細(xì)胞內(nèi)雙鏈dna由第一dna鏈和第二dna鏈組成。此處，所述雙鏈dna的第一dna鏈和與第一dna鏈互補(bǔ)的第二dna鏈中的任一個(gè)都可包含靶核酸序列。包含靶核酸序列的第一dna鏈或第二dna鏈可與向?qū)na結(jié)合。此處，與向?qū)na結(jié)合的第一dna鏈或第二dna鏈中的核酸序列對應(yīng)于靶核酸序列。
[0111]
在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)雙鏈rna經(jīng)受單堿基置換時(shí)，所述細(xì)胞內(nèi)雙鏈rna由第一rna鏈和第二rna鏈組成。所述雙鏈rna的第一rna鏈和與第一rna鏈互補(bǔ)的第二rna鏈中的任一個(gè)都可包含靶核酸序列。包含靶核酸序列的第一rna鏈或第二rna鏈可與向?qū)na結(jié)合。此處，與向?qū)na結(jié)合的第一rna鏈或第二rna鏈的核酸序列對應(yīng)于靶核酸序列。
[0112]
在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)雙鏈dna或rna經(jīng)受單堿基置換時(shí)，單鏈dna或rna可包含靶核酸序列。即，單鏈dna或rna可與向?qū)na結(jié)合，并且此處，與向?qū)na結(jié)合的核酸序列對應(yīng)于靶核酸序列。
[0113]
在一個(gè)實(shí)例中，所述靶核酸序列可為10bp、11bp、12bp、13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp或30bp或更多的核苷酸序列。
[0114]
靶區(qū)域
–
包含堿基置換的核苷酸的區(qū)域
[0115]
靶區(qū)域?yàn)榘ㄟ^用于單堿基置換的蛋白誘導(dǎo)堿基置換的核苷酸的區(qū)域。
[0116]
靶區(qū)域?yàn)榘驅(qū)na結(jié)合的靶核酸序列的區(qū)域。此處，靶核酸序列可包含通過用于單堿基置換的蛋白誘導(dǎo)堿基置換的核苷酸。
[0117]
靶區(qū)域包含與第一dna鏈中的靶核酸序列互補(bǔ)結(jié)合的第二dna鏈中的核酸序列，所述第一dna鏈與向?qū)na互補(bǔ)結(jié)合。此處，第二dna鏈中的核酸序列可包含通過用于單堿基置換的蛋白誘導(dǎo)堿基置換的核苷酸。
[0118]
在一個(gè)實(shí)例中，雙鏈dna或rna中包含靶核酸序列的鏈可稱為第一鏈，并且不包含靶核酸序列的鏈可稱為第二鏈。此處，靶區(qū)域可包含第一鏈中與向?qū)na互補(bǔ)結(jié)合的靶核酸序列以及與靶核酸序列互補(bǔ)結(jié)合的第二鏈中的核酸序列。
[0119]
在一個(gè)實(shí)例中，雙鏈dna或rna中包含靶核酸序列的鏈可稱為第二鏈，并且不包含靶核酸序列的鏈可稱為第一鏈。此處，靶區(qū)域可包含第二鏈中與向?qū)na互補(bǔ)結(jié)合的靶核酸序列以及與靶核酸序列互補(bǔ)結(jié)合的第一鏈中的核酸序列。
[0120]
用于單堿基置換的蛋白可誘導(dǎo)靶區(qū)域中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的堿基置換。
[0121]
在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)向?qū)na與包含在雙鏈dna的第一dna鏈中的靶核酸序列互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，用于單堿基置換的蛋白可置換(i)靶核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基，或(ii)與雙鏈dna的第二鏈中的靶核酸序列互補(bǔ)結(jié)合的核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基。
[0122]
在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)向?qū)na與包含在雙鏈rna的第一rna鏈中的靶核酸序列互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，用于單堿基置換的蛋白可置換(i)靶核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基，或(ii)與雙鏈rna的第二鏈中的靶核酸序列互補(bǔ)結(jié)合的核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基。
[0123]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，靶核酸區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的胞嘧啶可用鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤或腺嘌呤置換。
[0124]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，靶核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的腺嘌呤可用鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤或胞嘧啶置換。
[0125]
本文使用的靶基因是指包含靶區(qū)域和靶核酸序列的基因。另外，本說明書中的靶基因是指其中通過用于單堿基置換的蛋白將靶區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的胞嘧啶置換為任意堿基的基因。
[0126]
技術(shù)特征——用任意堿基置換
[0127]
本技術(shù)所提供的用于單堿基置換的蛋白包含(i)脫氨酶和(ii)dna糖基化酶作為必需組成成分。
[0128]
用于單堿基置換的蛋白的第一組分(其為脫氨酶)以及用于單堿基置換的蛋白的第二組分(其為dna糖基化酶)的組合可誘導(dǎo)任意堿基對核酸序列中的核苷酸的堿基的置換。
[0129]
此處，由脫氨酶和dna糖基化酶進(jìn)行的堿基置換可由如下兩個(gè)步驟引起：依次或同時(shí)進(jìn)行(i)堿基脫氨基和/或(ii)通過dna糖基化酶進(jìn)行剪切或修復(fù)。
[0130]
第一過程：堿基的脫氨基
[0131]
脫氨基意指涉及氨基基團(tuán)的剪切的生化反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)例中，在dna的情況下，脫氨基可指堿基的氨基基團(tuán)(其為核苷酸的一個(gè)組成成分)變?yōu)榱u基或酮基。
[0132]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，脫氨酶可為胞苷脫氨酶。胞苷脫氨酶可通過胞嘧啶的脫氨基來提供尿嘧啶。胞苷脫氨酶可通過胞嘧啶的修飾來提供尿嘧啶。
[0133][0134]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，用于單堿基置換的蛋白的脫氨酶可為腺苷脫氨酶。腺苷脫氨酶可通過腺嘌呤的脫氨基來提供次黃嘌呤。腺苷脫氨酶可通過腺嘌呤的修飾來提供羥基嘌呤(次黃嘌呤)。
[0135][0136]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，脫氨酶可為鳥嘌呤脫氨酶。鳥嘌呤脫氨酶可通過鳥嘌呤的脫氨基來提供黃嘌呤。鳥嘌呤脫氨酶可通過鳥嘌呤的修飾來提供黃嘌呤。
[0137][0138]
第二過程：dna糖基化
[0139]
dna糖基化酶是參與堿基切除修復(fù)(ber)的酶，并且ber是移除和替換dna的受損堿基的機(jī)制。dna糖基化酶通過水解dna的堿基和脫氧核糖之間的n-糖苷鍵來催化該機(jī)制的第一步。dna糖基化酶移除受損的含氮堿基，同時(shí)保持糖-磷酸骨架完整。結(jié)果，產(chǎn)生了ap位點(diǎn)，特別是無嘌呤位點(diǎn)或無嘧啶位點(diǎn)。之后，可通過ap核酸內(nèi)切酶、末端加工酶、dna聚合酶、flap核酸內(nèi)切酶和/或dna連接酶進(jìn)行用任意堿基的置換。
[0140]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，dna糖基化酶可為尿嘧啶dna糖基化酶。尿嘧啶dna糖基化酶水解dna中尿嘧啶和脫氧核糖之間的n-糖苷鍵。尿嘧啶dna糖基化酶水解包含尿嘧啶的核苷酸中的尿嘧啶和脫氧核糖之間的n-糖苷鍵。此處，可使用作用于包含胞嘧啶的核苷酸的胞苷脫氨酶通過脫氨基來提供含尿嘧啶的核苷酸。
[0141]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，dna糖基化酶可為烷基腺嘌呤dna糖基化酶。烷基腺嘌
呤dna糖基化酶水解dna中羥基嘌呤(次黃嘌呤)和脫氧核糖之間的n-糖苷鍵。烷基腺嘌呤dna糖基化酶水解包含羥基嘌呤的核苷酸中的羥基嘌呤和脫氧核糖之間的n-糖苷鍵。此處，可使用作用于包含腺嘌呤的核苷酸的腺苷脫氨酶通過脫氨基來提供包含羥基嘌呤的核苷酸。
[0142]
第一過程和第二過程的結(jié)果
[0143]
可使用本技術(shù)中提供的用于單堿基置換的蛋白將靶區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)腺嘌呤或胞嘧啶置換為任意堿基。
[0144]
在一個(gè)實(shí)例中，用于單堿基置換的蛋白的脫氨酶可為腺苷脫氨酶，并且用于單堿基置換的蛋白的dna糖基化酶可為烷基腺嘌呤-dna糖基化酶或其變體。此處，用于單堿基置換的融合蛋白(單堿基置換融合蛋白)可誘導(dǎo)任意堿基(鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)對靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中的腺嘌呤的置換。
[0145]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，胞嘧啶對靶區(qū)域中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中的腺嘌呤的置換可由包含如下的用于單堿基置換的蛋白來誘導(dǎo)：(a)crispr酶或其變體；(b)腺苷脫氨酶；以及(c)烷基腺嘌呤dna糖基化酶。
[0146][0147]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，胸腺嘧啶對靶區(qū)域中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中的腺嘌呤的置換可由包含如下的用于單堿基置換的蛋白來誘導(dǎo)：(a)crispr酶或其變體；(b)腺苷脫氨酶；以及(c)烷基腺嘌呤dna糖基化酶。
[0148][0149]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，鳥嘌呤對靶區(qū)域中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中的腺嘌呤的置換可由包含如下的用于單堿基置換的蛋白來誘導(dǎo)：(a)crispr酶或其變體；(b)腺苷脫氨酶；以及(c)烷基腺嘌呤dna糖基化酶。
[0150]
[0151]
在一個(gè)實(shí)例中，用于單堿基置換的蛋白的脫氨酶可為胞苷脫氨酶，并且其dna糖基化酶可為尿嘧啶dna糖基化酶或其變體。此處，用于單堿基置換的融合蛋白可誘導(dǎo)任意堿基對靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的胞嘧啶的置換。
[0152]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，腺嘌呤對靶區(qū)域中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中的胞嘧啶的置換可由包含如下的用于單堿基置換的蛋白來誘導(dǎo)：(a)crispr酶或其變體；(b)胞苷脫氨酶；以及(c)尿嘧啶dna糖基化酶。
[0153][0154]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，胸腺嘧啶對靶區(qū)域中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中的胞嘧啶的置換可由包含如下的用于單堿基置換的蛋白來誘導(dǎo)：(a)crispr酶或其變體；(b)胞苷脫氨酶；以及(c)尿嘧啶dna糖基化酶。
[0155][0156]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，鳥嘌呤對靶區(qū)域中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中的胞嘧啶的置換可由包含如下的用于單堿基置換的蛋白來誘導(dǎo)：(a)crispr酶或其變體；(b)胞苷脫氨酶；以及(c)尿嘧啶dna糖基化酶。
[0157][0158]
以下，將詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0159]
說明書中公開的本發(fā)明的一個(gè)方面為用于單堿基置換的蛋白。
[0160]
用于單堿基置換的蛋白為能夠誘導(dǎo)或產(chǎn)生單堿基置換的蛋白、多肽或肽。
[0161]
傳統(tǒng)堿基編輯器的局限
[0162]
傳統(tǒng)堿基編輯器以脫氨酶、crispr酶和dna糖基化酶抑制劑的融合、聯(lián)結(jié)或連接的形式使用。作為代表性的實(shí)例，使用連接了來自大鼠的胞苷脫氨酶(例如rapobec)、ncas9和尿嘧啶dna糖基化酶的堿基編輯器，將胞嘧啶堿基置換為胸腺嘧啶。此外，使用腺苷脫氨酶代替胞苷脫氨酶將腺嘌呤(a)置換為鳥嘌呤(g)。
[0163]
重要的是，傳統(tǒng)的堿基編輯器可通過修正基因中的點(diǎn)突變位點(diǎn)來治療由點(diǎn)突變引起的疾病(例如遺傳性紊亂)。然而，傳統(tǒng)的堿基編輯器具有局限性，即通過移除氨基基團(tuán)(-nh2)或使用dna糖基化酶抑制劑將氨基基團(tuán)置換為酮基基團(tuán)，將胞嘧啶(c)僅改變?yōu)樘囟▔A基胸腺嘧啶(t)，或者將腺嘌呤(a)僅改變?yōu)樘囟▔A基鳥嘌呤(g)。
[0164]
用于單堿基置換的蛋白的效用
[0165]
使用傳統(tǒng)的堿基編輯器具有限制性，即由被置換的堿基表達(dá)的氨基酸具有不同類型的可能性很低。大多數(shù)疾病或紊亂不是由點(diǎn)突變引起的，而是很可能是由肽、多肽或蛋白質(zhì)水平(而不是核苷酸水平)的結(jié)構(gòu)或功能異常引起的。畢竟，由于傳統(tǒng)的堿基編輯器只能將腺嘌呤和胞嘧啶變成特定的堿基，因此改變肽、多肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可能性顯著降低。
[0166]
使用本說明書中提供的用于單堿基置換的蛋白可克服現(xiàn)有技術(shù)的局限。本技術(shù)提供的用于單堿基置換的蛋白具有由以下組成的新型組合：(a)編輯器蛋白、(b)脫氨酶以及(c)dna糖基化酶。也就是說，本技術(shù)提供的用于單堿基置換的蛋白具有將腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)或胞嘧啶(c)置換為任意堿基(a、t、c、g、u或h)的優(yōu)點(diǎn)。
[0167]
此外，具有新組成成分及其新組合的用于單堿基置換的蛋白具有同時(shí)置換靶核酸序列中存在的一個(gè)或多個(gè)堿基的優(yōu)點(diǎn)。
[0168]
因此，本技術(shù)提供的用于單堿基置換的蛋白可提供將各種堿基隨機(jī)置換的“突變”?？捎赏蛔兊幕虮磉_(dá)具有各種結(jié)構(gòu)的肽、多肽或蛋白質(zhì)。
[0169]
由于上述技術(shù)效果，本技術(shù)提供的用于單堿基置換的蛋白可用于表位篩選、耐藥基因或蛋白質(zhì)篩選、藥物敏化篩選和/或病毒抗性基因或蛋白質(zhì)篩選。
[0170]
本技術(shù)提供的用于單堿基置換的蛋白通過與向?qū)na共同使用，可誘導(dǎo)任意堿基對靶基因的靶區(qū)域中堿基的置換。
[0171]
[用于單堿基置換的蛋白的第一組分-脫氨酶]
[0172]
脫氨酶是參與移除氨基基團(tuán)的酶，并包括將化合物的氨基基團(tuán)變?yōu)榱u基或酮基基團(tuán)的酶。存在催化與胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤、腺苷、胞苷、amp和adp等中的每一個(gè)結(jié)合的氨基基團(tuán)的酶，并且這種酶通常包含在動物組織中。
[0173]
本文使用的脫氨酶可稱為堿基置換結(jié)構(gòu)域。此處，堿基置換結(jié)構(gòu)域是指參與用任意其它堿基置換靶基因中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的堿基的肽、多肽、結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)。
[0174]
本技術(shù)的脫氨酶可為胞苷脫氨酶。
[0175]
此處，胞苷脫氨酶是指具有移除胞嘧啶、胞苷或脫氧胞苷的氨基(-nh2)基團(tuán)活性的任意酶。本說明書中的胞苷脫氨酶作為包括胞嘧啶脫氨酶在內(nèi)的概念使用。本說明書中的胞苷脫氨酶可與胞嘧啶脫氨酶互換使用。
[0176]
胞苷脫氨酶可將胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏ぁ?br/>[0177]
胞苷脫氨酶可將胞苷變?yōu)槟蜍铡?br/>[0178]
胞苷脫氨酶可將脫氧胞苷變?yōu)槊撗跄蜍铡?br/>[0179]
胞苷脫氨酶是指具有將核苷酸中存在的堿基胞嘧啶(例如存在于雙鏈dna或rna中的胞嘧啶)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(c至u轉(zhuǎn)化或c至u編輯)的活性的酶，并將位于具有靶位點(diǎn)序列(靶核酸序列)的pam序列的鏈中的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。
[0180]
在一個(gè)實(shí)例中，胞苷脫氨酶可來源于：原核生物，例如大腸桿菌(escherichia coli)；或哺乳動物，例如靈長類動物(如人和猴)，以及嚙齒動物(例如大鼠和小鼠)，但本發(fā)
明不限于此。例如，胞苷脫氨酶可為apobec(“載脂蛋白b mrna編輯酶，催化多肽樣”)或選自屬于激活誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶(aid)家族的一種或多種。
[0181]
胞苷脫氨酶可為apobec1、apobec2、apobec3b、apobec3c、apobec3d、apobec3f、apobec3g、apobec3h、apobec4、aid或cda，但本發(fā)明不限于此。
[0182]
例如，胞苷脫氨酶可為人apobec1，例如ncbi登錄號nm_005889、nm_001304566或nm_001644所代表的基因或mrna表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽?；蛘?，胞苷脫氨酶可為人apobec1，例如ncbi登錄號np_001291495、np_001635或np_005880所代表的蛋白質(zhì)或多肽。
[0183]
例如，胞苷脫氨酶可為小鼠apobec1，例如ncbi登錄號nm_001127863或nm_112436所代表的基因或mrna表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽?；蛘?，胞苷脫氨酶可為小鼠apobec1，例如ncbi登錄號np_001127863或np_112436所代表的蛋白質(zhì)或多肽。
[0184]
例如，胞苷脫氨酶可為人aid，例如ncbi登錄號nm_020661或nm_001330343所代表的基因或mrna表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽?；蛘?，胞苷脫氨酶可為人aid，例如ncbi登錄號np_001317272或np_065712所代表的基因或mrna表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽。
[0185]
以下列舉了胞苷脫氨酶的實(shí)例：
[0186]
apobec1：編碼人apobec1(例如ncbi登錄號np_001291495、np_001635、np_005880)的基因，例如ncbi登錄號nm_005889或nm_001304566所代表的apobec1基因；或編碼小鼠apobec1(例如ncbi登錄號np_001127863、np_112436)的基因，例如ncbi登錄號nm_001127863或nm_112436所代表的apobec1基因。
[0187]
apobec2：編碼人apobec2(例如ncbi登錄號np_006780)的基因，例如ncbi登錄號nm_006789所代表的apobec2基因；或編碼小鼠apobec2(例如ncbi登錄號np_033824)的基因，例如ncbi登錄號nm_009694所代表的apobec2基因。
[0188]
apobec3b：編碼人apobec3b(例如ncbi登錄號np_001257340或np_004891)的基因，例如ncbi登錄號nm_004900或nm_001270411所代表的apobec3b基因；或編碼小鼠apobec3b(例如ncbi登錄號np_001153887、np_001333970或np_084531)的基因，例如ncbi登錄號nm_001160415、nm_030255或nm_001347041所代表的apobec3b基因。
[0189]
apobe3c：編碼人apobec3c(例如ncbi登錄號np_055323)的基因，例如ncbi登錄號nm_014508所代表的apobec3c基因。
[0190]
apobec3d：編碼人apobec3d(例如ncbi登錄號np_689639或np_0013570710)的基因，例如ncbi登錄號nm_152426或nm_001363781所代表的apobec3d基因。
[0191]
apobec3f：編碼人apobec3f(例如ncbi登錄號np_001006667或np_660341)的基因，例如ncbi登錄號nm_001006666或nm_145298所代表的apobec3f基因。
[0192]
apobec3g：編碼人apobec3g(例如ncbi登錄號np_068594、np_001336365、np_001336366或np_001336367)的基因，例如ncbi登錄號nm_021822所代表的apobec3g基因。
[0193]
apobec3h：編碼人apobec3h(例如ncbi登錄號np_001159474、np_001159475、np_001159476或np_861438)的基因，例如ncbi登錄號nm_001166002，nm_001166003，nm_001166004或nm_181773所代表的apobec3h基因。
[0194]
apobec4：編碼人apobec4(例如ncbi登錄號np_982279)的基因，例如ncbi登錄號nm_203454所代表的apobec4基因；或編碼小鼠apobec4的基因，例如ncbi登錄號nm_001081197所代表的apobec4基因。
[0195]
胞苷脫氨酶可由激活誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶(aid)基因表達(dá)。例如，aid基因可選自于由以下基因組成的組，但本發(fā)明不限于此：編碼人aid基因(例如np_001317272、np_065712)的基因，例如ncbi登錄號nm_020661或nm_001330343所代表的aid基因；或編碼小鼠aid基因(例如np_03377512)的基因，例如ncbi登錄號nm_009645所代表的aid基因。
[0196]
胞苷脫氨酶可由cda基因編碼。例如，cda基因可選自于由以下基因組成的組，但本發(fā)明不限于此：編碼人cda(例如ncbi登錄號np_001776)的基因，例如ncbi登錄號nm_001785所代表的cda基因；或編碼小鼠cda(例如ncbi登錄號np_082452)的基因，例如ncbi登錄號nm_028176所代表的cda基因。
[0197]
胞苷脫氨酶可為胞苷脫氨酶變體。
[0198]
胞苷脫氨酶變體可為比野生型胞苷脫氨酶具有更高胞苷脫氨酶活性的酶。胞苷脫氨酶活性被理解為包括胞嘧啶或其類似物之一的脫氨基。
[0199]
例如，胞苷脫氨酶變體可為其中胞苷脫氨酶中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列被修飾的酶。
[0200]
其中，對氨基酸序列的修飾可為選自于置換、刪除和插入中的任一種。
[0201]
本技術(shù)的脫氨酶可為腺苷脫氨酶。
[0202]
腺苷脫氨酶是具有移除腺嘌呤、腺苷或脫氧腺苷的氨基(-nh2)基團(tuán)或用酮基(＝o)基團(tuán)置換所述氨基基團(tuán)的活性的任何酶。本說明書中的腺苷脫氨酶作為包括腺嘌呤脫氨酶在內(nèi)的概念使用。本說明書中的腺苷脫氨酶作為包括腺嘌呤脫氨酶在內(nèi)的概念使用。
[0203]
腺苷脫氨酶可將腺嘌呤變?yōu)榱u基嘌呤(次黃嘌呤)。
[0204]
腺苷脫氨酶可將腺苷變成肌苷。
[0205]
腺苷脫氨酶可將脫氧腺苷變成脫氧肌苷。
[0206]
腺苷脫氨酶可來源于：原核生物，例如大腸桿菌；或哺乳動物，例如靈長類動物(例如人和猴)，以及嚙齒動物(例如大鼠和小鼠)，但本發(fā)明不限于此。例如，腺苷脫氨酶可為trna特異性腺苷脫氨酶(tada)或選自屬于腺苷脫氨酶(ada)家族的一種或多種。
[0207]
腺苷脫氨酶可為tada、tad2p、ada、ada1、ada2、adar2、adat2或adat3，但本發(fā)明不限于此。
[0208]
例如，腺苷脫氨酶可為大腸桿菌tada，例如ncbi登錄號nc_000913.3所代表的基因或mrna表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽等。或者，腺苷脫氨酶可為大腸桿菌tada，例如ncbi登錄號np_417054.2所代表的蛋白質(zhì)或多肽等。
[0209]
例如，腺苷脫氨酶可為人ada，例如ncbi登錄號nm_000022、nm_001322050或nm_001322051所代表的基因或mrna表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽等。或者，腺苷脫氨酶可為人ada，例如ncbi登錄號np_000013、np_001308979或np_001308980所代表的蛋白質(zhì)或多肽等。
[0210]
例如，腺苷脫氨酶可為小鼠ada，例如ncbi登錄號nm_001272052或nm_007398所代表的基因或mrna表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽等。或者，腺苷脫氨酶可為小鼠ada，例如ncbi登錄號np_001258981或np_031424所代表的蛋白質(zhì)或多肽等。
[0211]
例如，腺苷脫氨酶可為人adar2，例如ncbi登錄號nm_001033049、nm_001112、nm_001160230、nm_015833或nm_015834所代表的基因或mrna表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽等?；蛘?，腺苷脫氨酶可為人adar2，例如ncbi登錄號np_001103、np_001153702、np_001333616、np_001333617或np_056648所代表的蛋白質(zhì)或多肽等。
[0212]
例如，腺苷脫氨酶可為小鼠adar2，例如由ncbi登錄號nm_001024837、nm_001024838、nm_001024839、nm_001024840或nm_130895所代表的基因或mrna表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽等。或者，腺苷脫氨酶可為小鼠adar2，例如ncbi登錄號np_001020008、np_570965或np_001020009所代表的蛋白質(zhì)或多肽等。
[0213]
例如，腺苷脫氨酶可為人adat2，例如ncbi登錄號nm_182503.3或nm_001286259.1所代表的基因或mrna表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽等?；蛘撸佘彰摪泵缚蔀槿薬dat2，例如ncbi登錄號np_001273188.1或np_872309.2所代表的蛋白質(zhì)或多肽等。
[0214]
腺苷脫氨酶可為ada變體、adar2變體和adat2變體中的任一種，但本發(fā)明不限于此。
[0215]
例如，adar2變體可為選自于由以下基因組成的組中的一種或多種，但本發(fā)明不限于此。所述基因可為編碼人adar2的基因，例如ncbi登錄號nm_001282225、nm_001282226、nm_001282227、nm_001282228、nm_001282229、nm_017424或nm_177405所代表的cda基因等。
