一種多芳乙烯
β-二酮類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多芳乙烯β-二酮類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽及其應(yīng)用。


背景技術(shù)：

2.放療是惡性腫瘤綜合治療中重要方式之一，基于常規(guī)長程放療的新輔助治療已成為治療多種惡性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)方案。但長期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤患者對于放射性治療的響應(yīng)程度差異較大，盡管一部分患者在治療周期結(jié)束時可以實現(xiàn)病理完全緩解，然而，有部分的患者不能從長程治療中獲益，少部分患者甚至出現(xiàn)惡化進(jìn)展。如中山大學(xué)腫瘤防治中心結(jié)直腸科近年來(2014-2019年，年均收治1800例)的評估結(jié)果顯示，不能獲益的患者占比為30％左右，出現(xiàn)進(jìn)展的占比達(dá)10％；另外，放射性治療所產(chǎn)生的副作用在臨床上也不可忽視。因此，如何提升惡性放射性治療效果，提升患者獲益率，減少放射性使用劑量等，成為惡性腫瘤臨床治療中所關(guān)注的問題。
3.當(dāng)前，針對放射性治療的增敏，主要有使用解除腫瘤低氧特征的化合物，如臨床藥物甘胺雙唑鈉(cmna)。但該藥物活性偏低，使用劑量大、存在毒副作用明顯等缺陷。
4.研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤對放療的耐受的機制，除了與腫瘤中低氧環(huán)境影響有關(guān)外，放療導(dǎo)致的dna損傷修復(fù)機制的增強也是其重要原因。但針對性的藥物當(dāng)前仍然沒有突破，發(fā)現(xiàn)具有克服這些因素的放療增敏藥物具有迫切的臨床需求。


技術(shù)實現(xiàn)要素：

5.本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種多芳乙烯β-二酮類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽及其應(yīng)用。
6.為實現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
7.一種多芳乙烯β-二酮類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其結(jié)構(gòu)如式(1)所示：
8.9.式(1)中，r1＝r5＝r9＝h，r2＝r6＝ome，r7＝oh；當(dāng)r3＝r4＝ome時，r8為f、cl、i中的一種；當(dāng)r3和r4連接成為-och2o-時，r8為f、cl、br、i中的一種。
10.優(yōu)選地，所述多芳乙烯β-二酮類化合物為以下結(jié)構(gòu)式所示化合物中的一種：
[0011][0012]
第二方面，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0013]
一種多芳乙烯β-二酮類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備放射性治療藥物中的應(yīng)用，所述多芳乙烯β-二酮類化合物的結(jié)構(gòu)如式(1)所示：
[0014][0015]
式(1)中，r1和r
4-r9分別為h、oh、nh2、ch2oh、ch2nh2、ome、oc2h5、ocf3、f、cl、br、i中的一種，r2和r3分別為h、oh、nh2、ch2oh、ch2nh2、ome、oc2h5、ocf3、f、cl、br、i中的一種，但當(dāng)r1＝r5＝r9＝h，r2＝r3＝r4＝r6＝ome，r7＝oh時，r8不為h；當(dāng)r1＝r2＝r5＝r9＝h，r3＝r4＝r6＝ome，r7＝oh時，r8不為h。
[0016]
優(yōu)選地，式(1)中，r1＝r5＝r9＝h，r2、r3、r4與r6分別為ome、oc2h5、ocf3中的一種，r7為oh、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一種，r8為ome、oc2h5、ocf3、br、cl、f或i中的一種；更優(yōu)選地，式(1)中，r1＝r5＝r9＝h，r2＝r3＝r4＝r6＝ome，r7為oh，r8為ome、br中的一種。
[0017]
優(yōu)選地，式(1)中，r1＝r5＝r6＝r9＝h，r2、r3、r4與r7分別為ome、oc2h5、ocf3中的一種，r8為oh、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一種；更優(yōu)選地，式(1)中，r1＝r5＝r6＝r9＝h，r2＝r3＝r4＝r7＝ome，r8為oh。
[0018]
優(yōu)選地，式(1)中，r3＝r4＝r6＝r8＝h，r1、r2、r5、r7與r9分別ome、oc2h5、ocf3中的一種；更優(yōu)選地，式(1)中，r3＝r4＝r6＝r8＝h，r1＝r2＝r5＝r7＝r9＝ome。
[0019]
優(yōu)選地，式(1)中，r3＝r4＝r5＝r6＝r9＝h，r1、r2、r7與r8分別為ome、oc2h5、ocf3中的一種。
[0020]
優(yōu)選地，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2與r3分別為oh、ome、oc2h5、ocf3中的一種，r6為h、f、cl、br、i、oh、ome、oc2h5、ocf3中的一種，r7為oh、ome、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一種，r8為h、ome、ocf3、oc2h5、br、cl、f、i中的一種；更優(yōu)選地，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2和r3分別為ome或oh，r6為h、f、br、oh、ome中的一種，r7為oh或ome，r8為h、ome、oc2h5、br中的一種。
[0021]
優(yōu)選地，式(1)中，r1＝r4＝r6＝r8＝h，r2與r3分別為ome、oc2h5、ocf3中的一種，r5、r7與r9分別為ome、oc2h5、ocf3中的一種；更優(yōu)選地，式(1)中，r1＝r4＝r6＝r8＝h，r2＝r3＝r5＝r7＝r9＝ome。
[0022]
優(yōu)選地，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2和r3連接成為-och2o-，r6為f、cl、br、i、ome、oc2h5、ocf3中的一種，r7為oh、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一種，r8為h、ome、oc2h5、ocf3、br、cl、f、i中的一種；更優(yōu)選地，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2和r3連接成為-och2o-，r6為f、br或ome，r7為oh，r8為h、ome、br中的一種。
[0023]
優(yōu)選地，所述多芳乙烯β-二酮類化合物為以下結(jié)構(gòu)式所示化合物中的一種：
[0024]
優(yōu)選地，所述放射性治療藥物包括腫瘤放療增敏藥物。更優(yōu)選地，腫瘤包括抗生殖系統(tǒng)腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤、呼吸系統(tǒng)腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、泌尿系統(tǒng)腫瘤、皮膚腫瘤、骨與軟組織肉瘤、乳腺癌、甲狀腺癌、垂體瘤中的至少一種。
[0025]
本發(fā)明提供的多芳乙烯β-二酮類化合物具有以下顯著有益特征：
[0026]
1)具有放療增敏作用，在低劑量(在細(xì)胞水平的有效濃度為納摩爾級)下即可顯著提升對多種腫瘤的放療效果，且活性遠(yuǎn)優(yōu)于我們前期報道的分子t83、t63以及其它多數(shù)已報道的增敏劑；
[0027]
2)對低氧環(huán)境腫瘤顯示出更