[0216]
腺苷脫氨酶可為腺苷脫氨酶變體。
[0217]
腺苷脫氨酶變體可為比野生型腺苷脫氨酶具有更高腺苷脫氨酶活性的酶。
[0218]
例如，腺苷脫氨酶變體可為其中腺苷脫氨酶中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列被改變的酶。
[0219]
腺苷脫氨酶可為腺苷脫氨酶變體。
[0220]
腺苷脫氨酶變體可為比野生型腺苷脫氨酶具有更高腺苷脫氨酶活性的酶。其中，腺苷脫氨酶活性可包括移除腺嘌呤、腺苷、脫氧腺苷或其類似物的氨基(-nh2)基團(tuán)或用酮基(＝o)基團(tuán)置換所述氨基(-nh2)基團(tuán)，但本發(fā)明不限于此。
[0221]
腺苷脫氨酶變體可為其中選自于構(gòu)成野生型腺苷脫氨酶的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列被修飾的酶。
[0222]
其中，所述氨基酸序列的修飾可為選自于一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、刪除和插入中的任一種。
[0223]
腺苷脫氨酶變體可為tada變體、tad2p變體、ada變體、ada1變體、ada2變體、adar2變體、adat2變體或adat3變體，但本發(fā)明不限于此。
[0224]
例如，腺苷脫氨酶可為tada變體。例如，tada變體可為abe0.1、abe1.1、abe1.2、abe2.1、abe2.9、abe2.10、abe3.1、abe4.3、abe5.1、abe5.3、abe6.3、abe6.4、abe7.4、abe7.8、abe7.9或abe7.10，以及關(guān)于tada變體的具體詳情在題為“base editing of a,t to c,g in genomic dna without dna cleavage”(nicole m.gaudelli等，(2017)nature,551,464-471)的文章中詳細(xì)描述，因此可參考相應(yīng)的文件。
[0225]
腺苷脫氨酶可為融合的腺苷脫氨酶。
[0226]
本技術(shù)中提供的脫氨酶可以融合形式提供，其中例如一個(gè)或多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域與胞苷脫氨酶或腺苷脫氨酶連接。
[0227]
此處，可連接或融合脫氨酶和功能結(jié)構(gòu)域從而使每個(gè)功能得以表達(dá)。
[0228]
所述功能結(jié)構(gòu)域可為具有甲基化酶活性、去甲基化酶活性、轉(zhuǎn)錄激活活性、轉(zhuǎn)錄抑制活性、轉(zhuǎn)錄釋放因子活性、組蛋白修飾活性、rna剪切活性或核酸結(jié)合活性的結(jié)構(gòu)域，或?yàn)橛糜诜蛛x和純化蛋白質(zhì)(包括肽)的標(biāo)簽或報(bào)告基因，但本發(fā)明不限于此。
[0229]
功能結(jié)構(gòu)域可為用于分離和純化蛋白質(zhì)(包括肽)的標(biāo)簽或報(bào)告基因。
[0230]
此處，標(biāo)簽可包括以下任一種：組氨酸(his)標(biāo)簽、v5標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、流感病毒血凝素(ha)標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、vsv-g標(biāo)簽和硫氧還蛋白(trx)標(biāo)簽。此處，報(bào)告基因可包括以下自發(fā)熒光蛋白中的任一種：例如谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gst)、辣根過氧化物酶(hrp)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cat)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、螢光素酶、綠色熒光蛋白(gfp)、hcred、dsred、青色熒光蛋白(cfp)、黃色熒光蛋白(yfp)和藍(lán)色熒光蛋白(bfp)。然而，本發(fā)明不限于此。
[0231]
功能結(jié)構(gòu)域可為核定位序列或信號(nls)或者核輸出序列或信號(nes)。
[0232]
此處，可在crispr酶的氨基端或其附近、crispr酶的羧基端或其附近、或它們的組合處包含一個(gè)或多個(gè)nls。所述nls可為衍生自以下的nls序列，但本發(fā)明不限于此：具有氨基酸序列pkkkrkv(seq id no：23)的sv40病毒大t抗原的nls；來自核質(zhì)蛋白的nls(例如具有序列krpaatkkagqakkkk(seq id no：24)的核質(zhì)蛋白雙分型(nucleoplasmin bipartite)nls)；具有氨基酸序列paakrvkld(seq id no：25)或rqrrnelkrsp(seq id no：26)的c-myc nls；具有序列nqssnfgpmkggnfggrssgpyggggqyfakprnqggy(seq id no：27)的hrnpa1 m9 nls；來自importin-α的ibb結(jié)構(gòu)域的序列rmrizfknkgkdtaelrrrrvevsvelrkakkdeqilkrrnv(seq id no：28)；肌瘤t蛋白的序列vsrkrprp(seq id no：29)和ppkkared (seq id no：30)；人p53的序列popkkkpl(seq id no：31)；小鼠c-abl iv的序列salikkkkkmap(seq id no：32)；流感病毒ns1的序列drlrr(seq id no：33)和pkqkkrk(seq id no：34)；傳染性病毒δ抗原的序列rklkkkikkl(seq id no：35)；小鼠mx1蛋白的序列rekkkflkrr(seq id no：36)；人多聚(adp-核糖)聚合酶的序列krkgdevdgvdevakkkskk(seq id no：37)；以及人類固醇激素，糖皮質(zhì)激素的受體的序列rkclqagmnlearktkk(seq id no：38)中的一個(gè)或多個(gè)。
[0233]
功能結(jié)構(gòu)域可為能夠與另一結(jié)構(gòu)域、肽、多肽或蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0234]
結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為frb結(jié)構(gòu)域和fkbp二聚化結(jié)構(gòu)域之一；內(nèi)含肽；ert結(jié)構(gòu)域和vpr結(jié)構(gòu)域之一；gcn4肽和單鏈可變片段(scfv)之一；或形成異二聚體的結(jié)構(gòu)域。
[0235]
結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為scfv。其中，scfv可與gcn4肽配對，并且可與gcn4特異性地結(jié)合或連接。
[0236]
在一個(gè)實(shí)例中，其中scfv功能結(jié)構(gòu)域與腺苷脫氨酶連接的第一融合蛋白可與肽、多肽、蛋白質(zhì)或包含gcn4肽的第二融合蛋白結(jié)合。
[0237]
[用于單堿基置換的蛋白的第二組分——dna糖基化酶]
[0238]
dna糖基化酶是參與堿基切除修復(fù)(ber)的酶，且ber是移除和替換dna的受損堿基的機(jī)制。dna糖基化酶通過水解dna中堿基和脫氧核糖之間的n-糖苷鍵來催化該機(jī)制的第一步。dna糖基化酶移除受損的含氮堿基，同時(shí)留下完整的糖-磷酸骨架。
[0239]
本技術(shù)的糖基化酶可為尿嘧啶dna糖基化酶。
[0240]
尿嘧啶dna糖基化酶是通過移除dna中存在的尿嘧啶(u)來起防止dna突變作用的酶，并且可為選自于通過破壞尿嘧啶的n-糖苷鍵來起啟動堿基切除修復(fù)(ber)途徑作用的所有酶中的一種或多種。
[0241]
糖基化酶可為尿嘧啶dna糖基化酶(udg或ung)。尿嘧啶dna糖基化酶(ung)可選自于由以下基因組成的組，但本發(fā)明不限于此：編碼人ung(例如ncbi登錄號np_003353和np_550433)的基因，例如ncbi登錄號nm_080911和nm_003362所代表的ung基因；或編碼小鼠ung(例如ncbi登錄號np_001035781和np_035807)的基因，例如ncbi登錄號nm_001040691和nm_
011677所代表的ung基因；或編碼大腸桿菌ung(例如ncbi登錄號adx49788.1、act28166.1、efn36865.1、baa10923.1、aca76764.1、acx38762.1、efu59768.a、efu53885.a、efj57281.1、efu47398.1、efk71412.1、efj92376.1、efj79936.1、efo59084.1、efk47562.1、kxh01728.1、ese25979.1、esd99489.1、esd73882.1和esd69341.1)的基因。
[0242]
dna糖基化酶可為尿嘧啶dna糖基化酶變體。尿嘧啶dna糖基化酶變體可為比野生型尿嘧啶dna糖基化酶具有更高dna糖基化酶活性的酶。
[0243]
例如，尿嘧啶dna糖基化酶變體可為其中野生型尿嘧啶dna糖基化酶的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列被修飾的酶。此處，所述氨基酸序列的修飾可為至少一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、刪除、插入或它們的組合。
[0244]
糖基化酶可為融合的尿嘧啶dna糖基化酶。
[0245]
本技術(shù)的糖基化酶可為烷基腺嘌呤dna糖基化酶(aag)。
[0246]
烷基腺嘌呤dna糖基化酶是通過移除dna中存在的烷基化或脫氨基的堿基來起防止dna突變作用的酶，并且可為選自于通過催化烷基化或脫氨基的堿基的n-糖苷鍵的水解來起啟動堿基切除修復(fù)(ber)途徑作用的所有酶中的一種或多種。
[0247]
dna糖基化酶可為烷基腺嘌呤dna糖基化酶(aag)或其變體。
[0248]
例如，烷基腺嘌呤dna糖基化酶(aag)可為人aag，例如ncbi登錄號nm_002434、nm_001015052或nm_001015054所代表的基因或mrna表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽等。或者，烷基腺嘌呤dna糖基化酶(aag)可為人aag，例如ncbi登錄號np_001015052、np_001015054或np_002425所代表的蛋白質(zhì)或多肽等。
[0249]
例如，烷基腺嘌呤dna糖基化酶(aag)可為小鼠aag，例如ncbi登錄號nm_010822所代表的基因或mrna表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽等?；蛘撸榛汆堰蔰na糖基化酶(aag)可為人aag，例如ncbi登錄號np_034952所代表的蛋白質(zhì)或多肽等。
[0250]
dna糖基化酶可為烷基腺嘌呤dna糖基化酶變體。烷基腺嘌呤dna糖基化酶變體可為比野生型烷基腺嘌呤dna糖基化酶具有更高dna糖基化酶活性的酶。
[0251]
例如，烷基腺嘌呤dna糖基化酶變體可為其中野生型烷基腺嘌呤dna糖基化酶的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列被修飾的酶。其中，所述氨基酸序列的修飾可為至少一個(gè)氨基酸的置換、刪除、插入或它們的組合。
[0252]
所述糖基化酶可為融合的烷基腺嘌呤dna糖基化酶。
[0253]
本技術(shù)可提供融合的尿嘧啶dna糖基化酶或融合的烷基腺嘌呤dna糖基化酶，其中一個(gè)或多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域與尿嘧啶dna糖基化酶或烷基腺嘌呤dna糖基化酶連接。其中，尿嘧啶dna糖基化酶或烷基腺嘌呤dna糖基化酶可與每個(gè)功能結(jié)構(gòu)域連接或融合，從而使得每個(gè)功能得以表達(dá)。
[0254]
功能結(jié)構(gòu)域可為具有甲基化酶活性、去甲基化酶活性、轉(zhuǎn)錄激活活性、轉(zhuǎn)錄抑制活性、轉(zhuǎn)錄釋放因子活性、組蛋白修飾活性、rna剪切活性或核酸結(jié)合活性的結(jié)構(gòu)域，或?yàn)橛糜诜蛛x和純化蛋白質(zhì)(包括肽)的標(biāo)簽或報(bào)告基因，但本發(fā)明不限于此。
[0255]
此處，功能結(jié)構(gòu)域可為用于分離和純化蛋白質(zhì)(包括肽)的標(biāo)簽或報(bào)告基因。
[0256]
此處，標(biāo)簽可包括以下任一種：組氨酸(his)標(biāo)簽、v5標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、流感病毒血凝素(ha)標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、vsv-g標(biāo)簽和硫氧還蛋白(trx)標(biāo)簽。此處，報(bào)告基因可包括以下自發(fā)熒光蛋白中的任一種：例如谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gst)、辣根過氧化物酶(hrp)、氯霉素乙
酰轉(zhuǎn)移酶(cat)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、螢光素酶、綠色熒光蛋白(gfp)、hcred、dsred、青色熒光蛋白(cfp)、黃色熒光蛋白(yfp)和藍(lán)色熒光蛋白(bfp)。然而，本發(fā)明不限于此。
[0257]
功能結(jié)構(gòu)域可為核定位序列或信號(nls)或者核輸出序列或信號(nes)。
[0258]
此處，可在crispr酶的氨基端或其附近、crispr酶的羧基端或其附近、或它們的組合處包含一個(gè)或多個(gè)nls。nls可為衍生自以下的nls序列，但本發(fā)明不限于此：具有氨基酸序列pkkkrkv(seq id no：23)的sv40病毒大t抗原的nls；來自核質(zhì)蛋白的nls(例如具有序列krpaatkkagqakkkk(seq id no：24)的核質(zhì)蛋白雙分型nls)；具有氨基酸序列paakrvkld(seq id no：25)或rqrrnelkrsp(seq id no：26)的c-myc nls；具有序列nqssnfgpmkggnfggrssgpyggggqyfakprnqggy(seq id no：27)的hrnpa1m9nls；來自importin-α的ibb結(jié)構(gòu)域的序列rmrizfknkgkdtaelrrrrvevsvelrkakkdeqilkrrnv(seq id no：28)；肌瘤t蛋白的序列vsrkrprp(seq id no：29)和ppkkared(seq id no：30)；人p53的序列popkkkpl(seq id no：31)；小鼠c-abl iv的序列salikkkkkmap(seq id no：32)；流感病毒ns1的序列drlrr(seq id no：33)和pkqkkrk(seq id no：34)；傳染性病毒δ抗原的序列rklkkkikkl(seq id no：35)；小鼠mx1蛋白的序列rekkkflkrr(seq id no：36)；人多聚(adp-核糖)聚合酶的序列krkgdevdgvdevakkkskk(seq id no：37)；以及人類固醇激素，糖皮質(zhì)激素的受體的序列rkclqagmnlearktkk(seq id no：38)中的一個(gè)或多個(gè)。
[0259]
功能結(jié)構(gòu)域可為能夠與另一結(jié)構(gòu)域、肽、多肽或蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0260]
結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為frb結(jié)構(gòu)域和fkbp聚化結(jié)構(gòu)域之一；內(nèi)含肽；ert結(jié)構(gòu)域和vpr結(jié)構(gòu)域之一；gcn4肽和單鏈可變片段(scfv)之一；或形成異二聚體的結(jié)構(gòu)域。
[0261]
結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為scfv。其中，scfv可與gcn4肽配對，并且可與gcn4特異性地結(jié)合或連接。
[0262]
在一個(gè)實(shí)例中，其中scfv功能結(jié)構(gòu)域與尿嘧啶dna糖基化酶或烷基腺嘌呤dna糖基化酶連接的第一融合蛋白可與肽、多肽、蛋白質(zhì)或包含gcn4肽的第二融合蛋白結(jié)合。
[0263]
[用于單堿基置換的蛋白的第三組分——crispr酶]
[0264]
本技術(shù)提供的用于單堿基置換的蛋白包含crispr酶或包含所述crispr酶的crispr系統(tǒng)。本說明書中的crispr酶可稱為crispr蛋白。
[0265]
crispr系統(tǒng)是可通過靶向基因組dna上原間隔序列臨近基序(pam)序列附近的靶核酸序列來引入人工突變的系統(tǒng)。具體而言，向?qū)na和cas蛋白彼此結(jié)合(或相互作用)以形成向?qū)na-cas蛋白復(fù)合物，并且可通過靶dna序列的剪切在基因組dna上誘導(dǎo)突變，插入缺失(indel)。
[0266]
關(guān)于向?qū)na、cas蛋白和向?qū)na-cas蛋白復(fù)合物的更詳細(xì)描述，可參考韓國專利公開號10-2017-0126636。
[0267]
cas蛋白在本說明書中用作除了野生型蛋白質(zhì)外，還包括能夠與向?qū)na合作作為有活性的核酸內(nèi)切酶或切口酶的所有變體在內(nèi)的概念。有活性的核酸內(nèi)切酶或切口酶可剪切靶核酸序列，并且可用于操作或修飾核酸序列。此外，無活性的變體可用于調(diào)控轉(zhuǎn)錄或分離所靶向的dna。
[0268]
本技術(shù)中的crispr蛋白可為由多種微生物衍生而來的cas9或cpf1，例如釀膿鏈球菌(streptococcus pyogenes)、嗜熱鏈球菌(streptococcus thermophilus)、鏈球菌屬
(streptococcus sp.)、金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、空腸彎曲桿菌(campylobacter jejuni)、達(dá)松維爾擬諾卡式菌(nocardiopsis dassonvillei)、始旋鏈霉菌(streptomyces pristinaespiralis)、綠色產(chǎn)色鏈霉菌(streptomyces viridochromogenes)、綠色產(chǎn)色鏈霉菌、粉紅鏈孢囊菌(streptosporangium roseum)、粉紅鏈孢囊菌、酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(alicyclobachlus acidocaldarius)、假蕈狀芽孢桿菌(bacillus pseudomycoides)、bacillus selenitireducens、exiguobacterium sibiricum、德氏乳桿菌(lactobacillus delbrueckii)、唾液乳桿菌(lactobacillus salivarius)、microscilla marina、伯克氏菌目細(xì)菌(burkholderiales bacterium)、polaromonas naphthalenivorans、極地單胞菌屬(polaromonas sp.)、crocosphaera watsonii、藍(lán)桿藻屬(cyanothece sp.)、銅綠微囊藻(microcystis aeruginosa)、聚球藻屬(synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋鹽桿菌(acetohalobium arabaticum)、ammonifex degensii、caldicelulosiruptor bescii、candidatus desulforudis、肉毒梭狀芽胞桿菌(clostridium botulinum)、艱難梭狀芽胞桿菌(clostridium difficile)、大芬戈?duì)柕戮?finegoldia magna)、natranaerobius thermophilus、pelotomaculum thermopropionicum、喜溫嗜酸硫桿菌(acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(acidithiobacillus ferrooxidans)、allochromatium vinosum、海桿菌屬(marinobacter sp.)、nitrosococcus halophilus、nitrosococcus watsonii、pseudoalteromonas haloplanktis、ktedonobacter racemifer、methanohalobium evestigatum、多變魚腥藻(anabaena variabilis)、泡沫節(jié)球藻(nodularia spumigena)、念珠藻屬(nostoc sp.)、極大節(jié)旋藻(arthrospira maxima)、鈍頂節(jié)旋藻(arthrospira platensis)、節(jié)旋藻屬(arthrospira sp.)、鞘絲藻屬(lyngbya sp.)、microcoleus chthonoplastes、顫藻屬(oscillatoria sp.)、petrotoga mobilis、非洲棲熱腔菌(thermosipho africanus)或acaryochloris marina。
[0269]
crispr酶可為具有完全活性的crispr酶。
[0270]
在一個(gè)實(shí)施方式中，具有完全活性的crispr酶變體可為衍生自spcas9釀膿鏈球菌的cas9蛋白變體。下文列出了變體的實(shí)例：
[0271]
變體可為其中的以下一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換的酶：
[0272]
e108g，e217a，a262t，r324l，s409i，e480k，e543d，m694i，e1219v，e480k，e543d，e1219v，a262t，s409i，e480k，e543d，e1219v，a262t，s409i，e480k，e543d，m694i，e1219v，e108g，e217a，a262t，s409i，e480k，e543d，m694i，e1219v，a262t，r324l，s409i，e480k，e543d，m694i，e1219v，l111r，d1135v，g1218r，e1219f，a1322r，r1335v和t1337r。其中，crispr酶變體可識別不同的pam序列，通過縮短能夠被crispr酶識別的pam序列的長度來擴(kuò)展基因組中的靶核酸序列，以及提高核酸接近能力。
[0273]
作為具體的實(shí)例，在spcas9的情況下，當(dāng)spcas9突變(例如l111r、d1135v、g1218r、e1219f、a1322r、r1335v和t1337r)時(shí)，所述spcas9變體可通過識別僅“ng”的pam序列(初始識別的pam序列是“ngg”)(n為a、t、c和g之一)來進(jìn)行操作。
[0274]
其中，spcas9變體(l111r、d1135v、g1218r、e1219f、a1322r、r1335v和t1337r)可與“nureki cas9”(“crispr-cas9nuclease with expanded targeting space”，masu等，(2018)science 361，1259-1262)互換使用。
[0275]
crispr酶可為切口酶。
[0276]
例如，當(dāng)ii型crispr酶為野生型spcas9時(shí)，切口酶可為其中因野生型spcas9的氨基酸序列中的組氨酸840突變?yōu)楸彼岫筯nh結(jié)構(gòu)域的核酸酶活性失活的spcas9變體。此處，由于產(chǎn)生的切口酶(即spcas9變體)具有由ruvc結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的核酸酶活性，靶基因或核酸的非互補(bǔ)鏈(即不與grna互補(bǔ)結(jié)合的鏈)可被剪切。
[0277]
在另一實(shí)例中，當(dāng)ii型crispr酶為野生型cjcas9時(shí)，切口酶可為其中因野生型cjcas9的氨基酸序列中的組氨酸559突變?yōu)楸彼岫筯nh結(jié)構(gòu)域的核酸酶活性失活的cjcas9變體。此處，由于產(chǎn)生的切口酶(即cjcas9變體)具有由ruvc結(jié)構(gòu)域而來的核酸酶活性，靶基因或核酸的非互補(bǔ)鏈(即不與grna互補(bǔ)結(jié)合的鏈)可被剪切。
[0278]
此外，切口酶可具有crispr酶的hnh結(jié)構(gòu)域的核酸酶活性。即切口酶可不包含crispr酶的ruvc結(jié)構(gòu)域的核酸酶活性，并因此，可操縱或修飾ruvc結(jié)構(gòu)域。
[0279]
在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)crispr酶為ii型crispr酶時(shí)，切口酶可為包含修飾的ruvc結(jié)構(gòu)域的ii型crispr酶。
[0280]
例如，當(dāng)ii型crispr酶為野生型spcas9時(shí)，切口酶可為其中因野生型spcas9的氨基酸序列中的天冬氨酸10突變?yōu)楸彼岫箁uvc結(jié)構(gòu)域的核酸酶活性失活的spcas9變體。此處，由于產(chǎn)生的切口酶(即spcas9變體)具有由hnh結(jié)構(gòu)域而來的核酸酶活性，靶基因或核酸的互補(bǔ)鏈(即與grna互補(bǔ)結(jié)合的鏈)可被剪切。
[0281]
在又一實(shí)例中，當(dāng)ii型crispr酶為野生型cjcas9時(shí)，切口酶可為其中因野生型cjcas9的氨基酸序列中的天冬氨酸8突變?yōu)楸彼岫箁uvc結(jié)構(gòu)域的核酸酶活性失活的cjcas9變體。此處，由于產(chǎn)生的切口酶(即cjcas9變體)具有由hnh結(jié)構(gòu)域而來的核酸酶活性，靶基因或核酸的互補(bǔ)鏈(即與grna互補(bǔ)結(jié)合的鏈)可被剪切。
[0282]
在一個(gè)實(shí)施方式中，切口酶可為其中因nureki cas9的氨基酸序列中的天冬氨酸10突變?yōu)楸彼岫箁uvc結(jié)構(gòu)域的核酸酶活性失活的nureki cas9變體，所述酶為nureki cas9切口酶(nureki ncas9)。此處，由于產(chǎn)生的nureki ncas9具有由hnh結(jié)構(gòu)域而來的核酸酶活性，靶基因或核酸的互補(bǔ)鏈(即與grna互補(bǔ)結(jié)合的鏈)可被剪切。
[0283]
在另一實(shí)施方式中，切口酶可為其中因nureki cas9的氨基酸序列中的組氨酸840突變?yōu)楸彼岫筯nh結(jié)構(gòu)域的核酸酶活性失活的nureki cas9變體，所述酶為nureki cas9切口酶(nureki ncas9)。此處，由于產(chǎn)生的nureki ncas9具有由ruvc結(jié)構(gòu)域而來的核酸酶活性，靶基因或核酸的非互補(bǔ)鏈(即不與grna互補(bǔ)結(jié)合的鏈)可被剪切。
[0284]
crispr酶可為無活性crispr酶。
[0285]“無活性”是指野生型crispr酶的功能喪失的狀態(tài)，即剪切雙鏈dna的第一鏈的第一功能和剪切雙鏈dna的第二鏈的第二功能二者均喪失。處于這種狀態(tài)的crispr酶稱為無活性crispr酶。
[0286]
由于具有野生型crispr酶的核酸酶活性的結(jié)構(gòu)域的突變，無活性crispr酶可具有核酸酶失活。
[0287]
無活性crispr酶可具有由ruvc結(jié)構(gòu)域和hnh結(jié)構(gòu)域中的突變引起的核酸酶失活。即無活性crispr酶可不包含crispr酶的ruvc結(jié)構(gòu)域和hnh結(jié)構(gòu)域的核酸酶活性，并為此，可操縱或修飾ruvc結(jié)構(gòu)域和hnh結(jié)構(gòu)域。
[0288]
在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)crispr酶為ii型crispr酶時(shí)，無活性crispr酶可為包含修飾的
ruvc結(jié)構(gòu)域和hnh結(jié)構(gòu)域的ii型crispr酶。
[0289]
例如，當(dāng)ii型crispr酶為野生型spcas9時(shí)，無活性crispr酶可為其中因野生型spcas9的氨基酸序列中的天冬氨酸10和組氨酸840兩者均突變?yōu)楸彼岫箁uvc結(jié)構(gòu)域和hnh結(jié)構(gòu)域的核酸酶活性失活的spcas9變體。此處，由于產(chǎn)生的無活性crispr酶(即spcas9變體)具有ruvc結(jié)構(gòu)域和hnh結(jié)構(gòu)域的失活的核酸酶活性，它不能剪切靶基因或核酸的雙鏈兩者。
[0290]
在另一實(shí)例中，當(dāng)ii型crispr酶為野生型cjcas9時(shí)，無活性crispr酶可為其中因野生型cjcas9的氨基酸序列中的天冬氨酸8和組氨酸559兩者均突變?yōu)楸彼岫箁uvc結(jié)構(gòu)域和hnh結(jié)構(gòu)域的核酸酶活性失活的cjcas9變體。此處，由于產(chǎn)生的無活性crispr酶(即cjcas9變體)具有ruvc結(jié)構(gòu)域和hnh結(jié)構(gòu)域的失活的核酸酶活性，它不能切割靶基因或核酸的雙鏈兩者。
[0291]
此外，本技術(shù)可提供與功能結(jié)構(gòu)域連接的crispr酶。此處，除了野生型crispr酶的原始功能之外，crispr酶變體可具有附加的功能。
[0292]
功能結(jié)構(gòu)域可為具有甲基化酶活性、去甲基化酶活性、轉(zhuǎn)錄激活活性、轉(zhuǎn)錄抑制活性、轉(zhuǎn)錄釋放因子活性、組蛋白修飾活性、rna剪切活性或核酸結(jié)合活性的結(jié)構(gòu)域，或?yàn)橛糜诜蛛x和純化蛋白質(zhì)(包括肽)的標(biāo)簽或報(bào)告基因，但本發(fā)明不限于此。
[0293]
功能結(jié)構(gòu)域可為用于分離和純化蛋白質(zhì)(包括肽)的標(biāo)簽或報(bào)告基因。
[0294]
此處，標(biāo)簽可包括以下任一種：組氨酸(his)標(biāo)簽、v5標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、流感病毒血凝素(ha)標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、vsv-g標(biāo)簽和硫氧還蛋白(trx)標(biāo)簽。此處，報(bào)告基因可包括以下自發(fā)熒光蛋白中的任一種：例如谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gst)、辣根過氧化物酶(hrp)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cat)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、螢光素酶、綠色熒光蛋白(gfp)、hcred、dsred、青色熒光蛋白(cfp)、黃色熒光蛋白(yfp)和藍(lán)色熒光蛋白(bfp)。然而，本發(fā)明不限于此。
[0295]
功能結(jié)構(gòu)域可為核定位序列或信號(nls)或者核輸出序列或信號(nes)。
[0296]
此處，可在crispr酶的氨基端或其附近、crispr酶的羧基端或其附近、或它們的組合處包含一個(gè)或多個(gè)nls。nls可為來源于以下的nls序列，但本發(fā)明不限于此：具有氨基酸序列pkkkrkv(seq id no：23)的sv40病毒大t抗原的nls；來自核質(zhì)蛋白的nls(例如具有序列krpaatkkagqakkkk(seq id no：24)的核質(zhì)蛋白雙分型nls)；具有氨基酸序列paakrvkld(seq id no：25)或rqrrnelkrsp(seq id no：26)的c-myc nls；具有序列nqssnfgpmkggnfggrssgpyggggqyfakprnqggy(seq id no：27)的hrnpa1 m9 nls；來自importin-α的ibb結(jié)構(gòu)域的序列rmrizfknkgkdtaelrrrrvevsvelrkakkdeqilkrrnv(seq id no：28)；肌瘤t蛋白的序列vsrkrprp(seq id no：29)和ppkkared(seq id no：30)；人p53的序列popkkkpl(seq id no：31)；小鼠c-abl iv的序列salikkkkkmap(seq id no：32)；流感病毒ns1的序列drlrr(seq id no：33)和pkqkkrk(seq id no：34)；傳染性病毒δ抗原的序列rklkkkikkl(seq id no：35)；小鼠mx1蛋白的序列rekkkflkrr(seq id no：36)；人多聚(adp-核糖)聚合酶的序列krkgdevdgvdevakkkskk(seq id no：37)；以及人類固醇激素，糖皮質(zhì)激素的受體的序列rkclqagmnlearktkk(seq id no：38)中的一個(gè)或多個(gè)。
[0297]
功能結(jié)構(gòu)域可為能夠與另一結(jié)構(gòu)域、肽、多肽或蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0298]
結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為frb結(jié)構(gòu)域和fkbp二聚化結(jié)構(gòu)域之一；內(nèi)含肽；ert結(jié)構(gòu)域和vpr結(jié)
構(gòu)域之一；gcn4肽和單鏈可變片段(scfv)之一；或形成異二聚體的結(jié)構(gòu)域。
[0299]
結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為gcn4肽。此處，gcn4肽可與scfv配對，并且可與scfv特異性地結(jié)合或連接。
[0300]
在一個(gè)實(shí)例中，其中g(shù)cn4肽功能結(jié)構(gòu)域與crispr酶連接的第一融合蛋白可與肽、多肽、蛋白質(zhì)或包含scfv的第二融合蛋白結(jié)合。
[0301]
[用于單堿基置換的蛋白的第一方面——用于單堿基置換的融合蛋白或編碼所述融合蛋白的核酸]
[0302]
本說明書中公開的用于單堿基置換的蛋白的一個(gè)方面為用于單堿基置換的融合蛋白。
[0303]
在一個(gè)實(shí)例中，用于單堿基置換的融合蛋白或編碼所述融合蛋白的核酸可包含：
[0304]
(a)crispr酶或其變體；
[0305]
(b)脫氨酶；以及
[0306]
(c)dna糖基化酶或其變體。
[0307]
此處，用于腺嘌呤置換的融合蛋白可誘導(dǎo)任意堿基對靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中包含的胞嘧啶或腺嘌呤的置換。
[0308]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，用于單堿基置換的融合蛋白可包含連接部分，所述連接部分插入到選自于(a)、(b)和(c)中的一個(gè)與選自于(a)、(b)和(c)中的另一個(gè)之間。
[0309]
在一個(gè)示例性的實(shí)施方式中，用于單堿基置換的融合蛋白可具有以下的任一種組分：
[0310]
(i)n末端-[crispr酶]-[脫氨酶]-[dna糖基化酶]-c末端；
[0311]
(ii)n末端-[crispr酶]-[dna糖基化酶]-[脫氨酶]-c末端；
[0312]
(iii)n末端-[脫氨酶]-[crispr酶]-[dna糖基化酶]-c末端；
[0313]
(iv)n末端-[脫氨酶]-[dna糖基化酶]-[crispr酶]-c末端；
[0314]
(v)n末端-[dna糖基化酶]-[crispr酶]-[脫氨酶]-c末端；以及(vi)n末端-[dna糖基化酶]-[脫氨酶]-[crispr酶]-c末端。
[0315]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，crispr酶或其變體可包含選自于由以下組成的組中的任一個(gè)或多個(gè)：釀膿鏈球菌衍生而來的cas9蛋白、空腸彎曲桿菌衍生而來的cas9蛋白、嗜熱鏈球菌(streptococcus thermophilus)衍生而來的cas9蛋白、金黃色葡萄球菌衍生而來的cas9蛋白、腦膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)衍生而來的cas9蛋白以及cpf1蛋白。
[0316]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，crispr酶變體的特征可在于ruvc結(jié)構(gòu)域和hnh結(jié)構(gòu)域中的任一個(gè)或多個(gè)失活。
[0317]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，crispr酶變體可為切口酶。
[0318]
在一個(gè)實(shí)施方式中，可提供用于腺嘌呤置換的融合蛋白。
[0319]
用于腺嘌呤置換的融合蛋白或編碼所述融合蛋白的核酸可包含：
[0320]
(a)crispr酶或其變體；
[0321]
(b)腺苷脫氨酶；以及
[0322]
(c)烷基腺嘌呤dna糖基化酶或其變體。
[0323]
其中，用于腺嘌呤置換的融合蛋白可誘導(dǎo)任意堿基對靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中包含的腺嘌呤的置換。
[0324]
用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可按照n末端-[crispr酶]-[腺苷脫氨酶]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-c末端的順序組成。
[0325]
用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可按照n末端-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[crispr酶]-[腺苷脫氨酶]-c末端的順序組成。
[0326]
用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可按照n末端-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[腺苷脫氨酶]-[crispr酶]-c末端的順序組成。
[0327]
用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可按照n末端-[腺苷脫氨酶]-[crispr酶]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-c末端的順序組成。
[0328]
用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可按照n末端-[crispr酶]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[腺苷脫氨酶]-c末端的順序組成。
[0329]
用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可按照n末端-[腺苷脫氨酶]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[crispr酶]-c末端的順序組成。
[0330]
用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可進(jìn)一步包含連接結(jié)構(gòu)域。
[0331]
在一個(gè)實(shí)例中，所述連接結(jié)構(gòu)域可為可操作地連接crispr酶與腺苷脫氨酶、腺苷脫氨酶與烷基腺嘌呤dna糖基化酶、和/或crispr酶與烷基腺嘌呤dna糖基化酶的結(jié)構(gòu)域，并且可為連接crispr酶、腺苷脫氨酶和烷基腺嘌呤dna糖基化酶以激活每個(gè)功能的結(jié)構(gòu)域。
[0332]
在一個(gè)實(shí)例中，所述連接結(jié)構(gòu)域可為不影響crispr酶、腺苷脫氨酶和烷基腺嘌呤dna糖基化酶的功能活性和/或結(jié)構(gòu)的氨基酸、肽或多肽。
[0333]
在一個(gè)實(shí)例中，用于腺嘌呤堿基置換的結(jié)構(gòu)域可按照以下順序組成：n末端-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[腺苷脫氨酶]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-c末端；n末端-[crispr酶]-[腺苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-c末端；或n末端-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[腺苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-c末端。
[0334]
在一個(gè)實(shí)例中，用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可按照以下順序組成：n末端-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-[腺苷脫氨酶]-c末端；n末端-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[腺苷脫氨酶]-c末端；或n末端-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[腺苷脫氨酶]-c末端。
[0335]
在一個(gè)實(shí)例中，用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可按照以下順序組成：n末端-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[腺苷脫氨酶]-[crispr酶]-c末端；n末端-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[腺苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-c末端；或n末端-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[腺苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-c末端。
[0336]
在一個(gè)實(shí)例中，用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可按照以下順序組成：n末端-[腺苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-c末端；n末端-[腺苷脫氨酶]-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-c末端；或n末端-[腺苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-c末端。
[0337]
在一個(gè)實(shí)例中，用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可按照以下順序組成：n末端-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[腺苷脫氨酶]-c末端；n末端-[crispr酶]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[腺苷脫氨酶]-c末端；或n末端-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[腺苷脫氨酶]-c末端。
[0338]
在一個(gè)實(shí)例中，用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可按照以下順序組成：n末端-[腺苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[crispr酶]-c末端；n末端-[腺苷脫氨酶]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-c末端；或n末端-[腺苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[烷基腺嘌呤dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-c末端。
[0339]
在一個(gè)實(shí)施方式中，可提供用于胞嘧啶置換的融合蛋白。
[0340]
用于胞嘧啶置換的融合蛋白或編碼所述融合蛋白的核酸可包含：
[0341]
(a)crispr酶或其變體；
[0342]
(b)胞苷脫氨酶；以及
[0343]
(c)尿嘧啶dna糖基化酶或其變體。
[0344]
其中，用于單堿基置換的融合蛋白可誘導(dǎo)任意堿基對靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中包含的胞嘧啶的置換。
[0345]
用于胞嘧啶堿基置換的蛋白可按照n末端-[crispr酶]-[胞苷脫氨酶]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-c末端的順序組成。
[0346]
用于胞嘧啶堿基置換的蛋白可按照n末端-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[crispr酶]-[胞苷脫氨酶]-c末端的順序組成。
[0347]
用于胞嘧啶堿基置換的蛋白可按照n末端-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[胞苷脫氨酶]-[crispr酶]-c末端的順序組成。
[0348]
用于胞嘧啶堿基置換的蛋白可按照n末端-[胞苷脫氨酶]-[crispr酶]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-c末端的順序組成。
[0349]
用于胞嘧啶堿基置換的蛋白可按照n末端-[crispr酶]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[胞苷脫氨酶]-c末端的順序組成。
[0350]
用于胞嘧啶堿基置換的蛋白可按照n末端-[胞苷脫氨酶]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[crispr酶]-c末端的順序組成。
[0351]
用于胞嘧啶堿基置換的蛋白可進(jìn)一步包含連接結(jié)構(gòu)域。
[0352]
在一個(gè)實(shí)例中，所述連接結(jié)構(gòu)域可為可操作地連接crispr酶與胞苷脫氨酶、胞苷脫氨酶與尿嘧啶dna糖基化酶、和/或crispr酶與尿嘧啶dna糖基化酶的結(jié)構(gòu)域，并且可為連接crispr酶、胞苷脫氨酶和尿嘧啶dna糖基化酶以激活每個(gè)功能的結(jié)構(gòu)域。
[0353]
在一個(gè)實(shí)例中，所述連接結(jié)構(gòu)域可為不影響crispr酶、胞苷脫氨酶和尿嘧啶dna糖基化酶的功能活性和/或結(jié)構(gòu)的氨基酸、肽或多肽。
[0354]
在一個(gè)實(shí)例中，用于胞嘧啶堿基置換的結(jié)構(gòu)域可按照以下順序組成：n末端-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[胞苷脫氨酶]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-c末端；n末端-[crispr酶]-[胞苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-c末端；或n末端-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[胞苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-c末端。
[0355]
在一個(gè)實(shí)例中，用于胞嘧啶堿基置換的蛋白可按照以下順序組成：n末端-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-[胞苷脫氨酶]-c末端；n末端-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[胞苷脫氨酶]-c末端；或n末端-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[胞苷脫氨酶]-c末端。
[0356]
用于胞嘧啶堿基置換的蛋白可按照以下順序組成：n末端-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[胞苷脫氨酶]-[crispr酶]-c末端；n末端-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[胞苷脫
氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-c末端；或n末端-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[胞苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-c末端。
[0357]
用于胞嘧啶堿基置換的蛋白可按照以下順序組成：n末端-[胞苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-c末端；n末端-[胞苷脫氨酶]-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-c末端；或n末端-[胞苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-c末端。
[0358]
用于胞嘧啶堿基置換的蛋白可按照以下順序組成：n末端-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[胞苷脫氨酶]-c末端；n末端-[crispr酶]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[胞苷脫氨酶]-c末端；或n末端-[crispr酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[胞苷脫氨酶]-c末端。
[0359]
胞嘧啶堿基修飾蛋白可按照以下順序組成：n末端-[胞苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[crispr酶]-c末端；n末端-[胞苷脫氨酶]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-c末端；或n末端-[胞苷脫氨酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[尿嘧啶dna糖基化酶]-[連接結(jié)構(gòu)域]-[crispr酶]-c末端。
[0360]
[用于單堿基置換的蛋白的第二方面——用于單堿基置換的復(fù)合物]
[0361]
本說明書中公開的用于單堿基置換的蛋白的一個(gè)方面為用于單堿基置換的復(fù)合物(單堿基置換復(fù)合物)。
[0362]
在一個(gè)實(shí)例中，用于單堿基置換的復(fù)合物可包含：
[0363]
(a)crispr酶或其變體；
[0364]
(b)脫氨酶；
[0365]
(c)dna糖基化酶；以及
[0366]
(d)兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0367]
其中，用于單堿基置換的融合蛋白可誘導(dǎo)任意堿基對靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中包含的胞嘧啶或腺嘌呤的置換。
[0368]
在一個(gè)實(shí)例中，在用于單堿基置換的復(fù)合物中，crispr酶可與兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。
[0369]
此處，與crispr酶連接的兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的任一個(gè)可和與(b)脫氨酶連接的結(jié)合結(jié)構(gòu)域配對，并且其中的另一個(gè)可和與(c)dna糖基化酶連接的結(jié)合結(jié)構(gòu)域配對。此處，由于所述對之間的結(jié)合，組分(a)crispr酶、(b)脫氨酶和(c)dna糖基化酶形成復(fù)合物以提供用于單堿基置換的復(fù)合物。
[0370]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，與兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接的crispr酶可具有[結(jié)合結(jié)構(gòu)域(功能結(jié)構(gòu)域)]
n-crispr酶(n可為2以上的整數(shù))的構(gòu)型。
[0371]
例如，crispr酶可在圖32(a)中示出。
[0372]
此處，gcn4可為與crispr酶連接的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的實(shí)例，并且不同類型的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可與其連接。然而，本發(fā)明不限于此。
[0373]
此處，crispr酶可與1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。
[0374]
在另一實(shí)例中，crispr酶可在圖32(b)中示出。
[0375]
此處，gcn4可為與crispr酶連接的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的實(shí)例，并且不同類型的結(jié)合結(jié)構(gòu)
域可與其連接。然而，本發(fā)明不限于此。
[0376]
此處，crispr酶可在c末端和n末端處與1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。
[0377]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，本技術(shù)提供的用于單堿基置換的復(fù)合物可通過以下方式提供：
[0378]
圖33的組成成分(a)、(b)和(c)中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合。
[0379]
此處，(a)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域gcn4、(b)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域scfv和(c)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域scfv僅為示例并且本發(fā)明不限于此。apobec可由腺苷脫氨酶替換，并且ung可由烷基腺嘌呤dna糖基化酶替換。
[0380]
其中，多個(gè)(b)和/或多個(gè)(c)可結(jié)合至一個(gè)(a)。
[0381]
其中，“多個(gè)”意指2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大的整數(shù)。
[0382]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，本技術(shù)提供的用于單堿基置換的復(fù)合物可通過以下方式提供：
[0383]
圖34的組成成分(a)、(b)和(c)中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合。
[0384]
此處，(a)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域gcn4、(b)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域scfv和(c)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域scfv僅為示例并且本發(fā)明不限于此。apobec可由腺苷脫氨酶替換，并且ung可由烷基腺嘌呤dna糖基化酶替換。
[0385]
此處，多個(gè)(b)和/或多個(gè)(c)可結(jié)合至一個(gè)(a)。
[0386]
此處，“多個(gè)”意指2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大的整數(shù)。
[0387]
在一個(gè)實(shí)例中，在用于單堿基置換的復(fù)合物中，所述脫氨酶可與兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。此處，與脫氨酶連接的兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)和與(a)crispr酶連接的結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及與(c)dna糖基化酶連接的結(jié)合結(jié)構(gòu)域配對。此處，由于所述對之間的結(jié)合，組分(a)crispr酶、(b)脫氨酶和(c)dna糖基化酶形成復(fù)合物，并且可提供用于單堿基置換的復(fù)合物。
[0388]
在一個(gè)實(shí)例中，在用于單堿基置換的復(fù)合物中，所述dna糖基化酶可與兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。此處，與dna糖基化酶連接的兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)和與(a)crispr酶連接的結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及與(b)脫氨酶連接的結(jié)合結(jié)構(gòu)域配對。此處，由于所述對之間的結(jié)合，組分(a)crispr酶、(b)脫氨酶和(c)dna糖基化酶形成復(fù)合物以提供用于單堿基置換的復(fù)合物。
[0389]
在一個(gè)實(shí)例中，在用于單堿基置換的復(fù)合物中，所述crispr酶可與兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接，并且可存在于其中連接了脫氨酶和dna糖基化酶的融合蛋白中。此處，所述融合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，與所述crispr酶連接的一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和融合蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域配對。此處，由于所述對之間的結(jié)合，組分(a)crispr酶、(b)脫氨酶和(c)dna糖基化酶形成復(fù)合物以提供用于單堿基置換的復(fù)合物。
[0390]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，本技術(shù)提供的用于單堿基置換的復(fù)合物可通過圖35中(a)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和(b)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合而形成。
[0391]
此處，(a)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域gcn4和(b)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域scfv僅為示例并且本發(fā)明不限于此。apobec可由腺苷脫氨酶或不同類型的胞苷脫氨酶替換，并且ung可由烷基腺嘌呤dna糖基化酶替換。
[0392]
此處，多個(gè)(b)可結(jié)合至一個(gè)(a)。
[0393]
此處，“多個(gè)”意指2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大的整數(shù)。
[0394]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，本技術(shù)提供的用于單堿基置換的復(fù)合物可通過圖36中(a)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和(c)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合而形成。
[0395]
此處，(a)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域gcn4和(b)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域scfv僅為示例并且本發(fā)明不限于此。apobec可由腺苷脫氨酶或不同類型的胞苷脫氨酶替換，并且ung可由烷基腺嘌呤dna糖基化酶替換。
[0396]
此處，多個(gè)(b)可結(jié)合至一個(gè)(a)。
[0397]
此處，“多個(gè)”意指2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大的整數(shù)。
[0398]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，本技術(shù)提供的用于單堿基置換的復(fù)合物可通過圖37中(a)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和(b)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合而形成。
[0399]
此處，(a)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域gcn4和(b)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域scfv僅為示例并且本發(fā)明不限于此。apobec可由腺苷脫氨酶或不同類型的胞苷脫氨酶替換，并且ung可由烷基腺嘌呤dna糖基化酶替換。
[0400]
此處，多個(gè)(b)可結(jié)合至一個(gè)(a)。
[0401]
此處，“多個(gè)”意指2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大的整數(shù)。
[0402]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，本技術(shù)提供的用于單堿基置換的復(fù)合物可通過圖38中(a)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和(c)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合而形成。
[0403]
此處，(a)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域gcn4和(b)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域scfv僅為示例并且本發(fā)明不限于此。apobec可由腺苷脫氨酶或不同類型的胞苷脫氨酶替換，并且ung可由烷基腺嘌呤dna糖基化酶替換。
[0404]
此處，多個(gè)(b)可結(jié)合至一個(gè)(a)。
[0405]
此處，”多個(gè)”意指2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的整數(shù)。
[0406]
在一個(gè)實(shí)例中，用于單堿基置換的復(fù)合物可以以融合蛋白的形式存在，其中脫氨酶與兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接，并與crispr酶和dna糖基化酶連接。此處，所述融合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，與所述脫氨酶連接的一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和融合蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域配對。此處，由于所述對之間的結(jié)合，組分(a)crispr酶、(b)脫氨酶和(c)dna糖基化酶形成復(fù)合物以提供用于單堿基置換的復(fù)合物。
[0407]
在一個(gè)實(shí)例中，用于單堿基置換的復(fù)合物可以以融合蛋白的形式存在，其中dna糖基化酶與兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接，并且脫氨酶和crispr酶連接。此處，所述融合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，與所述dna糖基化酶連接的一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與融合蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域配對。在此處，由于所述對之間的結(jié)合，組分(a)crispr酶、(b)脫氨酶和(c)dna糖基化酶形成復(fù)合物以提供用于單堿基置換的復(fù)合物。
[0408]
在一個(gè)實(shí)例中，用于單堿基置換的復(fù)合物可包含(i)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包含選自于crispr酶、脫氨酶和dna糖基化酶中的兩種組分和第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及(ii)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包含未被選擇的剩余組分和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其中，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)橄嗷プ饔脤?，并且此處，所述?fù)合物通過所述對形成。其中，第二融合蛋白除第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外可進(jìn)一步包含多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0409]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，用于單堿基置換的復(fù)合物可包含(i)包含脫氨酶、dna
糖基化酶和第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一融合蛋白，以及(ii)包含crispr酶和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二融合蛋白。此處，第二融合蛋白除第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外可進(jìn)一步包含多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此處，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為單鏈可變片段(scfv)，并且第二融合蛋白可為gcn4肽。此處，scfv可通過與gcn4肽的相互作用來提供用于單堿基置換的復(fù)合物。
[0410]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，用于單堿基置換的復(fù)合物可包含(i)包含脫氨酶、crispr酶和第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一融合蛋白，以及(ii)包含dna糖基化酶和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二融合蛋白。此處，第二融合蛋白除第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外可進(jìn)一步包含多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此處，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為單鏈可變片段(scfv)，并且第二融合蛋白可為gcn4肽。此處，scfv可通過與gcn4肽的相互作用而提供用于單堿基置換的復(fù)合物。
[0411]
在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，用于單堿基置換的復(fù)合物可包含(i)包含crispr酶、dna糖基化酶和第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一融合蛋白，以及(ii)包含脫氨酶和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二融合蛋白。此處，第二融合蛋白除第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外可進(jìn)一步包含多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此處，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為單鏈可變片段(scfv)，并且第二融合蛋白可為gcn4肽。此處，scfv可通過與gcn4肽的相互作用而提供用于單堿基置換的復(fù)合物。
[0412]
在一個(gè)實(shí)例中，crispr酶、脫氨酶和dna糖基化酶中的任一個(gè)與第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接，并且此處，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c另一結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的對。此處，第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c再一結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的對，并且用于單堿基置換的復(fù)合物可通過所述對提供。
[0413]
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述crispr酶可與第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。此處，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c所述脫氨酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的對，并且第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c所述dna糖基化酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的對。此處，用于單堿基置換的復(fù)合物可通過所述對提供。
[0414]
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述脫氨酶可與第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。此處，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c所述crispr酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的對，并且第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c所述dna糖基化酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的對。此處，用于單堿基置換的復(fù)合物可通過所述對提供。
[0415]
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述dna糖基化酶可與第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。此處，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c所述脫氨酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的對，并且第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c所述crispr酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的對。此處，用于單堿基置換的復(fù)合物可通過所述對提供。
[0416]
此處，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為frb結(jié)構(gòu)域和fkbp二聚化結(jié)構(gòu)域之一；內(nèi)含肽；ert結(jié)構(gòu)域和vpr結(jié)構(gòu)域之一；gcn4肽和單鏈可變片段(scfv)之一；或形成異二聚體的結(jié)構(gòu)域。
[0417]
此處，所述對可為以下集中的任一個(gè)：
[0418]
frb結(jié)構(gòu)域和fkbp二聚化結(jié)構(gòu)域；
[0419]
第一內(nèi)含肽和第二內(nèi)含肽；
[0420]
ert結(jié)構(gòu)域和vpr結(jié)構(gòu)域；
[0421]
gcn4肽和單鏈可變片段(scfv)；以及
[0422]
形成異二聚體的第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域。
[0423]
本技術(shù)可提供胞嘧啶置換復(fù)合物。
[0424]
例如，所述脫氨酶可為胞苷脫氨酶，并且所述dna糖基化酶可為尿嘧啶dna糖基化酶或其變體。此處，用于單堿基置換的融合蛋白可為用于單堿基置換的復(fù)合物，所述復(fù)合物誘導(dǎo)任意堿基對靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中包含的胞嘧啶的置換。
[0425]
在一個(gè)實(shí)例中，所述胞苷脫氨酶為apobec、激活誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶(aid)或其變體。
[0426]
在一個(gè)實(shí)例中，crispr酶、胞苷脫氨酶和尿嘧啶dna糖基化酶中的任一個(gè)可與第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。此處，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c另一結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的對，并且此處，第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c再一結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的對。此處，用于單堿基置換的復(fù)合物可通過所述對提供。
[0427]
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述crispr酶可與第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。此處，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c所述脫氨酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的相互作用對，第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c所述dna糖基化酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的相互作用對。此處，用于單堿基置換的復(fù)合物可通過所述對提供。
[0428]
在一個(gè)實(shí)例中，用于單堿基置換的復(fù)合物可包含(i)包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和選自于crispr酶、胞苷脫氨酶和尿嘧啶dna糖基化酶中的兩種組分的第一融合蛋白，以及(ii)包含未被選擇的剩余組分和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二融合蛋白。此處，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)楸舜讼嗷プ饔玫南嗷プ饔脤Γ⑶掖颂?，所述?fù)合物可通過所述對形成。此處，第二融合蛋白除第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外可進(jìn)一步包含多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0429]
此處，所述對可為以下集中的任一個(gè)：
[0430]
frb結(jié)構(gòu)域和fkbp二聚化結(jié)構(gòu)域；
[0431]
第一內(nèi)含肽和第二內(nèi)含肽；
[0432]
ert結(jié)構(gòu)域和vpr結(jié)構(gòu)域；
[0433]
gcn4肽和單鏈可變片段(scfv)；以及
[0434]
形成異二聚體的第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域。
[0435]
本技術(shù)可提供腺嘌呤置換復(fù)合物。
[0436]
在一個(gè)實(shí)例中，所述脫氨酶可為腺苷脫氨酶，并且所述dna糖基化酶可為烷基腺嘌呤dna糖基化酶或其變體。此處，用于單堿基置換的融合蛋白可為用于單堿基置換的復(fù)合物，所述復(fù)合物誘導(dǎo)任意堿基對靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸中包含的腺嘌呤的置換。
[0437]
在一個(gè)實(shí)例中，所述腺嘌呤脫氨酶可為tada、tad2p、ada、ada1、ada2、adar2、adat2、adat3或其變體。
[0438]
在一個(gè)實(shí)例中，crispr酶、腺苷脫氨酶和烷基腺嘌呤dna糖基化酶中的任一個(gè)可與第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。此處，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c另一組分的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的相互作用對，第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c再一組分的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的相互作用對。此處，用于單堿基置換的復(fù)合物可通過所述對提供。
[0439]
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述crispr酶可與第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接。此處，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c所述脫氨酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的相互作用對，并且第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榕c所述dna糖基化酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的相互作用對。此處，用于單堿基置換的復(fù)合物可通過所述對提供。
[0440]
在一個(gè)實(shí)例中，用于單堿基置換的復(fù)合物可包含(i)包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和選自
于crispr酶、腺苷脫氨酶和烷基腺嘌呤dna糖基化酶中的兩種組分的第一融合蛋白，以及(ii)包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域和未被選擇的剩余組分的第二融合蛋白。此處，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)楸舜讼嗷プ饔玫南嗷プ饔脤Γ⑶宜鰪?fù)合物通過所述對形成。此處，第二融合蛋白除第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外可進(jìn)一步包含多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0441]
此處，所述對可為以下集中的任一個(gè)：
[0442]
frb結(jié)構(gòu)域和fkbp二聚化結(jié)構(gòu)域；
[0443]
第一內(nèi)含肽和第二內(nèi)含肽；
[0444]
ert結(jié)構(gòu)域和vpr結(jié)構(gòu)域；
[0445]
gcn4肽和單鏈可變片段(scfv)；以及
[0446]
形成異二聚體的第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域。
[0447]
本說明書中公開的本發(fā)明的一個(gè)方面為用于堿基置換的組合物及使用所述組合物的方法。
[0448]
用于單堿基置換的組合物可用于對基因中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的堿基進(jìn)行人工修飾。
[0449]
術(shù)語“人工修飾的或人工工程化的”是指經(jīng)過人工修飾的狀態(tài)，而不是自然中發(fā)生的狀態(tài)。例如，人工修飾的狀態(tài)可為人工引起野生型基因突變的修飾。在下文中，非天然、人工修飾的多態(tài)性依賴型基因(polymorphism-dependent gene)可與術(shù)語人工多態(tài)性依賴型基因互換使用。
[0450]
用于堿基修飾的組合物可進(jìn)一步包含向?qū)na或編碼所述向?qū)na的核酸。
[0451]
在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供了用于單堿基置換的組合物，所述組合物包含：
[0452]
(a)向?qū)na或編碼所述向?qū)na的核酸，以及(b)用于單堿基置換的融合蛋白或編碼所述融合蛋白的核酸，或用于單堿基置換的復(fù)合物。其中，向?qū)na可互補(bǔ)結(jié)合靶核酸序列，其中與向?qū)na結(jié)合的靶核酸序列的長度為15bp-25bp，其中用于單堿基置換的融合蛋白或用于單堿基置換的復(fù)合物誘導(dǎo)用任意堿基對包含所述靶核酸序列的靶區(qū)域中存在的一個(gè)或多個(gè)胞嘧啶或腺嘌呤的置換。
[0453]
[用于堿基置換的組合物的第一組分——向?qū)na]
[0454]
用于堿基置換的組合物可包含向?qū)na或編碼所述向?qū)na的核酸。
[0455]
向?qū)na(grna)是指能夠?qū)rna-crispr酶復(fù)合體(即crispr復(fù)合體)特異性地引導(dǎo)至靶基因或核酸的rna。此外，grna是指靶基因或核酸特異性rna，并且可與crispr酶結(jié)合以將crispr酶指引至靶基因或核酸。
[0456]
向?qū)na可與靶基因或核酸的雙鏈的任一條鏈的部分序列互補(bǔ)結(jié)合。所述部分序列可指靶核酸序列。
[0457]
向?qū)na可用于將向?qū)na-crispr酶復(fù)合體誘導(dǎo)至具有靶基因或核酸的特定核苷酸序列的位置。
[0458]
向?qū)na是指能夠?qū)rna-crispr酶復(fù)合體(即crispr復(fù)合體)特異性引導(dǎo)至靶基因、靶區(qū)域或靶核酸序列的rna。另外，grna是指靶基因或核酸特異性rna，并且可與crispr酶結(jié)合以將crispr酶指引至靶基因、靶區(qū)域或靶核酸序列。
[0459]
向?qū)na可被稱為單鏈向?qū)na(單rna分子；單grna；sgrna)；或雙鏈向?qū)na(包括多于一個(gè)，通常是兩個(gè)的獨(dú)立的rna分子)。
[0460]
向?qū)na包含與靶序列互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)(下文中稱為向?qū)稽c(diǎn))和參與和cas蛋白形成復(fù)合體的位點(diǎn)(下文中稱為復(fù)合體形成位點(diǎn))。
[0461]
在一個(gè)實(shí)例中，向?qū)na可與spcas9蛋白相互作用，并且可為選自于seq id no.48-seq id no.81中的任一個(gè)。
[0462]
在另一實(shí)例中，向?qū)na可與cjcas9蛋白相互作用，并且可包含選自于seq id no.82-seq id no.92中的任一個(gè)。
[0463]
[表1]
[0464]
[0465]
[0466][0467]
此處，復(fù)合體形成位點(diǎn)可根據(jù)cas9蛋白來源的微生物的類型來確定。例如，在向?qū)na與spcas9蛋白相互作用的情況下，復(fù)合體形成位點(diǎn)可包含5
′?
guuuuagucccugaaaagggacuaaaauaaagaguuugcgggacucugcgggguuacaauccccuaaaaccgcuuuu-3
′
(seq.idno：45)；在向?qū)na與cjcas9蛋白相互作用的情況下，復(fù)合體形成位點(diǎn)可包含5
′?
guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc-3
′
(seq id no：46)。
[0468]
作為原間隔序列臨近基序(pam)序列，當(dāng)使用spcas9蛋白時(shí)，考慮ngg(n為a、t、c或g)，當(dāng)使用cjcas9蛋白時(shí)，考慮nnnnryac(seq id no：47)(n各自獨(dú)立地為a、t、c或g，r為a或g，y為c或t)。
[0469]
所述組合物可包含一個(gè)或多個(gè)向?qū)na。
[0470]
[用于堿基置換的組合物的第二組分——用于單堿基置換的蛋白]
[0471]
用于堿基置換的組合物可包含用于單堿基置換的蛋白或編碼所述蛋白的核酸。
[0472]
用于單堿基置換的蛋白與上述所述相同。
[0473]
[用于堿基置換的組合物的第三組分——載體]
[0474]
用于堿基修飾的組合物可為載體的形式。
[0475]“載體”可將基因序列遞送至細(xì)胞。通常，“載體結(jié)構(gòu)”、“表達(dá)載體”和“基因轉(zhuǎn)移載體”可指導(dǎo)期望的基因的表達(dá)，并且指能夠?qū)⒒蛐蛄羞f送至靶細(xì)胞的任何核酸結(jié)構(gòu)。因此，術(shù)語“載體”包括載體，以及克隆和表達(dá)媒介。
[0476]
此處，所述載體可為病毒或非病毒載體(例如質(zhì)粒)。
[0477]
此處，所述載體可包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)控/控制元件。
[0478]
此處，調(diào)控/控制元件可包括啟動子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、聚腺苷酸化信號、kozak共有序列、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)、剪接受體和/或2a序列。
[0479]
所述啟動子可為被rna聚合酶ii識別的啟動子。
[0480]
所述啟動子可為被rna聚合酶iii識別的啟動子。
[0481]
所述啟動子可為誘導(dǎo)型啟動子。
[0482]
所述啟動子可為靶標(biāo)特異性啟動子。
[0483]
所述啟動子可為病毒或非病毒啟動子。
[0484]
作為啟動子，可使用根據(jù)控制區(qū)域(即編碼向?qū)na或crispr酶的核酸序列)的合適的啟動子。
[0485]
例如，對向?qū)na有用的啟動子可為h1、ef-1a、trna或u6啟動子。例如，用于crispr酶的啟動子可為cmv、ef-1a、efs、mscv、pgk或cag啟動子。
[0486]
所述載體可為病毒載體或重組病毒載體。
[0487]
所述病毒可為dna病毒或rna病毒。
[0488]
此處，dna病毒可為雙鏈dna(dsdna)病毒或單鏈dna(ssdna)病毒。
[0489]
此處，rna病毒可為單鏈rna(ssrna)病毒。
[0490]
所述病毒可為逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒(aav)、痘苗病毒、痘病毒或單純皰疹病毒，但本發(fā)明不限于此。
[0491]
通常，病毒可感染宿主(例如細(xì)胞)以將編碼病毒遺傳信息的核酸印入宿主，或?qū)⒕幋a遺傳信息的核酸插入宿主的基因組中?？墒褂镁哂猩鲜鎏卣鞯牟《緦⑾?qū)na和/或crispr酶引入靶標(biāo)中。使用此類病毒引入的向?qū)na和/或crispr酶可在受試者(例如細(xì)胞)中暫時(shí)表達(dá)?；蛘?，使用此類病毒引入的向?qū)na和/或crispr酶可在受試者(例如細(xì)胞)中持續(xù)表達(dá)很長一段時(shí)間(例如1周、2周、3周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、1年、2年或永久)。
[0492]
病毒包裝能力可從至少2kb至50kb不等，取決于病毒類型。根據(jù)此種包裝能力，可設(shè)計(jì)獨(dú)立包含向?qū)na或crispr酶的病毒載體或包含向?qū)na和crispr酶兩者的病毒載體?；蛘撸稍O(shè)計(jì)包含向?qū)na、crispr酶和附加的組分的病毒載體。
[0493]
例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對高達(dá)6kb至10kb的外來序列具有包裝能力，并且由順式作用長末端重復(fù)序列(ltr)組成。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將治療性基因插入細(xì)胞，并提供所插入基因的永久表達(dá)。
[0494]
在另一實(shí)例中，無論細(xì)胞分裂如何，腺相關(guān)病毒載體都具有非常高的各種細(xì)胞(肌肉、腦、肝、肺、視網(wǎng)膜、耳、心臟和血管細(xì)胞)引入效率且無致病性，并且由于大多數(shù)病毒基因組可被治療性基因替換并且不誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，重復(fù)給予是可能的。此外，將aav插入至靶
細(xì)胞的染色體中，從而長時(shí)間穩(wěn)定地表達(dá)治療性蛋白。例如，aav可用于在體外產(chǎn)生核酸和肽并在體內(nèi)和離體將所述核酸或肽轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞的靶核酸。然而，aav體積小且包裝能力不到4.5kb。
[0495]
其中，用于堿基修飾的組合物可包含載體以及腺嘌呤堿基置換蛋白，所述載體包含編碼向?qū)na的核酸。
[0496]
其中，用于堿基修飾的組合物可包含向?qū)na以及載體，所述載體包含編碼用于腺嘌呤堿基置換的蛋白的核酸。
[0497]
其中，用于堿基修飾的組合物可包含：包含編碼向?qū)na的核酸的載體；以及包含編碼用于腺嘌呤堿基置換的蛋白的核酸的載體。
[0498]
其中，用于堿基修飾的組合物可包含載體，所述載體包含編碼向?qū)na的核酸以及編碼腺嘌呤堿基置換蛋白的核酸。
[0499]
在另一實(shí)例中，用于堿基修飾的組合物可包含
[0500]
(a)crispr酶或編碼所述crispr酶的核酸，所述crispr酶包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及
[0501]
(b)腺苷脫氨酶或編碼所述腺苷脫氨酶的核酸，所述腺苷脫氨酶包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0502]
其中，crispr酶可為野生型crispr酶或crispr酶變體。
[0503]
其中，crispr酶變體可為切口酶。
[0504]
腺苷脫氨酶可為tada、tad2p、ada、ada1、ada2、adar2、adat2、adat3或它們的變體。
[0505]
第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域可與第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成非共價(jià)鍵。
[0506]
其中，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為：frb結(jié)構(gòu)域和fkbp二聚化結(jié)構(gòu)域之一；內(nèi)含肽；ert結(jié)構(gòu)域和vpr結(jié)構(gòu)域之一；gcn4肽和單鏈可變片段(scfv)之一；或形成異二聚體的結(jié)構(gòu)域。
[0507]
其中，第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為：frb結(jié)構(gòu)域和fkbp二聚化結(jié)構(gòu)域之一；內(nèi)含肽；ert結(jié)構(gòu)域和vpr結(jié)構(gòu)域之一；gcn4肽和單鏈可變片段(scfv)之一；或形成異二聚體的結(jié)構(gòu)域。
[0508]
用于堿基修飾的組合物可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)向?qū)na或編碼所述向?qū)na的核酸。
[0509]
其中，用于堿基修飾的組合物可為核糖核蛋白(rnp)的形式(即復(fù)合物)，其包含
[0510]
向?qū)na；-[0511]
具有第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的crispr酶；以及-[0512]
具有第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的腺苷脫氨酶。
[0513]
其中，用于堿基修飾的組合物可包含
[0514]
包含編碼向?qū)na的核酸的載體；
[0515]
包含編碼具有第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的crispr酶的核酸的載體；以及
[0516]
包含編碼具有第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的腺苷脫氨酶的核酸的載體。
[0517]
其中，用于堿基修飾的組合物可包含
[0518]
包含編碼向?qū)na的核酸的載體；以及
[0519]
包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的crispr酶和包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的腺苷脫氨酶的復(fù)合物。
[0520]
其中，用于堿基修飾的組合物可包含載體，所述載體包含編碼向?qū)na的核酸，編碼具有第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的crispr酶的核酸和編碼具有第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的腺苷脫氨酶的核
酸。
[0521]
其中，用于堿基修飾的組合物可包含：含有編碼向?qū)na的核酸和編碼具有第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的crispr酶的核酸的載體；以及含有編碼具有第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的腺苷脫氨酶的核酸的載體。
[0522]
其中，用于堿基修飾的組合物可包含：含有編碼具有第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的crispr酶的核酸的載體；以及含有編碼向?qū)na的核酸和編碼具有第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的腺苷脫氨酶的核酸的載體。
[0523]
其中，用于堿基修飾的組合物可包含：含有編碼向?qū)na的核酸的載體；具有第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的crispr酶；以及含有編碼具有第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的腺苷脫氨酶的核酸的載體。
[0524]
其中，用于堿基修飾的組合物可包含：含有編碼向?qū)na的核酸的載體；含有編碼具有第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的crispr酶的核酸的載體；以及具有第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的腺苷脫氨酶。
[0525]
其中，用于堿基修飾的組合物可包含：含有編碼向?qū)na的核酸和編碼具有第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的crispr酶的核酸的載體；以及具有第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的腺苷脫氨酶。
[0526]
其中，用于堿基修飾的組合物可包含：具有第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的crispr酶；以及含有編碼向?qū)na的核酸和編碼具有第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域的腺苷脫氨酶的核酸的載體。
[0527]
[用于堿基置換的組合物的第四組分——向?qū)na-用于單堿基置換的蛋白的復(fù)合物]
[0528]
用于堿基修飾的組合物可為核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物。其中，所述核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物可為向?qū)na-用于腺嘌呤堿基置換的蛋白的復(fù)合物。其中，所述核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物可為向?qū)na-用于胞嘧啶堿基置換的蛋白的復(fù)合物。
[0529]
其中，向?qū)na-用于腺嘌呤堿基置換的蛋白的復(fù)合物可由所述向?qū)na與用于腺嘌呤堿基置換的蛋白之間的非共價(jià)鍵形成。
[0530]
其中，向?qū)na-用于胞嘧啶堿基置換的蛋白的復(fù)合物可由所述向?qū)na與用于胞嘧啶堿基置換的蛋白之間的非共價(jià)鍵形成。
[0531]
用于堿基修飾的組合物可為非載體型。
[0532]
此處，所述非載體可為裸露dna、dna復(fù)合物或mrna。
[0533]
用于堿基修飾的組合物可為載體形式。
[0534]
以上已經(jīng)提供了對載體的描述。
[0535]
在一個(gè)實(shí)例中，用于堿基修飾的組合物可包含具有crispr酶和腺苷脫氨酶的用于腺嘌呤堿基置換的蛋白，或編碼所述蛋白的核酸。
[0536]
其中，所述crispr酶可為野生型crispr酶或crispr酶變體。
[0537]
其中，所述crispr酶變體可為切口酶。
[0538]
所述腺苷脫氨酶可為tada、tad2p、ada、ada1、ada2、adar2、adat2、adat3或其變體。
[0539]
用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可按照n末端-[crispr酶]-[腺苷脫氨酶]-c末端的順序組成。
[0540]
用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可按照n末端-[腺苷脫氨酶]-[crispr酶]-c末端的順序組成。
[0541]
其中，用于腺嘌呤堿基置換的蛋白可進(jìn)一步包含連接結(jié)構(gòu)域。
[0542]
用于堿基修飾的組合物可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)向?qū)na或編碼所述向?qū)na的
核酸。
[0543]
其中，用于堿基修飾的組合物可為向?qū)na-用于腺嘌呤堿基置換的蛋白的復(fù)合物(即核糖核蛋白(rnp))的形式。
[0544]
本說明書中公開的本發(fā)明的一個(gè)方面為用于單堿基置換的蛋白或包含所述蛋白的用于單堿基置換的組合物的用途。
[0545]
可提供本技術(shù)中提供的用于單堿基置換的蛋白的以下用途。
[0546]
用于堿基修飾的組合物可用于對靶基因中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的堿基進(jìn)行人工修飾。
[0547]
(i)用于堿基修飾的組合物可用于通過對特定基因靶區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的堿基進(jìn)行人工修飾來獲得關(guān)于突變從而不鑒別由所修飾的核酸序列表達(dá)的物質(zhì)的部分(即具有抗體抗性的表位)的信息。
[0548]
(ii)用于堿基修飾的組合物可用于通過對特定基因靶區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的堿基進(jìn)行人工修飾來獲得關(guān)于由所修飾的核苷酸表達(dá)的物質(zhì)對特定藥物的敏感性是否降低或喪失的信息。即，用于堿基修飾的組合物可用于發(fā)現(xiàn)或確認(rèn)影響特定藥物的靶基因的區(qū)域或由所述靶基因編碼的蛋白質(zhì)(靶蛋白)的區(qū)域。
[0549]
(iii)用于堿基修飾的組合物可用于通過對特定基因的靶區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的堿基進(jìn)行人工修飾來獲得關(guān)于由修飾的核苷酸表達(dá)的物質(zhì)對特定藥物的敏感性是否增加的信息。即，用于堿基修飾的組合物可用于發(fā)現(xiàn)或確認(rèn)影響對特定藥物敏感性的增加的靶基因的區(qū)域或由所述靶基因編碼的蛋白質(zhì)(靶蛋白)的區(qū)域。
[0550]
(iv)用于堿基修飾的組合物可用于通過對特定基因的靶區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的堿基進(jìn)行人工修飾來獲得關(guān)于由修飾的核酸序列表達(dá)的物質(zhì)是否具有病毒抗性的信息。即，用于堿基修飾的組合物可用于篩選病毒抗性基因或病毒抗性蛋白。
[0551]
[第一用途——表位篩選]
[0552]
在一個(gè)實(shí)施方式中，用于單堿基置換的蛋白或包含所述蛋白的用于堿基置換的組合物可用于表位篩選。
[0553]“表位”是指抗原的允許免疫系統(tǒng)(例如抗體、b細(xì)胞或t細(xì)胞)識別該抗原的特定部分，并且也稱為抗原決定簇。蛋白質(zhì)的表位根據(jù)與抗原結(jié)合位點(diǎn)(即抗體的識別表位的特定部分)的形狀或作用方式，大致分為構(gòu)象表位和線性表位。構(gòu)象表位由抗原(即蛋白質(zhì))的不連續(xù)氨基酸序列組成。構(gòu)象表位與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng)。大多數(shù)表位為構(gòu)象表位。相反，線性表位與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的一維結(jié)構(gòu)反應(yīng)，并且構(gòu)成抗原的線性表位的氨基酸依次排列。
[0554]“表位篩選”意指發(fā)現(xiàn)或檢測抗原的特定部分，所述特定部分允許免疫系統(tǒng)(例如抗體、b細(xì)胞或t細(xì)胞)識別該抗原，或意指用于發(fā)現(xiàn)或檢測抗原的特定部分的方法、組合物或試劑盒，所述特定部分發(fā)生突變使得免疫系統(tǒng)(例如抗體、b細(xì)胞或t細(xì)胞)無法識別該抗原。其中，抗原的發(fā)生突變而使免疫系統(tǒng)(例如抗體、b細(xì)胞或t細(xì)胞)無法識別該抗原的特定部分可為具有抗體抗性的表位。
[0555]
單堿基置換蛋白或包含所述蛋白的用于堿基置換的組合物可人工地產(chǎn)生單核苷酸多態(tài)性(snp)以揭示參與機(jī)體變化的snp的位置，例如特定因子的表達(dá)的產(chǎn)生、抑制、增加或減少，特定功能的產(chǎn)生或喪失，疾病的存在或不存在，或?qū)ν獠克幬锘蚧衔?例如可用
作表位的序列和與耐藥性有關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的位置)的反應(yīng)性差異。
[0556]
關(guān)于單堿基置換蛋白和用于堿基置換的組合物的描述已在上文中提供。
[0557]
對于表位篩選，單堿基置換蛋白可用于誘導(dǎo)基因組中的人工snp。
[0558]
此處，人工snp可引起點(diǎn)突變。
[0559]
點(diǎn)突變是指由一個(gè)核苷酸的修飾引起的突變。點(diǎn)突變分為錯(cuò)義突變、無義突變和沉默突變。
[0560]
錯(cuò)義突變是指突變的密碼子由于一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸而編碼另一氨基酸的情況。無義突變是指其中一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸突變的密碼子成為終止密碼子的情況。沉默突變是指一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸突變的密碼子編碼的氨基酸與未突變的密碼子編碼的氨基酸相同的情況。
[0561]
在一個(gè)實(shí)例中，通過用其它堿基c、t或g對一個(gè)堿基a的置換，密碼子可變?yōu)榫幋a不同氨基酸的密碼子。換言之，可能發(fā)生錯(cuò)義突變。例如，當(dāng)a被c置換時(shí)，亮氨酸可變成甘氨酸。
[0562]
在另一實(shí)例中，通過其它堿基c、t或g對一個(gè)堿基a的置換，密碼子可變?yōu)榫幋a相同氨基酸的另一個(gè)密碼子。換言之，可能發(fā)生沉默突變。例如，當(dāng)a被c置換時(shí)，可產(chǎn)生編碼相同脯氨酸的密碼子。
[0563]
在又一實(shí)例中，當(dāng)a被c、t或g置換從而產(chǎn)生tag、tgc或taa時(shí)，可產(chǎn)生終止密碼子(例如uaa、uag和uga)之一。換言之，可能發(fā)生無義突變。
[0564]
單堿基置換蛋白可在基因中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的堿基處誘導(dǎo)或產(chǎn)生人工置換，從而引起點(diǎn)突變。
[0565]
用于堿基置換的組合物可在基因中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的堿基處誘導(dǎo)或產(chǎn)生人工置換，從而引起點(diǎn)突變。
[0566]
上面已經(jīng)描述了單堿基的人工置換的誘導(dǎo)。
[0567]
由單堿基置換蛋白或包含所述蛋白的用于堿基置換的組合物引起的點(diǎn)突變所編碼的蛋白質(zhì)可為其中至少一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生改變的蛋白變體。
[0568]
例如，在編碼egfr的基因中由單堿基置換蛋白或包含所述蛋白的用于堿基置換的組合物產(chǎn)生點(diǎn)突變時(shí)，由所產(chǎn)生的點(diǎn)突變編碼的蛋白可為其中至少一個(gè)氨基酸與野生型egfr不同的egfr變體。
[0569]
一個(gè)或多個(gè)修飾的氨基酸可變?yōu)榫哂邢嗨铺匦缘陌被帷?br/>[0570]
疏水性氨基酸可變?yōu)椴煌氖杷园被?。疏水性氨基酸可為甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸中的一種。
[0571]
堿性氨基酸可變?yōu)槠渌鼔A性氨基酸。堿性氨基酸為精氨酸和組氨酸中的一種。
[0572]
酸性氨基酸可變?yōu)槠渌嵝园被?。酸性氨基酸為谷氨酸和天冬氨酸中的一種。
[0573]
極性氨基酸可變?yōu)槠渌鼧O性氨基酸。極性氨基酸為絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺中的一種。
[0574]
一個(gè)或多個(gè)修飾的氨基酸可變?yōu)榫哂胁煌匦缘陌被帷?br/>[0575]
在一個(gè)實(shí)例中，疏水性氨基酸可變?yōu)闃O性氨基酸。
[0576]
在另一實(shí)例中，疏水性氨基酸可變?yōu)樗嵝园被帷?br/>[0577]
在一個(gè)實(shí)例中，疏水性氨基酸可變?yōu)閴A性氨基酸。
[0578]
在另一實(shí)例中，極性氨基酸可變?yōu)槭杷园被帷?br/>[0579]
在一個(gè)實(shí)例中，酸性氨基酸可變?yōu)閴A性氨基酸。
[0580]
在另一實(shí)例中，堿性氨基酸可變?yōu)樗嵝园被帷?br/>[0581]
其中至少一個(gè)氨基酸發(fā)生改變的蛋白變體可具有修飾的三維結(jié)構(gòu)。當(dāng)氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸變?yōu)椴煌匦缘陌被釙r(shí)，由于氨基酸序列之間的結(jié)合強(qiáng)度改變，可改變?nèi)S結(jié)構(gòu)。當(dāng)三維結(jié)構(gòu)改變時(shí)，可修飾構(gòu)象表位?？墒褂帽炯夹g(shù)提供的單堿基置換蛋白或包含所述蛋白的組合物來誘導(dǎo)所述修飾。
[0582]
例如，當(dāng)編碼atm的基因的點(diǎn)突變由用于單堿基置換的蛋白或包含所述蛋白的用于堿基修飾的組合物引起時(shí)，由所產(chǎn)生的點(diǎn)突變編碼的atm變體的三維結(jié)構(gòu)可能部分改變，并因此可修飾構(gòu)象表位?？墒褂帽炯夹g(shù)提供的單堿基置換蛋白或包含所述蛋白的組合物來誘導(dǎo)所述修飾。
[0583]
具有人工snp的基因可調(diào)整合成的蛋白質(zhì)的量。
[0584]
在一個(gè)實(shí)例中，具有人工snp的基因的mrna轉(zhuǎn)錄量可增加或減少。因此，可增加或減少蛋白合成量。
[0585]
在另一實(shí)例中，當(dāng)基因中的調(diào)控區(qū)域包含一個(gè)或多個(gè)人工多態(tài)性時(shí)，可增加或減少由含有單核苷酸多態(tài)性的基因合成的蛋白質(zhì)的量。
[0586]
基因中存在的人工snp可調(diào)控蛋白質(zhì)的活性。
[0587]
在一個(gè)實(shí)例中，一個(gè)或多個(gè)人工snp可促進(jìn)和/或降低蛋白活性。
[0588]
例如，當(dāng)編碼核膜受體的基因中包含人工snp時(shí)，可激活或降低參與通過配體的識別和與配體結(jié)合進(jìn)行的信號傳導(dǎo)過程的所有因子或機(jī)制(磷酸化、乙?；?。
[0589]
例如，當(dāng)編碼特定酶的基因中包含人工snp時(shí)，可促進(jìn)或降低酶的功能(例如乙?；?，即靶基因的乙?；潭?。
[0590]
基因中存在的人工snp可改變蛋白功能。
[0591]
在一個(gè)實(shí)例中，蛋白質(zhì)的始功能可通過一個(gè)或多個(gè)人工snp得到添加和/或被抑制。
[0592]
例如，當(dāng)編碼核膜受體的基因中包含人工snp時(shí)，可抑制識別和/或結(jié)合配體的能力。
[0593]
或者，例如，當(dāng)編碼核膜受體的基因中包含人工snp時(shí)，通過與配體結(jié)合進(jìn)行的信號傳導(dǎo)至下游因子的一些功能可被抑制。
[0594]
在一個(gè)實(shí)施方式中，表位篩選方法可包括：
[0595]
a)制備能夠表達(dá)與存在于靶基因中的靶核酸序列互補(bǔ)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na的細(xì)胞，所述細(xì)胞具有靶核酸序列；
[0596]
b)將單堿基置換蛋白或編碼所述蛋白的核酸引入所述細(xì)胞；
[0597]
c)用藥物或治療劑處理b)的細(xì)胞；
[0598]
d)分離活細(xì)胞；以及
[0599]
e)對分離的細(xì)胞中靶基因的核酸序列進(jìn)行分析。
[0600]
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述表位篩選方法可包括：
[0601]
a)制備能夠表達(dá)與存在于靶基因中的靶核酸序列互補(bǔ)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na的細(xì)胞，所述細(xì)胞具有靶核酸序列；
[0602]
b)將用于單堿基置換的蛋白或編碼所述蛋白的核酸引入所述細(xì)胞；
[0603]
c)用藥物或治療劑處理b)的細(xì)胞；
[0604]
d)分離活細(xì)胞；以及
[0605]
e)從分離的細(xì)胞中獲得關(guān)于期望的snp的信息。
[0606]
此處，期望的snp可與由靶基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0607]
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述表位篩選方法可包括：
[0608]
a)將用于單堿基置換的蛋白或編碼所述蛋白的核酸、以及一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na或編碼所述向?qū)na的核酸引入具有靶核酸序列的細(xì)胞中；
[0609]
b)用藥物或治療劑處理a)的細(xì)胞；
[0610]
c)分離活細(xì)胞；以及
[0611]
d)從分離的細(xì)胞中獲得關(guān)于期望的snp的信息。
[0612]
此處，期望的snp可與由靶基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0613]
在另一實(shí)施方式中，所述表位篩選方法可包括：
[0614]
a)將用于堿基置換的組合物引入具有靶核酸序列的細(xì)胞；
[0615]
b)用藥物或治療劑處理a)的細(xì)胞；
[0616]
c)分離活細(xì)胞；以及
[0617]
d)對分離的細(xì)胞中靶基因的核酸序列進(jìn)行分析。
[0618]
在另一實(shí)施方式中，所述表位篩選方法可包括：
[0619]
a)將用于堿基置換的組合物引入具有靶核酸序列的細(xì)胞；
[0620]
b)用藥物或治療劑處理a)的細(xì)胞；
[0621]
c)分離活細(xì)胞；以及
[0622]
d)從分離的細(xì)胞中獲得關(guān)于期望的snp的信息。
[0623]
此處，期望的snp可與由靶基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0624]
向?qū)na文庫可為與靶序列的部分核酸序列互補(bǔ)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na的組。盡管將編碼相同向?qū)na文庫的核酸引入各個(gè)細(xì)胞，所述細(xì)胞可具有不同的向?qū)na。作為將編碼相同向?qū)na文庫的核酸引入各個(gè)細(xì)胞的結(jié)果，所述細(xì)胞可具有相同的向?qū)na。
[0625]
以上已描述了向?qū)na的說明。
[0626]
用于單堿基置換的蛋白可為用于腺嘌呤置換的蛋白或用于胞嘧啶置換的蛋白。
[0627]
以上已描述了用于單堿基置換的蛋白、用于腺嘌呤置換的蛋白和用于胞嘧啶置換的蛋白的說明。
[0628]
所述引入可通過選自于電穿孔、脂質(zhì)體、質(zhì)粒、病毒載體、納米顆粒和蛋白易位結(jié)構(gòu)域(ptd)融合蛋白中的一種或多種方法進(jìn)行。
[0629]
如上所述處理的抗體可為識別編碼靶基因的蛋白(下文中稱為靶蛋白)的抗體，并且可為能夠與所述靶蛋白的表位反應(yīng)的抗體。
[0630]
所述活細(xì)胞可為不與如上處理的抗體反應(yīng)的細(xì)胞。
[0631]
分離的細(xì)胞可為靶基因中具有至少一個(gè)核苷酸修飾的細(xì)胞。
[0632]
此處，一個(gè)或多個(gè)核苷酸的修飾可為靶基因中產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)人工snp。
[0633]
此處，一個(gè)或多個(gè)人工snp可誘導(dǎo)點(diǎn)突變。
[0634]
在本技術(shù)中，可確認(rèn)靶基因中存在的至少一個(gè)核苷酸(即一個(gè)或多個(gè)人工snp)的
修飾。因此，可獲得靶標(biāo)的信息。
[0635]
此處，包含至少一個(gè)核苷酸的確認(rèn)修飾(即一個(gè)或多個(gè)人工snp)的核酸序列可為編碼表位的核酸序列。
[0636]
[第二用途——耐藥基因或耐藥蛋白的篩選]
[0637]
在另一實(shí)施方式中，用于單堿基置換的蛋白或包含所述蛋白的用于堿基置換的組合物可用于耐藥基因或耐藥蛋白的篩選。
[0638]
耐藥性篩選可提供關(guān)于影響對特定藥物敏感性降低或喪失的靶基因或編碼所述靶基因的蛋白(以下稱為靶蛋白)的一個(gè)區(qū)域的信息。該區(qū)域可使用本技術(shù)提供的單堿基置換蛋白或包含所述蛋白的組合物來發(fā)現(xiàn)或鑒定。
[0639]
本技術(shù)提供了用于篩選耐藥基因或耐藥蛋白的方法。下文中，在篩選方法的一個(gè)實(shí)例中，將描述具體步驟。
[0640]
sgrna文庫的制備
[0641]
制備能夠與靶基因的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合的向?qū)na。在一個(gè)實(shí)施方式中，制備能夠與靶基因中外顯子的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合的向?qū)na。此處，可制備1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)、50個(gè)、60個(gè)、70個(gè)、80個(gè)、90個(gè)、100個(gè)、200個(gè)、500個(gè)、1000個(gè)、2000個(gè)或3000個(gè)或更多個(gè)向?qū)na。此處，多個(gè)制備的向?qū)na可與靶基因中外顯子的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合。
[0642]
在一個(gè)實(shí)例中，向?qū)na包含能夠與對應(yīng)于靶基因中外顯子的1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26個(gè)、27個(gè)、28個(gè)、29個(gè)或30個(gè)或更多個(gè)區(qū)域的核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)。
[0643]
能夠表達(dá)向?qū)na的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的制備
[0644]
制備如下細(xì)胞，所述細(xì)胞可以制備能夠與靶基因中外顯子的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合的向?qū)na。可通過編碼所制備的sgrna文庫的載體對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。此處，所述細(xì)胞可表達(dá)在所述sgrna文庫中編碼的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na。
[0645]
將單堿基置換蛋白引入轉(zhuǎn)化細(xì)胞
[0646]
將單堿基置換蛋白或編碼所述蛋白的核酸引入能夠表達(dá)sgrna文庫中編碼的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。單堿基置換蛋白可誘導(dǎo)任意堿基對靶區(qū)域中任一個(gè)或多個(gè)堿基的置換。
[0647]
單堿基置換蛋白可誘導(dǎo)靶基因中至少一個(gè)snp的產(chǎn)生。
[0648]
單堿基置換蛋白可誘導(dǎo)靶區(qū)域中至少一個(gè)snp的產(chǎn)生。
[0649]
在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)引入的單堿基置換蛋白為胞苷置換蛋白時(shí)，靶區(qū)域中至少一個(gè)胞嘧啶可被任意堿基置換。
[0650]
在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)引入的單堿基置換蛋白為腺嘌呤置換蛋白時(shí)，靶區(qū)域中至少一個(gè)腺嘌呤可被任意堿基置換。
[0651]
轉(zhuǎn)化細(xì)胞的制備
[0652]
代替制備能夠表達(dá)向?qū)na的轉(zhuǎn)化細(xì)胞并將用于單堿基置換的蛋白引入轉(zhuǎn)化細(xì)胞的步驟，本技術(shù)的方法可通過以下步驟進(jìn)行。
[0653]
制備具有靶基因的細(xì)胞。
[0654]
將單堿基置換蛋白和向?qū)na引入細(xì)胞。此處，單堿基置換蛋白和向?qū)na可分別以rnp復(fù)合物(核糖核蛋白復(fù)合物)的形式或編碼它們的核酸的形式引入。
[0655]
用藥物或治療劑處理轉(zhuǎn)化細(xì)胞
[0656]
使用用作藥物或治療劑的材料(例如抗生素、抗癌劑或抗體)處理轉(zhuǎn)化細(xì)胞。此處，處理藥物或治療劑可與由靶基因表達(dá)的肽、多肽或蛋白質(zhì)特異性結(jié)合或反應(yīng)。或者，處理藥物或治療劑可降低或喪失由靶基因表達(dá)的肽、多肽或蛋白質(zhì)的活性或功能?；蛘撸幚硭幬锘蛑委焺┛筛纳苹蛟黾佑砂谢虮磉_(dá)的肽、多肽或蛋白質(zhì)的活性或功能。
[0657]
轉(zhuǎn)化細(xì)胞可被所述藥物或治療劑殺傷。
[0658]
盡管進(jìn)行了所述藥物或治療劑的處理，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可存活。
[0659]
細(xì)胞選擇
[0660]
盡管進(jìn)行了所述藥物或治療劑的處理，可分離、選擇或獲得活細(xì)胞。
[0661]
在所述活細(xì)胞中，可使用至少一種向?qū)na和用于單堿基置換的蛋白，將靶基因的靶區(qū)域中至少一個(gè)堿基置換為任意堿基。其中使用用于單堿基置換的蛋白將靶基因中的堿基置換為任意堿基的細(xì)胞可對處理藥物或治療劑具有耐受性。
[0662]
此處，由存活細(xì)胞的靶基因所表達(dá)的肽、多肽或蛋白質(zhì)可對所述藥物或治療劑具有耐受性。
[0663]
信息的獲得
[0664]
可對所述活細(xì)胞的基因組或靶基因的核酸序列進(jìn)行分析，以獲得關(guān)于對處理藥物或治療劑具有耐受性的位點(diǎn)的信息。
[0665]
可對所述活細(xì)胞的基因組或靶基因的核酸序列進(jìn)行分析，以獲得關(guān)于由所述靶基因表達(dá)的肽、多肽或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能是否改變的信息。改變的結(jié)構(gòu)或功能可在確定是否存在耐藥性上發(fā)揮關(guān)鍵作用。
[0666]
在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選耐藥基因或耐藥蛋白的方法可包括：
[0667]
a)制備具有靶基因的細(xì)胞；
[0668]
b)向所述細(xì)胞中引入能夠與靶核酸序列互補(bǔ)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na或編碼所述向?qū)na的核酸，以及單堿基置換蛋白或編碼所述蛋白的核酸；
[0669]
c)用藥物或治療劑處理b)的細(xì)胞；
[0670]
d)分離活細(xì)胞；以及
[0671]
e)對分離的細(xì)胞中靶基因的核酸序列進(jìn)行分析。
[0672]
在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選耐藥基因或耐藥蛋白的方法可包括：
[0673]
a)制備能夠表達(dá)一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na的細(xì)胞，所述一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫可與存在于靶基因中的靶核酸序列互補(bǔ)結(jié)合；
[0674]
b)將單堿基置換蛋白或編碼所述蛋白的核酸引入所述細(xì)胞；
[0675]
c)用藥物或治療劑處理b)的細(xì)胞；
[0676]
d)分離活細(xì)胞；以及
[0677]
e)對分離的細(xì)胞中靶基因的核酸序列進(jìn)行分析。
[0678]
在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選耐藥基因或耐藥蛋白的方法可包括：
[0679]
a)制備能夠表達(dá)一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na的細(xì)胞，所述一個(gè)
或多個(gè)向?qū)na文庫可與存在于靶基因中的靶核酸序列互補(bǔ)結(jié)合；
[0680]
b)將單堿基置換蛋白或編碼所述蛋白的核酸引入所述細(xì)胞；
[0681]
c)用藥物或治療劑處理b)的細(xì)胞；
[0682]
d)分離活細(xì)胞；以及
[0683]
e)從分離的細(xì)胞中獲得關(guān)于期望的snp的信息。
[0684]
此處，期望的snp可與由所述靶基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0685]
在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選耐藥基因或耐藥蛋白的方法可包括：
[0686]
a)向細(xì)胞中引入單堿基置換蛋白或編碼所述蛋白的核酸，以及向?qū)na文庫的任一個(gè)或多個(gè)向?qū)na或編碼所述向?qū)na的核酸；
[0687]
b)用藥物或治療劑處理a)的細(xì)胞；
[0688]
c)分離活細(xì)胞；以及
[0689]
d)從分離的細(xì)胞中獲得關(guān)于期望的snp的信息。
[0690]
此處，期望的snp可與由所述靶基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0691]
在另一實(shí)施方式中，篩選耐藥基因或耐藥蛋白的方法可包括：
[0692]
a)將用于堿基置換的組合物引入具有靶核酸序列的細(xì)胞；
[0693]
b)用藥物或治療劑處理a)的細(xì)胞；
[0694]
c)分離活細(xì)胞；以及
[0695]
d)對分離的細(xì)胞中靶基因的核酸序列進(jìn)行分析。
[0696]
在另一實(shí)施方式中，篩選耐藥基因或耐藥蛋白的方法可包括：
[0697]
a)將用于堿基置換的組合物引入具有靶核酸序列的細(xì)胞；
[0698]
b)用藥物或治療劑處理a)的細(xì)胞；
[0699]
c)分離活細(xì)胞；以及
[0700]
d)從分離的細(xì)胞中獲得關(guān)于期望的snp的信息。
[0701]
此處，期望的snp可與由所述靶基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0702]
向?qū)na文庫可為能夠與靶序列的部分核酸序列互補(bǔ)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na的組。盡管將編碼相同向?qū)na文庫的核酸分別引入細(xì)胞，各個(gè)細(xì)胞可包含不同的向?qū)na。作為將編碼相同向?qū)na文庫的核酸引入各個(gè)細(xì)胞的結(jié)果，每個(gè)細(xì)胞可具有相同的向?qū)na。
[0703]
向?qū)na的描述已在上文中提供。
[0704]
單堿基置換蛋白可為用于腺嘌呤置換的蛋白或用于胞苷置換的蛋白。
[0705]
單堿基置換蛋白、腺嘌呤置換蛋白和胞苷置換蛋白的描述已在上文中提供。
[0706]
所述導(dǎo)入可通過選自于電擊法、脂質(zhì)體、質(zhì)粒、病毒載體、納米顆粒和蛋白質(zhì)易位結(jié)構(gòu)域(ptd)融合蛋白中的一種或多種方法進(jìn)行。
[0707]
如上所述的處理藥物可為遏制或抑制由靶基因編碼的蛋白(下文中稱為靶蛋白)的活性或功能的材料。此處，所述材料可為生物材料(例如rna、dna、蛋白質(zhì)、肽或抗體)或非生物材料(例如化合物)。
[0708]
如上所述的處理藥物可為促進(jìn)或增加由靶基因編碼的蛋白(下文中稱為靶蛋白)的活性或功能的材料。此處，所述材料可為生物材料(例如rna、dna、蛋白質(zhì)、肽或抗體)或非生物材料(例如化合物)。
[0709]
所述活細(xì)胞可為具有靶蛋白活性的細(xì)胞，例如不會因如上所述的處理藥物使得功能改變的耐藥性。
[0710]
分離的細(xì)胞可為靶基因中具有至少一個(gè)核苷酸的修飾的細(xì)胞。
[0711]
此處，一個(gè)或多個(gè)核苷酸的修飾可為靶基因中產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)人工snp。
[0712]
此處，一個(gè)或多個(gè)人工snp可誘導(dǎo)點(diǎn)突變。
[0713]
此處，可鑒別靶基因中存在的至少一個(gè)核苷酸的修飾，即一個(gè)或多個(gè)人工snp。因此，可獲得期望的信息。
[0714]
此處，包含經(jīng)鑒別的至少一個(gè)核苷酸的修飾(即一個(gè)或多個(gè)人工snp)的核酸序列可為編碼影響耐藥性的蛋白質(zhì)的一個(gè)區(qū)域的核酸序列。
[0715]
如上所述的處理藥物可為抗癌劑。然而，不限于抗癌劑，并且包含用于治療所有已知疾病或紊亂的材料或治療劑。
[0716]
在一個(gè)實(shí)例中，所述藥物可通過抑制表皮生長因子受體(egfr)、經(jīng)由阻斷血管內(nèi)皮生長因子(vegf)以抑制向癌細(xì)胞的血管生成、或抑制間變性淋巴瘤激酶，來使用中斷癌細(xì)胞的生長的機(jī)制。
[0717]
在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選耐藥性突變的方法可包括：通過將用于單堿基置換的組合物引入包含靶基因的細(xì)胞來誘導(dǎo)所述靶基因上的人工snp、用特定藥物處理所述細(xì)胞、選擇具有期望的snp的活細(xì)胞、以及通過分析所選擇的細(xì)胞獲得關(guān)于期望的snp的信息。其中，期望的snp可與由所述靶基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0718]
在一個(gè)實(shí)施方式中，靶基因可為egfr基因、vegf基因或間變性淋巴瘤激酶基因。然而，本發(fā)明不限于此。
[0719]
在一個(gè)實(shí)施方式中，如上所述的處理藥物可為順鉑、卡鉑、長春瑞濱、紫杉醇、多西他賽、吉西他濱、培美曲塞、易瑞沙、特羅凱、giotrif、泰瑞沙、xalkori、zykadia、alectinib、alunbrig(布加替尼)、阿瓦斯汀(貝伐珠單抗)、阿瓦斯汀(貝伐珠單抗)、keytruda(帕博利珠單抗)、opdivo(納武單抗)、tecentriq(阿特珠單抗)、imfinzi(durvalumab)或奧希替尼(osimertinib)。然而，本發(fā)明不限于此。
[0720]
在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選具有奧希替尼耐受性的egfr突變基因的方法可按如下進(jìn)行。
[0721]
在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選耐藥突變體的方法可包括：通過將用于單堿基置換的組合物引入具有egfr基因的細(xì)胞來誘導(dǎo)egfr基因上的人工snp、用藥物處理所述細(xì)胞、選擇具有期望的snp的活細(xì)胞以及通過分析所選擇的細(xì)胞來獲得關(guān)于期望的snp的信息。其中，期望的snp可與egfr的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0722]
此處，處理的藥物可為奧希替尼。然而，本發(fā)明不限于此，并可為用于抑制或喪失egfr功能的任意材料。
[0723]
在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選耐藥突變體的方法可包括：通過將包含c797s sgrna1和/或c797s sgrna2的用于單堿基置換的組合物引入具有egfr基因的細(xì)胞來誘導(dǎo)egfr基因上的人工snp，用藥物處理所述細(xì)胞，選擇具有期望的snp的活細(xì)胞，以及通過分析所選擇的細(xì)胞來獲得關(guān)于期望的snp的信息。其中，期望的snp可與egfr的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0724]
其中，處理藥物可為奧希替尼。然而，本發(fā)明不限于此，并且處理藥物可為用于抑制egfr功能或使egfr功能喪失的任意材料。
[0725]
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，鑒別具有奧希替尼耐受性的egfr區(qū)域。確認(rèn)在具有奧希替尼耐受性的egfr區(qū)域中，通過所引入的用于單堿基置換的組合物或單堿基置換蛋白來誘導(dǎo)snp。
[0726]
即，使用本技術(shù)提供的單堿基置換蛋白，通過將細(xì)胞中egfr基因中存在的胞嘧啶置換為任意堿基，可獲得關(guān)于表現(xiàn)出對奧希替尼耐受性的各種位置的信息。
[0727]
在一個(gè)實(shí)施方式中，本技術(shù)可提供獲得egfr耐受性snp信息的方法，所述方法可包括：
[0728]
a)向細(xì)胞中引入單堿基置換蛋白或編碼所述蛋白的核酸，以及向?qū)na文庫的任一個(gè)或多個(gè)向?qū)na或編碼所述向?qū)na的核酸；
[0729]
b)用藥物或治療劑處理a)的細(xì)胞；
[0730]
c)分離活細(xì)胞；以及
[0731]
d)從分離的細(xì)胞中獲得關(guān)于期望的snp的信息。
[0732]
此處，期望的snp可與由靶基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)。
[0733]
[第三用途——藥物敏化篩選]
[0734]
在一個(gè)實(shí)施方式中，單堿基置換蛋白或包含所述蛋白的用于堿基修飾的組合物可用于藥物敏化篩選。
[0735]“藥物敏化”是指對特定藥物超敏以及對特定藥物的敏感性增加的狀態(tài)。相反，“脫敏”是指對特定藥物喪失敏感性的狀態(tài)，以及對特定藥物具有耐受性的狀態(tài)。
[0736]
藥物敏化篩選是指發(fā)現(xiàn)或確認(rèn)影響對特定藥物的敏感性增加的靶基因或編碼所述靶基因的蛋白(下文中稱為靶蛋白)的一個(gè)區(qū)域的方法、組合物或試劑盒。
[0737]
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥物敏化篩選方法可包括：
[0738]
a)制備能表達(dá)一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫的任一個(gè)或多個(gè)向?qū)na的細(xì)胞，所述一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫能夠與存在于靶基因中的靶核酸互補(bǔ)結(jié)合；
[0739]
b)將單堿基置換蛋白或編碼所述蛋白的核酸引入所述細(xì)胞；
[0740]
c)用藥物或治療劑處理b)的細(xì)胞；
[0741]
d)分離活細(xì)胞；以及
[0742]
e)對分離的細(xì)胞中靶基因的核酸序列進(jìn)行分析。
[0743]
在一個(gè)實(shí)施方式中，藥物敏化篩選方法可包括：
[0744]
a)制備能表達(dá)一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫的任一個(gè)或多個(gè)向?qū)na的細(xì)胞，所述一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫能夠與存在于靶基因中的靶核酸互補(bǔ)結(jié)合，其中，所述細(xì)胞包含靶核酸序列；
[0745]
b)將單堿基置換蛋白或編碼所述蛋白的核酸引入所述細(xì)胞；
[0746]
c)用藥物或治療劑處理b)的細(xì)胞；
[0747]
d)分離活細(xì)胞；以及
[0748]
e)從分離的細(xì)胞中獲得關(guān)于期望的snp的信息。
[0749]
此處，期望的snp可與由所述靶基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0750]
在一個(gè)實(shí)施方式中，藥物敏化篩選方法可包括：
[0751]
a)將用于單堿基置換的蛋白或編碼所述蛋白的核酸、以及向?qū)na文庫的任一個(gè)或多個(gè)向?qū)na或編碼所述向?qū)na的核酸引入具有靶核酸序列的細(xì)胞；
[0752]
b)用藥物或治療劑處理a)的細(xì)胞；
[0753]
c)分離活細(xì)胞；以及
[0754]
d)從分離的細(xì)胞中獲得關(guān)于期望的snp的信息。
[0755]
此處，期望的snp可與由所述靶基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0756]
在另一實(shí)施方式中，藥物敏化篩選方法可包括：
[0757]
a)將用于堿基置換的組合物引入具有靶核酸序列的細(xì)胞；
[0758]
b)用藥物或治療劑處理a)的細(xì)胞；
[0759]
c)分離活細(xì)胞；以及
[0760]
d)對分離的細(xì)胞中靶基因的核酸序列進(jìn)行分析。
[0761]
在另一實(shí)施方式中，藥物敏化篩選方法可包括：
[0762]
a)將用于堿基置換的組合物引入具有靶核酸序列的細(xì)胞；
[0763]
b)用藥物或治療劑處理a)的細(xì)胞；
[0764]
c)分離活細(xì)胞；以及
[0765]
d)從分離的細(xì)胞中獲得關(guān)于期望的snp的信息。
[0766]
此處，期望的snp可與由所述靶基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0767]
向?qū)na文庫可為能夠與靶序列的部分核酸互補(bǔ)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na的組。盡管將編碼相同向?qū)na文庫的核酸引入各個(gè)細(xì)胞，所述細(xì)胞可包含不同的向?qū)na。作為將編碼相同向?qū)na文庫的核酸引入各個(gè)細(xì)胞的結(jié)果，各個(gè)細(xì)胞可具有相同的向?qū)na。
[0768]
向?qū)na的說明已在上文中描述。
[0769]
單堿基置換蛋白可為腺嘌呤置換蛋白或胞嘧啶置換蛋白。
[0770]
單堿基置換蛋白、腺嘌呤置換蛋白和胞嘧啶置換蛋白的說明已在上文中描述。
[0771]
所述引入可通過選自于電穿孔、脂質(zhì)體、質(zhì)粒、病毒載體、納米顆粒和蛋白易位結(jié)構(gòu)域(ptd)融合蛋白中的一種或多種方法進(jìn)行。
[0772]
如上所述的處理藥物可為遏制或抑制靶基因編碼的蛋白(下文中稱為靶蛋白)的活性或功能的材料。此處，所述材料可為生物材料(例如rna、dna、蛋白質(zhì)、肽或抗體)或非生物材料(例如化合物)。
[0773]
如上所述的處理藥物可為促進(jìn)或增加靶基因的活性或功能的材料。此處，所述材料可為生物材料(例如rna、dna、蛋白質(zhì)、肽或抗體)或非生物材料(例如化合物)。
[0774]
分離的細(xì)胞可為由于c)中的處理藥物而具有顯著改變的靶蛋白的活性或功能(即增加的藥物敏感性)的細(xì)胞。
[0775]
此處，具有藥物敏感性增加的細(xì)胞可為藥物處理后的活細(xì)胞。
[0776]
分離的細(xì)胞可為靶基因中具有至少一個(gè)核苷酸的修飾的細(xì)胞。
[0777]
其中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸的修飾可為靶基因中產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)人工snp。
[0778]
其中，一個(gè)或多個(gè)人工snp可誘導(dǎo)點(diǎn)突變。
[0779]
可確認(rèn)靶基因中存在的至少一個(gè)核苷酸的修飾(即一個(gè)或多個(gè)人工snp)。因此，可獲得期望的信息。
[0780]
此處，包含經(jīng)確認(rèn)的至少一個(gè)核苷酸的修飾(即一個(gè)或多個(gè)人工snp)的核酸序列可為編碼影響藥物敏感性增加的蛋白質(zhì)的一個(gè)區(qū)域的核酸序列。
[0781]
[第四用途——病毒抗性基因或蛋白質(zhì)的篩選]
[0782]
在另一實(shí)施方式中，單堿基置換蛋白或包含所述蛋白的用于堿基修飾的組合物可用于篩選病毒抗性基因或蛋白質(zhì)。
[0783]
在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選病毒抗性基因或蛋白質(zhì)的方法可包括：
[0784]
a)制備能表達(dá)一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫的任一個(gè)或多個(gè)向?qū)na的細(xì)胞，所述一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫能夠與存在于靶基因中的靶核酸互補(bǔ)結(jié)合；
[0785]
b)將用于單堿基置換的蛋白或編碼所述蛋白的核酸引入所述細(xì)胞；
[0786]
c)用藥物或治療劑處理b)的細(xì)胞；
[0787]
d)分離活細(xì)胞；以及
[0788]
e)對分離的細(xì)胞中靶基因的核酸序列進(jìn)行分析。
[0789]
在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選病毒抗性基因或蛋白質(zhì)的方法可包括：
[0790]
a)制備能表達(dá)一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫的任一個(gè)或多個(gè)向?qū)na的細(xì)胞，所述一個(gè)或多個(gè)向?qū)na文庫能夠與存在于靶基因中的靶核酸互補(bǔ)結(jié)合，其中，所述細(xì)胞包含所述靶核酸序列；
[0791]
b)將用于單堿基置換的蛋白或編碼所述蛋白的核酸引入所述細(xì)胞；
[0792]
c)用藥物或治療劑處理b)的細(xì)胞；
[0793]
d)分離活細(xì)胞；以及
[0794]
e)從分離的細(xì)胞中獲得關(guān)于期望的snp的信息。
[0795]
此處，期望的snp可與由所述靶基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0796]
在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選病毒抗性基因或蛋白質(zhì)的方法可包括：
[0797]
a)將用于單堿基置換的蛋白或編碼所述蛋白的核酸、以及向?qū)na文庫的任一個(gè)或多個(gè)向?qū)na或編碼所述向?qū)na的核酸引入具有靶核酸序列的細(xì)胞；
[0798]
b)用藥物或治療劑處理a)的細(xì)胞；
[0799]
c)分離活細(xì)胞；以及
[0800]
d)從分離的細(xì)胞中獲得關(guān)于期望的snp的信息。
[0801]
此處，期望的snp可與由所述靶基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0802]
在另一實(shí)施方式中，篩選病毒抗性基因或蛋白質(zhì)的方法可包括：
[0803]
a)將用于堿基置換的組合物引入具有靶核酸序列的細(xì)胞；
[0804]
b)用藥物或治療劑處理a)的細(xì)胞；
[0805]
c)分離活細(xì)胞；以及
[0806]
d)對分離的細(xì)胞中靶基因的核酸序列進(jìn)行分析。
[0807]
在另一實(shí)施方式中，篩選病毒抗性基因或蛋白質(zhì)的方法可包括：
[0808]
a)將用于堿基置換的組合物引入具有靶核酸序列的細(xì)胞；
[0809]
b)用藥物或治療劑處理a)的細(xì)胞；
[0810]
c)分離活細(xì)胞；以及
[0811]
d)從分離的細(xì)胞中獲得關(guān)于期望的snp的信息。
[0812]
此處，期望的snp可與由所述靶基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能相關(guān)。
[0813]
向?qū)na文庫可為與靶序列的部分核酸序列互補(bǔ)結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)向?qū)na的組。盡管將編碼相同向?qū)na文庫的核酸導(dǎo)入各個(gè)細(xì)胞，所述細(xì)胞可具有不同的向?qū)na。作為將編碼相同向?qū)na文庫的核酸引入各個(gè)細(xì)胞的結(jié)果，所述細(xì)胞可具有相同的向?qū)na。
[0814]
向?qū)na的說明已在上文中描述。
[0815]
用于單堿基置換的蛋白可為用于腺嘌呤置換的蛋白或用于胞嘧啶置換的蛋白。
[0816]
用于單堿基置換的蛋白、用于腺嘌呤置換的蛋白和用于胞嘧啶置換的蛋白的說明已在上文中描述。
[0817]
所述引入可通過選自于電穿孔、脂質(zhì)體、質(zhì)粒、病毒載體、納米顆粒和蛋白易位結(jié)構(gòu)域(ptd)融合蛋白中的一種或多種方法進(jìn)行。
[0818]
如上所述的處理的病毒可通過與編碼靶基因的蛋白(下文中稱為靶蛋白)的相互作用而引入至所述細(xì)胞。
[0819]
所述活細(xì)胞可為不與c)中處理的病毒相互作用的細(xì)胞，即具有病毒抗性。
[0820]
分離的細(xì)胞可為靶基因中具有至少一個(gè)核苷酸的修飾的細(xì)胞。
[0821]
分離的細(xì)胞可為靶基因中具有至少一個(gè)核苷酸的修飾的細(xì)胞。
[0822]
其中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸的修飾可為靶基因中產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)人工snp。
[0823]
其中，一個(gè)或多個(gè)人工snp可誘導(dǎo)點(diǎn)突變。
[0824]
可確認(rèn)靶基因中存在的至少一個(gè)核苷酸的修飾，即一個(gè)或多個(gè)人工snp。因此，可獲得期望的信息。
[0825]
其中，包含經(jīng)確認(rèn)的至少一個(gè)核苷酸的修飾(即一個(gè)或多個(gè)人工snp)的核酸序列可為編碼對與病毒相互作用至關(guān)重要的蛋白質(zhì)的一個(gè)區(qū)域的核酸序列。
[0826]
本說明書中公開的本發(fā)明的一個(gè)方面為用于單堿基置換的方法。
[0827]
用于堿基置換的組合物可在基因中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的堿基中誘導(dǎo)或產(chǎn)生人工修飾。
[0828]
人工修飾或置換可由向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物誘導(dǎo)或產(chǎn)生。
[0829]
此處，向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物可應(yīng)用于以下的一個(gè)或多個(gè)步驟：i)靶向靶核酸序列，ii)剪切靶核酸序列，iii)靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的脫氨基，iv)經(jīng)脫氨基的堿基的移除，以及v)經(jīng)堿基移除的靶核酸序列的修復(fù)或恢復(fù)。此處，所述步驟可依次或同時(shí)進(jìn)行，并且可改變所述步驟的順序。
[0830]
i)靶核酸序列的靶向
[0831]“靶核酸序列”為存在于靶基因或核酸中的核苷酸序列，且具體而言，為靶基因或核酸中靶區(qū)域的部分核苷酸序列。此處，“靶區(qū)域”為靶基因或核酸中可被向?qū)na-用于堿基置換的蛋白的復(fù)合物修飾的位點(diǎn)。
[0832]
下文中，“靶序列”可用作表示兩種類型的核苷酸序列信息的術(shù)語。例如，在靶基因的情況下，靶核酸序列可指靶基因中dna轉(zhuǎn)錄鏈的序列信息，或非轉(zhuǎn)錄鏈的核苷酸序列信息。
[0833]
例如，靶核酸序列可指5
′?
atcattggcagactagttcg-3
′
(seq id no：17)，其為靶基因a的靶區(qū)域的部分核苷酸序列(轉(zhuǎn)錄鏈)；以及5
′?
cgaactagtctgccaatgat-3
′
(seq id no：18)，其為與前述鏈互補(bǔ)的核苷酸序列(非轉(zhuǎn)錄鏈)。
[0834]
靶核酸序列可為5至50個(gè)核苷酸的序列。
[0835]
在一個(gè)實(shí)施方式中，靶核酸序列可為16nt序列、17nt序列、18nt序列、19nt序列、20nt序列、21nt序列、22nt序列、23nt序列、24nt序列或25nt序列。
[0836]
靶核酸序列包含向?qū)na結(jié)合序列或向?qū)na非結(jié)合序列。
[0837]“向?qū)na結(jié)合序列(向?qū)Ш怂峤Y(jié)合序列)”為與所述向?qū)na的向?qū)ЫY(jié)構(gòu)域中包含的向?qū)蛄芯哂胁糠只蛲耆パa(bǔ)性的核苷酸序列，并且能夠與所述向?qū)na的向?qū)ЫY(jié)構(gòu)域中包含的向?qū)蛄谢パa(bǔ)結(jié)合。靶核酸序列和向?qū)na結(jié)合序列為能夠根據(jù)靶基因或核酸(即經(jīng)受基因操作或修飾的靶標(biāo))而改變的核苷酸序列，并且可根據(jù)靶基因或核酸以各種方式來設(shè)計(jì)。
[0838]“向?qū)na非結(jié)合序列(向?qū)Ш怂岱墙Y(jié)合序列)”與所述向?qū)na的向?qū)ЫY(jié)構(gòu)域中包含的向?qū)蛄胁糠只蛲耆パa(bǔ)，并且可不與所述向?qū)na的向?qū)ЫY(jié)構(gòu)域中包含的向?qū)蛄谢パa(bǔ)結(jié)合。此外，向?qū)na非結(jié)合序列為與向?qū)na結(jié)合序列具有互補(bǔ)性的核苷酸序列，并且可與所述向?qū)na結(jié)合序列具有互補(bǔ)性結(jié)合。
[0839]
向?qū)na結(jié)合序列可為靶核酸序列的部分核苷酸序列，并且可為具有靶核酸序列的兩個(gè)不同序列的兩個(gè)核苷酸序列之一，即能夠彼此互補(bǔ)結(jié)合的兩個(gè)核苷酸序列。其中，向?qū)na非結(jié)合序列可為靶核酸序列中除向?qū)na結(jié)合序列之外的核苷酸序列。
[0840]
例如，當(dāng)靶基因a的靶區(qū)域的部分核苷酸序列5
′?
atcattggcagactagttcg-3
′
(seq id no：17)和與其互補(bǔ)的核苷酸序列5
′?
cgaactagtctgccaatgat-3
′
(seq id no：18)用作靶核酸序列時(shí)，向?qū)na結(jié)合序列可為所述兩個(gè)靶核酸序列之一，例如，5
′?
atcattggcagactagttcg-3
′
(seq id no：17)或5
′?
cgaactagtctgccaatgat-3
′
(seq id no：18)。此處，當(dāng)向?qū)na結(jié)合序列為5
′?
atcattggcagactagttcg-3
′
(seq id no：17)時(shí)，向?qū)na非結(jié)合序列可為5
′?
cgaactagtctgccaatgat-3
′
(seq id no：18)，或當(dāng)向?qū)na結(jié)合序列為5
′?
cgaactagtctgccaatgat-3
′
(seq id no：18)時(shí)，向?qū)na非結(jié)合序列可為5
′?
atcattggcagactagttcg-3
′
(seq id no：17)。
[0841]
向?qū)na結(jié)合序列可為選自于靶核酸序列的一個(gè)核苷酸序列，即與轉(zhuǎn)錄鏈相同的核苷酸序列和與非轉(zhuǎn)錄鏈相同的核苷酸序列。此處，向?qū)na非結(jié)合序列可為不包含選自于靶核酸序列的向?qū)na結(jié)合序列的一個(gè)核苷酸序列的核苷酸序列，即與轉(zhuǎn)錄鏈相同的核苷酸序列和與非轉(zhuǎn)錄鏈相同的核苷酸序列。
[0842]
向?qū)na結(jié)合序列可具有與靶核酸序列相同的長度。
[0843]
向?qū)na非結(jié)合序列可具有與靶核酸序列或向?qū)na結(jié)合序列相同的長度。
[0844]
向?qū)na結(jié)合序列可為5至50個(gè)核苷酸的序列。
[0845]
在一個(gè)實(shí)施方式中，向?qū)na結(jié)合序列可為16個(gè)核苷酸的序列、17nt序列、18nt序列、19nt序列、20nt序列、21nt序列、22nt序列、23nt序列、24nt序列或25nt序列。
[0846]
向?qū)na非結(jié)合序列可為5至50個(gè)核苷酸的序列。
[0847]
在一個(gè)實(shí)施方式中，向?qū)na非結(jié)合序列可為16個(gè)核苷酸的序列、17nt序列、18nt序列、19nt序列、20nt序列、21nt序列、22nt序列、23nt序列、24nt序列或25nt序列。
[0848]
向?qū)na結(jié)合序列可與所述向?qū)na的向?qū)ЫY(jié)構(gòu)域中包含的向?qū)蛄芯哂胁糠只蛲耆パa(bǔ)性結(jié)合，并且向?qū)na結(jié)合序列的長度可與向?qū)蛄械拈L度相同。
[0849]
向?qū)na結(jié)合序列可為與所述向?qū)na的向?qū)ЫY(jié)構(gòu)域中包含的向?qū)蛄谢パa(bǔ)的核苷酸序列，例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％互補(bǔ)性或完全互補(bǔ)性的核苷酸序列。
[0850]
在一個(gè)實(shí)例中，向?qū)na結(jié)合序列可具有或包含與所述向?qū)na的向?qū)ЫY(jié)構(gòu)域中包含的向?qū)蛄胁换パa(bǔ)的1-8個(gè)核苷酸的序列其。
[0851]
向?qū)na非結(jié)合序列可與所述向?qū)na的向?qū)ЫY(jié)構(gòu)域中包含的向?qū)蛄芯哂胁糠只蛲耆男蛄型葱?，并且向?qū)na非結(jié)合序列的長度可與向?qū)蛄械拈L度相同。
[0852]
向?qū)na非結(jié)合序列可為與所述向?qū)na的向?qū)ЫY(jié)構(gòu)域中包含的向?qū)蛄芯哂型葱缘暮塑账嵝蛄校缇哂兄辽?0％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同源性或完全同一性的核苷酸序列。
[0853]
在一個(gè)實(shí)例中，向?qū)na非結(jié)合序列可具有或包含與向?qū)na的向?qū)ЫY(jié)構(gòu)域中包含的向?qū)蛄胁煌吹?-8個(gè)核苷酸的序列。
[0854]
向?qū)na非結(jié)合序列可與向?qū)na結(jié)合序列互補(bǔ)結(jié)合，并具有與向?qū)na結(jié)合序列相同的長度。
[0855]
向?qū)na非結(jié)合序列可為與向?qū)na結(jié)合序列互補(bǔ)的核苷酸序列，例如具有至少90％或95％互補(bǔ)性或完全互補(bǔ)性的核苷酸序列。
[0856]
在一個(gè)實(shí)例中，向?qū)na非結(jié)合序列可具有或包含與向?qū)na結(jié)合序列不互補(bǔ)的1-2個(gè)核苷酸的序列其。
[0857]
此外，向?qū)na結(jié)合序列可為位于能夠被crispr酶識別的核苷酸序列附近的核苷酸序列。
[0858]
在一個(gè)實(shí)例中，向?qū)na結(jié)合序列可為位于臨近能夠被crispr酶識別的核苷酸序列的5'末端和/或3'末端的5-50個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。
[0859]
此外，向?qū)na非結(jié)合序列可為位于能夠被crispr酶識別的核苷酸序列附近的核苷酸序列。
[0860]
在一個(gè)實(shí)例中，向?qū)na非結(jié)合序列可為位于臨近能夠被crispr酶識別的核苷酸序列的5'末端和/或3'末端的5-50個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。
[0861]“靶向”是指存在于靶基因或核酸中的靶核酸序列中與向?qū)na結(jié)合序列的互補(bǔ)性結(jié)合。此處，互補(bǔ)結(jié)合可為100％完全互補(bǔ)性結(jié)合，或70％以上且低于100％的不完全互補(bǔ)性結(jié)合。因此，“靶向grna”是指grna與存在于靶基因或核酸中的靶核酸序列中的向?qū)na結(jié)合序列互補(bǔ)結(jié)合。
[0862]
向?qū)na-用于單堿基置換的蛋白的復(fù)合物可靶向靶核酸序列。
[0863]
ii)剪切靶核酸序列
[0864]
向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物可剪切靶核酸序列。
[0865]
此處，當(dāng)靶核酸序列為雙鏈核酸時(shí)，所述剪切可為剪切雙鏈兩者?；蛘?，所述剪切可為剪切雙鏈之一。
[0866]
此處，當(dāng)靶核酸序列為單鏈核酸時(shí)，所述剪切可為單鏈的剪切。
[0867]
或者，靶核酸序列剪切的剪切形式可根據(jù)構(gòu)成向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物的crispr酶的類型而改變。
[0868]
例如，當(dāng)構(gòu)成向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物的crispr酶為野生型crispr酶(例如spcas9)時(shí)，靶核酸序列的剪切可為靶核酸序列的雙鏈兩者的剪切。
[0869]
在另一實(shí)例中，當(dāng)構(gòu)成向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物的crispr酶為切口酶(例如nureki ncas9)時(shí)，靶核酸序列的剪切可為靶核酸序列的雙鏈之一的剪切。
[0870]
iii)靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的脫氨基
[0871]
向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物可使靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的堿基
的氨基(-nh2)基團(tuán)脫氨基。
[0872]
此處，脫氨基可發(fā)生在胞嘧啶或腺嘌呤堿基處。
[0873]
例如，當(dāng)靶核酸序列中有5個(gè)具有腺嘌呤的核苷酸時(shí)(此處，5個(gè)核苷酸可連續(xù)或者也可不連續(xù))，向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物可使5個(gè)具有腺嘌呤的核苷酸中所有腺嘌呤的氨基(-nh2)基團(tuán)脫氨基。
[0874]
在另一實(shí)例中，當(dāng)靶核酸序列中有8個(gè)具有胞嘧啶的核苷酸時(shí)(此處，5個(gè)核苷酸可為連續(xù)或者也可不連續(xù))，向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物可使8個(gè)具有胞嘧啶的核苷酸的3個(gè)中的胞嘧啶的氨基(-nh2)基團(tuán)脫氨基。
[0875]
脫氨基的堿基可根據(jù)構(gòu)成向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物的脫氨酶的類型而變化。
[0876]
例如，當(dāng)構(gòu)成向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物的脫氨酶為腺苷脫氨酶(例如tada或tada變體)時(shí)，脫氨基可發(fā)生在腺嘌呤處。此處，當(dāng)將腺嘌呤的氨基(-nh2)基團(tuán)脫氨基時(shí)，可形成酮(＝o)基團(tuán)。次黃嘌呤可通過腺嘌呤的脫氨基產(chǎn)生。
[0877]
在另一實(shí)例中，當(dāng)構(gòu)成向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物的脫氨酶為胞苷脫氨酶(例如apobec1或apobec1變體)時(shí)，脫氨基可發(fā)生在胞嘧啶處。此處，當(dāng)將胞嘧啶的氨基(-nh2)基團(tuán)脫氨基時(shí)，可形成酮(＝o)基團(tuán)。尿嘧啶可通過胞嘧啶的脫氨基產(chǎn)生。
[0878]
iv)經(jīng)脫氨基的堿基的移除
[0879]
向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物可移除步驟iii)中產(chǎn)生的經(jīng)脫氨基的堿基。此處，經(jīng)脫氨基的堿基的移除可移除步驟iii)中產(chǎn)生的經(jīng)脫氨基的堿基的全部或一部分。
[0880]
此處，經(jīng)脫氨基的堿基可為經(jīng)脫氨基的胞嘧啶或腺嘌呤。
[0881]
此處，經(jīng)脫氨基的堿基可為尿嘧啶或次黃嘌呤。
[0882]
經(jīng)脫氨基的堿基的移除可根據(jù)構(gòu)成向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物的dna糖基化酶的類型而變化。
[0883]
例如，當(dāng)構(gòu)成向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物的dna糖基化酶為烷基腺嘌呤dna糖基化酶(aag)或aag變體時(shí)，將脫氧核糖或核糖與構(gòu)成核苷酸的堿基(經(jīng)脫氨基的腺嘌呤或次黃嘌呤)連接的n-糖苷鍵可被水解。此外，可形成ap位點(diǎn)(無嘌呤/無嘧啶位點(diǎn))。ap位點(diǎn)可自發(fā)地或由于dna(或rna)損傷以無嘌呤或嘧啶堿基的形式位于dna(或rna)中。
[0884]
在另一實(shí)例中，當(dāng)構(gòu)成向?qū)na-單堿基置換蛋白的復(fù)合物的dna糖基化酶為尿嘧啶dna糖基化酶(udg或ung)或udg變體時(shí)，將脫氧核糖或核糖與構(gòu)成核苷酸的堿基(經(jīng)脫氨基的胞嘧啶或尿嘧啶)連接的n-糖苷鍵可被水解。此外，可形成ap位點(diǎn)(無嘌呤/無嘧啶位點(diǎn))。
[0885]
v)經(jīng)堿基移除的靶核酸序列的修復(fù)或恢復(fù)
[0886]
經(jīng)堿基移除的靶核酸序列的修復(fù)或恢復(fù)包括剪切后靶核酸序列的修復(fù)或恢復(fù)。
[0887]
經(jīng)堿基移除的靶核酸序列可為經(jīng)剪切的靶核酸序列。
[0888]
其中，經(jīng)剪切的靶核酸序列可為其中的雙鏈均被剪切的靶核酸序列。
[0889]
其中，經(jīng)剪切的靶核酸序列可為其中的雙鏈之一被剪切的靶核酸序列。其中，經(jīng)剪切的鏈可為經(jīng)堿基移除的鏈?；蛘?，經(jīng)剪切的鏈可為其中的堿基未被移除的鏈。
[0890]
經(jīng)堿基移除的靶核酸序列的修復(fù)或恢復(fù)可為靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)經(jīng)堿基移除的核苷酸的ap位點(diǎn)處由任意堿基(即腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶)修復(fù)或
恢復(fù)。
[0891]
例如，靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)脫氨基腺嘌呤移除的核苷酸的ap位點(diǎn)可被修復(fù)為鳥嘌呤。或者，靶核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)脫氨基腺嘌呤移除的核苷酸的ap位點(diǎn)可被修復(fù)為胞嘧啶。靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)脫氨基腺嘌呤移除的核苷酸的ap位點(diǎn)可被修復(fù)為胸腺嘧啶。靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)脫氨基腺嘌呤移除的核苷酸的ap位點(diǎn)可被修復(fù)為尿嘧啶。靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)脫氨基腺嘌呤移除的核苷酸的ap位點(diǎn)可被修復(fù)為腺嘌呤。
[0892]
在另一實(shí)例中，靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)脫氨基胞嘧啶移除的核苷酸的ap位點(diǎn)可被修復(fù)為腺嘌呤。或者，靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)脫氨基胞嘧啶移除的核苷酸的ap位點(diǎn)可被修復(fù)為鳥嘌呤?；蛘?，靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)脫氨基胞嘧啶移除的核苷酸的ap位點(diǎn)可被修復(fù)為胸腺嘧啶?；蛘撸泻怂嵝蛄兄幸粋€(gè)或多個(gè)脫氨基胞嘧啶移除的核苷酸的ap位點(diǎn)可被修復(fù)為尿嘧啶。或者，靶核酸序列中一個(gè)或多個(gè)脫氨基胞嘧啶移除的核苷酸的ap位點(diǎn)可被修復(fù)為胞嘧啶。
[0893]
人工修飾可發(fā)生在基因的外顯子或內(nèi)含子、剪接位點(diǎn)、調(diào)控區(qū)域(增強(qiáng)子或阻抑區(qū))、5'末端或其臨近區(qū)域、或3'末端或其臨近區(qū)域。
[0894]
例如，人工修飾可為外顯子區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)堿基的置換。例如，在基因的外顯子區(qū)域中，一個(gè)或多個(gè)a和/或c可被置換為不同的堿基(a、c、t、g或u)。
[0895]
在另一實(shí)例中，人工修飾可為內(nèi)含子區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)堿基的置換。例如，在基因的內(nèi)含子區(qū)域中，一個(gè)或多個(gè)a和/或c可被置換為不同的堿基(a、c、t、g或u)。
[0896]
例如，人工修飾可為剪接位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)堿基的置換。例如，在基因的剪接位點(diǎn)處，一個(gè)或多個(gè)a和/或c可被置換為不同的堿基(a、c、t、g或u)。
[0897]
在另一實(shí)例中，人工修飾可為調(diào)控區(qū)域(增強(qiáng)子或阻抑區(qū))中的一個(gè)或多個(gè)堿基的置換。例如，在調(diào)控區(qū)域(增強(qiáng)子或阻抑區(qū))中，一個(gè)或多個(gè)a和/或c可被置換為不同的堿基(a、c、t、g或u)。
[0898]
人工修飾可為編碼蛋白質(zhì)的基因的密碼子序列的修飾。
[0899]“密碼子”是指來自基因的編碼氨基酸的遺傳密碼之一。當(dāng)dna轉(zhuǎn)錄成信使rna(mrna)時(shí)，此種mrna的三個(gè)核苷酸形成每個(gè)密碼子。密碼子可編碼一種類型的氨基酸或終止氨基酸合成的終止密碼子。
[0900]
人工修飾可為通過一個(gè)或多個(gè)單堿基修飾對編碼蛋白質(zhì)的密碼子序列的修飾，并且經(jīng)修飾的密碼子序列可編碼相同的氨基酸或不同的氨基酸。
[0901]
例如，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)核酸序列從c變?yōu)閠時(shí)，編碼脯氨酸的ccc密碼子可變?yōu)榫幋a亮氨酸的cuu或cuc、編碼絲氨酸的ucc或ucu、或編碼苯丙氨酸的uuc或uuu。
[0902]
例如，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)堿基從a變?yōu)閏時(shí)，編碼蘇氨酸的acc或aca可變?yōu)榫幋a脯氨酸的ccc或cca。
[0903]
例如，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)堿基從a變?yōu)間時(shí)，編碼賴氨酸的aaa密碼子可變?yōu)榫幋a谷氨酸的gaa或gag、編碼甘氨酸的gga或ggg、或編碼精氨酸的aga或agg。
[0904]
實(shí)施例
[0905]
下文結(jié)合實(shí)施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0906]
下文結(jié)合實(shí)施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例僅提供用于更具體地說明本發(fā)明，并且對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說將顯而易見的是，本發(fā)明的范圍不限于根據(jù)本
發(fā)明的要旨的實(shí)施例。
[0907]
實(shí)驗(yàn)方法
[0908]
[實(shí)施例1]
[0909]
實(shí)施例1-1：質(zhì)粒構(gòu)建
[0910]
使用gibson assembly(nebuilder hifi dna assembly試劑盒，neb)構(gòu)建質(zhì)粒。在通過pcr擴(kuò)增圖3(a)、圖7(a)和圖21的各片段后，將通過pcr擴(kuò)增的dna片段添加至gibson assembly master混合液中，并于50℃下孵育60分鐘。所有質(zhì)粒都包含cmv啟動子、p15a復(fù)制起點(diǎn)、和氨芐青霉素抗性基因的選擇標(biāo)記。一些質(zhì)粒包含人密碼子優(yōu)化的wt-cas9(p3s-cas9hc；addgene質(zhì)粒#43945)或其變體。
[0911]
實(shí)施例1-2：細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
[0912]
(1)hek293t細(xì)胞：單堿基置換crispr蛋白轉(zhuǎn)染
[0913]
將hek293t細(xì)胞在補(bǔ)充有10％fbs和1％抗生素的dulbecco改良eagle培養(yǎng)基(dmem，welgene)中在5％co2下于37℃孵育。轉(zhuǎn)染前，將hek293t細(xì)胞以每孔2
×
105個(gè)細(xì)胞的密度分配到6孔板中。隨后，使用4μl lipofectamine
tm 2000(thermo fisher scientific，11668019)，在200μl的opti-mem培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染1μg be3(wt、bpnls、xcas-ung、ung-xcas、scfv-apo-ung或scfv-ung-apo)和1μg sgrna表達(dá)質(zhì)粒(hemx1gx19或gx20)。
[0914]
(2)hela細(xì)胞：單堿基置換crispr蛋白轉(zhuǎn)染
[0915]
將hela細(xì)胞在補(bǔ)充有10％fbs和1％抗生素的dulbecco改良eagle培養(yǎng)基(dmem，welgene)中在5％co2下于37℃孵育。轉(zhuǎn)染前，將hela細(xì)胞以每孔2
×
105個(gè)細(xì)胞的密度分配到6孔板中。隨后，使用4μl lipofectamine
tm 2000(thermo fisher scientific，11668019)，在200μl的opti-mem培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染1μg堿基置換質(zhì)粒(be3 wt、bpnls be3、ung-ncas、ncas-ung或ncas-delta ung)和1μg sgrna表達(dá)質(zhì)粒。
[0916]
(3)hek293t細(xì)胞：單堿基置換crispr蛋白轉(zhuǎn)染
[0917]
將hek293t細(xì)胞在補(bǔ)充有10％fbs和1％抗生素的dulbecco改良eagle培養(yǎng)基(dmem，welgene)中在5％co2下于37℃孵育。轉(zhuǎn)染前，將hek293t細(xì)胞以每孔2
×
105個(gè)細(xì)胞的密度分配到6孔板中。隨后，使用2μl lipofectamine
tm 2000(thermo fisher scientific，11668019)，在200μl的opti-mem培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染500ng堿基置換質(zhì)粒(bpnls-ung-apobec-nureki ncas9-bpnls)、500ng sgrna表達(dá)質(zhì)粒(hemx1gx19或gx20)。
[0918]
實(shí)施例1-3：hemx1 gx19 sgrna、hemx1 gx20 sgrna的設(shè)計(jì)與合成
[0919]
(1)sgrna的設(shè)計(jì)與合成
[0920]
使用crispr rgen工具(http://www.rgenome.net；park等，bioinformatics 31：4014-4016，2015)設(shè)計(jì)了考慮hemx基因的“ngg”pam或“ng”pam的向?qū)na。除中靶(on-target)位點(diǎn)之外，認(rèn)為所設(shè)計(jì)的向?qū)na不具有1-堿基或2-堿基錯(cuò)配。
[0921]
在用于產(chǎn)生sgrna表達(dá)質(zhì)粒的寡核苷酸(參見表1)退火和延伸后，將它們克隆至prg2質(zhì)粒的bsa1位點(diǎn)。
[0922]
[表2]
[0923][0924]
(2)深度測序
[0925]
使用hipi plus dna聚合酶(elpis-bio)，通過pcr將中靶和脫靶(off-target)位點(diǎn)擴(kuò)增至200bp至300bp的大小。使用miseq(illumina)設(shè)備對通過上述方法獲得的pcr產(chǎn)物進(jìn)行測序，并使用由crispr rgen工具(www.rgenome.net)提供的cas分析器進(jìn)行分析。crispr/cas9剪切位點(diǎn)5bp內(nèi)的置換被認(rèn)為是由單堿基置換crispr蛋白誘導(dǎo)的突變。
[0926]
實(shí)施例1-4：實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0927]
使用根據(jù)本實(shí)施例的單堿基置換crispr蛋白，確認(rèn)了用腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)或鳥嘌呤(g)置換胞嘧啶(c)的效果。
[0928]
(1)bpnls驗(yàn)證
[0929]
確認(rèn)了在hek細(xì)胞中使用be3 wt和bpnls be3 wt，bpnls be3 wt相比be3 wt而言增加了c至t的置換率(參見圖7b)。
[0930]
(2)單堿基置換crispr蛋白的堿基置換效率的確認(rèn)
[0931]
1)hela細(xì)胞中c至n(a、t、g)效率的確認(rèn)
[0932]
在hela細(xì)胞中使用單堿基置換crispr蛋白確認(rèn)了hemx1 gx19 sgrna靶標(biāo)中c至n的置換率。
[0933]
作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確認(rèn)了經(jīng)ugi移除的ncas-delta ugi與be3 wt在c至g或c至a置換率方面幾乎沒有差異。然而，確認(rèn)了與be3 wt相比，ung融合的ung-ncas和ncas-ung的c至g或c至a的置換率增加(參見圖8)。由該結(jié)果確認(rèn)了，當(dāng)在be3 wt中將ugi置換為ung時(shí)，c至g或c至a置換的概率增加。
[0934]
此外，在hemx1 gx19 sgrna序列中，確認(rèn)了15c或16c的置換率。作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與be3 wt或bpnls be3相比，確認(rèn)了ung-ncas或ncas-ung在15c或16c具有增加的c至g或c至a置換的概率(參見圖9)。
[0935]
確認(rèn)了在hemx1 gx19 sgrna序列中，相比16c，在15c更容易發(fā)生c至g或c至a的置換，并且在具有ung-ncas結(jié)構(gòu)的單堿基置換crispr蛋白中，c至g或c至a的置換概率是最高
的(參見圖9)。
[0936]
2)hek細(xì)胞中c至n(a、t、g)效率的確認(rèn)
[0937]
在hek細(xì)胞中使用hemx1 gx20 sgrna靶標(biāo)確認(rèn)了單堿基置換crispr蛋白的c至n置換率。
[0938]
作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確認(rèn)了在hemx1 gx19 sgrna序列中，13c、15c、16c和17c處發(fā)生了堿基置換(參見圖10)。
[0939]
此外，確認(rèn)了在hek細(xì)胞中，與ung-ncas相比，ncas-ung的c至n置換率增加(參見圖11)。特別是，確認(rèn)了在15c、16c和17c處，在ung-ncas中比在ncas-ung中更容易發(fā)生c至g或c至a堿基置換(參見圖11)。
[0940]
此外，作為確認(rèn)使用單堿基置換crispr蛋白復(fù)合物(即具有單鏈可變片段(scfv)的融合堿基置換結(jié)構(gòu)域(scfv-apo-ung或scfv-ung-apo))在hemx1靶核酸序列中的單堿基置換效率的結(jié)果，確認(rèn)了在11c更容易發(fā)生從c至a的堿基置換，并且在15c和16c更容易發(fā)生從c至g的堿基置換(參見圖22至圖24)。
[0941]
(3)nureki ncas9驗(yàn)證
[0942]
為了擴(kuò)大能夠使用單堿基置換crispr蛋白產(chǎn)生隨機(jī)差錯(cuò)的靶位點(diǎn)，使用具有ng pam序列的nureki ncas9進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
[0943]
作為使用hemx1 gx17 sgrna和hemx1gx20sgrna進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確認(rèn)了它們在hek細(xì)胞中工作良好。特別是，確認(rèn)了在ng pam中發(fā)生了c至n的置換(參見圖12)。
[0944]
[實(shí)施例2]
[0945]
實(shí)施例2-1：質(zhì)粒構(gòu)建
[0946]
使用gibson assembly(nebuilder hifi dna assembly試劑盒，neb)構(gòu)建質(zhì)粒。在使用pcr擴(kuò)增圖4的各片段后，將通過pcr擴(kuò)增的dna片段添加至gibson assembly master混合液中，并于50℃下孵育60分鐘。所有質(zhì)粒都包含人密碼子優(yōu)化的wt-cas9(p3s-cas9hc；addgene質(zhì)粒#43945)、cmv啟動子、p15a復(fù)制起點(diǎn)、和氨芐青霉素抗性基因的選擇標(biāo)記(參見圖19和圖20)。
[0947]
實(shí)施例2-2：sgrna的設(shè)計(jì)與合成
[0948]
(1)sgrna的設(shè)計(jì)
[0949]
選擇了科學(xué)期刊《nature》中公開的題為“base editing of a,t to c,g in genomic dna without dna cleavage”的文章中擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2所示出的三個(gè)sgrna(參見圖25)。
[0950]
(2)sgrna的合成
[0951]
兩個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸退火至pcr擴(kuò)增模板并延伸，用于sgrna合成。
[0952]
使用t7rna聚合酶(new england biolabs)進(jìn)行模板dna(不包括靶序列中3'末端的“ngg”)的體外轉(zhuǎn)錄，根據(jù)制造商的方案合成rna，然后使用turbo dnase(ambion)移除模板dna。使用expin combo試劑盒(geneall)和異丙醇沉淀純化轉(zhuǎn)錄的rna。
[0953]
在這個(gè)實(shí)施例中，將本文使用的化學(xué)合成的sgrna用2'ome和硫代磷酸酯進(jìn)行修飾。
[0954]
實(shí)施例2-3：細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
[0955]
(1)hek293t細(xì)胞：單堿基置換crispr蛋白轉(zhuǎn)染
[0956]
將hek293t細(xì)胞在補(bǔ)充有10％fbs和1％抗生素的dulbecco改良eagle培養(yǎng)基(dmem，welgene)中在5％co2下于37℃孵育。轉(zhuǎn)染前，將hek293t細(xì)胞以每孔5
×
104個(gè)細(xì)胞的密度分配到24孔板中。隨后，使用12μlhd轉(zhuǎn)染試劑(目錄號e231a，promega)，在200μl的opti-mem培養(yǎng)基中用3μg abe(wt、n-aag或c-aag)轉(zhuǎn)染各1μg的三種不同的sgrna表達(dá)質(zhì)粒。
[0957]
(2)深度測序
[0958]
使用hipi plus dna聚合酶(elpis-bio)，將中靶和脫靶位點(diǎn)pcr擴(kuò)增至200bp至300bp的大小。使用miseq(illumina)設(shè)備對通過上述方法獲得的pcr產(chǎn)物進(jìn)行測序，并使用由crispr rgen工具(www.rgenome.net)提供的cas分析器進(jìn)行分析。crispr/cas9剪切位點(diǎn)5bp內(nèi)的置換被認(rèn)為是由單堿基置換crispr蛋白誘導(dǎo)的突變。
[0959]
實(shí)施例2-4：實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0960]
腺嘌呤堿基編輯器(abe)是指腺嘌呤修復(fù)遺傳剪刀，且為用鳥嘌呤(g)置換腺嘌呤(a)的技術(shù)。烷基腺嘌呤dna糖基化酶(aag)為從dna中移除肌苷堿基的酶(圖2)。本發(fā)明人通過在abe wt質(zhì)粒的n-末端和c-末端各自插入aag基因以誘導(dǎo)腺嘌呤(a)的隨機(jī)突變，開發(fā)了腺嘌呤堿基置換蛋白。cas9切口酶、腺苷脫氨酶和dna糖基化酶按照各種順序產(chǎn)生融合蛋白(圖4)。
[0961]
為了確認(rèn)腺嘌呤(a)的隨機(jī)突變，將三種sgrna(sgrna1、sgrna2和sgrna3)與具有編碼堿基置換蛋白的核酸的質(zhì)粒(即修飾的abe質(zhì)粒)一起轉(zhuǎn)染至hek 293t細(xì)胞。作為實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確認(rèn)了與abe wt相比，用修飾的abe質(zhì)粒(n-aag和c-aag)轉(zhuǎn)染的hek293t細(xì)胞中sgrna 1的堿基序列中的腺嘌呤(a)14被隨機(jī)置換為不同的堿基(胸腺嘧啶，t；胞嘧啶，c；或鳥嘌呤，g)。確認(rèn)了sgrna 1的堿基序列中的腺嘌呤(a)19和腺嘌呤(a)13被置換為不同的堿基(圖27)，并且僅在aag插入n-末端的質(zhì)粒中，sgrna 1中的腺嘌呤16和腺嘌呤12被置換。(圖28)。因此，確認(rèn)了通過將aag插入abe誘導(dǎo)了不同堿基對腺嘌呤(a)的隨機(jī)置換。此外，當(dāng)不考慮cas9切口酶、腺苷脫氨酶和dna糖基化酶的順序的情況下使用腺嘌呤置換蛋白時(shí)，確認(rèn)誘導(dǎo)了不同堿基對腺嘌呤(a)的隨機(jī)置換(參見圖26至圖28)。
[0962]
[實(shí)施例3]
[0963]
使用suntag系統(tǒng)進(jìn)行單堿基置換
[0964]
實(shí)施例3-1：質(zhì)粒構(gòu)建
[0965]
使用gibson assembly(nebuilder hifi dna assembly試劑盒，neb)構(gòu)建質(zhì)粒。在通過pcr擴(kuò)增圖5(a)、圖5(b)和圖5(c)的各片段后，將通過pcr擴(kuò)增的dna片段添加至gibson assembly master混合液中，并于50℃下孵育15-60分鐘。所有質(zhì)粒都包含人密碼子優(yōu)化的wt-cas9(p3s-cas9hc；addgene質(zhì)粒#43945)、cmv啟動子、p15a復(fù)制起點(diǎn)、和氨芐青霉素抗性基因的選擇標(biāo)記。
[0966]
實(shí)施例3-2：細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
[0967]
將pc9細(xì)胞在補(bǔ)充有10％fbs和1％抗生素的rosewell park memorial institute 1640(rpmi 1640，welgene)中在5％co2下于37℃孵育。轉(zhuǎn)染前，將pc9細(xì)胞以每孔2
×
105個(gè)細(xì)胞的密度分配到24孔板中。隨后，使用4μl lipofectamine
tm 2000(thermo fisher scientific，11668019)，在200μl的opti-mem培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染1500ng的每種堿基置換質(zhì)粒(apobec-ncas9-ugi和apobec-nureki ncas9-ung)和500ng sgrna表達(dá)質(zhì)粒(hemx1gx19)；
1000ng的suntag質(zhì)粒(gcn4-ncas9)和1000ng的每種scfv質(zhì)粒(scfv-apobec-ung和scfv-ung-apobec)；或500g的sgrna表達(dá)質(zhì)粒(hemx1 gx19)。
[0968]
實(shí)施例3-3：深度測序
[0969]
使用hipi plus dna聚合酶(elpis-bio)，通過pcr將中靶和脫靶位點(diǎn)擴(kuò)增至200bp至300bp的大小。使用miseq(illumina)設(shè)備對通過上述方法獲得的pcr產(chǎn)物進(jìn)行測序，并使用由crispr rgen工具(www.rgenome.net)提供的cas分析器進(jìn)行分析。sgrna序列區(qū)域10bp內(nèi)的置換被認(rèn)為是由單堿基置換crispr蛋白誘導(dǎo)的突變。
[0970]
實(shí)施例3-4：實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0971]
確認(rèn)在pc9細(xì)胞中使用單堿基置換蛋白的c至n的置換率。
[0972]
使用suntag系統(tǒng)，通過僅用一個(gè)ncas9最大化ung效應(yīng)來增加隨機(jī)突變的誘導(dǎo)。結(jié)果確認(rèn)了scfv-ung-apobec能夠具有與wt相似的單堿基置換效率并誘導(dǎo)隨機(jī)堿基置換(c至t或a或g)(參見圖13)。
[0973]
[實(shí)施例4]
[0974]
使用單堿基置換crispr蛋白誘導(dǎo)egfr c797s突變以及奧希替尼耐受性的確認(rèn)
[0975]
實(shí)施例4-1：pc9細(xì)胞：單堿基置換crispr蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)和藥物培養(yǎng)
[0976]
將pc9細(xì)胞在補(bǔ)充有10％fbs和1％抗生素的rosewell park memorial institute 1640(rpmi 1640，welgene)中在5％co2下于37℃孵育。轉(zhuǎn)染前，將pc9細(xì)胞以每孔3
×
106個(gè)細(xì)胞的密度分配到15cm2的皿中。隨后，使用4μl lipofectamine
tm 2000(thermo fisher scientific，11668019)，在3ml的opti-mem培養(yǎng)基中用15μg n-ung轉(zhuǎn)染各5μg的兩種不同sgrna表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后三天，用4μg/ml殺稻瘟菌素處理所述質(zhì)粒7天。通過足夠的抗生素培養(yǎng)獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系后，將細(xì)胞用100nm奧希替尼(selleckchem，s5078)處理20天，該藥物為非小細(xì)胞肺癌的靶向治療劑。使用能夠產(chǎn)生已知具有奧希替尼耐受性的c797s突變體的sgrna(c797s sgrna 1(seq id no：21)和c797s sgrna 2(seq id no：22)進(jìn)行陽性對照實(shí)驗(yàn)。確認(rèn)了使用篩選系統(tǒng)富集了c797s突變體。
[0977]
實(shí)施例4-2：深度測序
[0978]
使用hipi plus dna聚合酶(elpis-bio)，將中靶和脫靶位點(diǎn)pcr擴(kuò)增至200bp至300bp的大小。使用miseq(illumina)設(shè)備對通過上述方法獲得的pcr產(chǎn)物進(jìn)行測序，并使用由crispr rgen工具(www.rgenome.net)提供的be分析器進(jìn)行分析。sgrna序列位點(diǎn)10bp內(nèi)的置換被認(rèn)為是由單堿基置換crispr蛋白誘導(dǎo)的突變。
[0979]
實(shí)施例4-3：實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0980]
奧希替尼(第三代egfr酪氨酸激酶抑制劑(tki))被用作對第二代藥物具有耐受性的egfr t790m陽性非小細(xì)胞肺癌患者的治療劑。通過n-ung誘導(dǎo)靶sgrna序列中胞嘧啶的隨機(jī)堿基置換，篩選對特定藥物具有耐受性的突變體。
[0981]
通過使用對奧希替尼具有耐受性的已知突變體c797s作為陽性對照，確認(rèn)了相應(yīng)的工具有效。當(dāng)發(fā)生c797s sgrna 1中的c15至g的堿基置換或c797s sgrna 2中的c13至g的堿基置換時(shí)，egfr的氨基酸797半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸。作為實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，雖然在僅用殺稻瘟菌素處理的組中只有10％的15c和13c通過c797s sgrna 1和二價(jià)n-ung置換為g，確認(rèn)了在奧希替尼處理的組中c變?yōu)間的部分增加50％或80％(參見圖30)。
[0982]
[實(shí)施例5]
[0983]
通過egfr sgrna文庫的引入制備轉(zhuǎn)化細(xì)胞及耐藥突變體的篩選
[0984]
實(shí)施例5-1：egfr sgrna文庫的設(shè)計(jì)與合成
[0985]
使用crispr rgen工具(www.rgenome.net)設(shè)計(jì)了來自表皮生長因子受體(egfr)基因的27個(gè)外顯子的總共1803個(gè)sgrna。在設(shè)計(jì)的1803個(gè)sgrna寡核苷酸池的正向寡核苷酸序列的5'末端添加caccg，在其反向寡核苷酸序列的5'末端添加aaac以及在3'末端添加c后，委托twist bioscience進(jìn)行合成。
[0986]
實(shí)施例5-2：egfr sgrna文庫質(zhì)粒的制備
[0987]
合成的egfr sgrna寡核苷酸池于95℃反應(yīng)5分鐘，并通過逐漸降溫直至25℃來進(jìn)行退火。隨后，用t4連接酶連接用bsa1限制性酶剪切的piggybac轉(zhuǎn)座子骨架載體和egfr sgrna寡核苷酸池。通過電穿孔將連接反應(yīng)溶液插入endura
tm duo電感受態(tài)細(xì)胞(lucigen，目錄號60242-2)。將如此轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞均勻地涂至添加有氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基上，并于37℃孵育過夜。使用nucelobond xtra midi ef(macherey-nagel，目錄號740420.50)從大腸桿菌菌落中獲得egfr sgrna文庫質(zhì)粒。
[0988]
實(shí)施例5-3：細(xì)胞培養(yǎng)
[0989]
將pc9細(xì)胞在補(bǔ)充有10％fbs和1％抗生素的rosewell park memorial institute 1640(rpmi 1640，welgene)中在5％co2下于37℃孵育。
[0990]
實(shí)施例5-4：使用piggybac轉(zhuǎn)座子制備轉(zhuǎn)化細(xì)胞
[0991]
通過將基因傳遞系統(tǒng)(即piggybac轉(zhuǎn)座子)應(yīng)用于pc9細(xì)胞來制備能夠表達(dá)egfr sgrna的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化前，將pc9細(xì)胞以每瓶4
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106個(gè)細(xì)胞的密度分配到t175燒瓶中。隨后，使用40μl lipofectamine
tm 2000(thermo fisher scientific，11668019)，以1:5的比例在3ml的opti-mem培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染piggybac轉(zhuǎn)座子載體和轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體。第二天，將所述細(xì)胞用2μg/ml嘌呤霉素處理并孵育7天。通過足夠的抗生素繼代培養(yǎng)獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系。
[0992]
實(shí)施例5-5：單堿基置換crispr蛋白的轉(zhuǎn)染及耐藥突變體的篩選
[0993]
在使用lipofectamine
tm 2000(thermo fisher scientific，11668019)轉(zhuǎn)染前約18至24小時(shí)，將4
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106個(gè)轉(zhuǎn)化的pc9細(xì)胞分配到t175燒瓶中。隨后，轉(zhuǎn)染20μg n-ung。轉(zhuǎn)染后三天，將細(xì)胞用4μg/ml殺稻瘟菌素作為抗生素進(jìn)行處理，并孵育7天。當(dāng)通過足夠的抗生素培養(yǎng)獲得穩(wěn)定的細(xì)胞時(shí)，將4
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106個(gè)細(xì)胞分配到t175燒瓶中。隨后，將所述細(xì)胞與100nm非小細(xì)胞肺癌治療劑奧希替尼(selleckchem，s5078)孵育20天，從而獲得耐受性突變型細(xì)胞。
[0994]
實(shí)施例5-6：深度測序
[0995]
使用hipi plus dna聚合酶(elpis-bio)，將中靶和脫靶位點(diǎn)pcr擴(kuò)增至200bp至300bp的大小。使用miseq(illumina)設(shè)備對通過上述方法獲得的pcr產(chǎn)物進(jìn)行測序，并委托對所得1803個(gè)egfr sgrna序列進(jìn)行分析。
[0996]
實(shí)施例5-7：實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0997]
在表達(dá)egfr sgrna的pc9細(xì)胞中，用n-ung對sgrna中的胞嘧啶進(jìn)行隨機(jī)置換，然后將細(xì)胞在補(bǔ)充有奧希替尼的培養(yǎng)基中孵育，隨后獲得活細(xì)胞分析結(jié)果(參見圖29和圖30)。圖31示出了通過在能夠表達(dá)egfr sgrna的pc9細(xì)胞中用n-ung對sgrna中的胞嘧啶進(jìn)行隨機(jī)置換并在補(bǔ)充有奧希替尼的培養(yǎng)基中孵育所述細(xì)胞而來的活細(xì)胞分析結(jié)果。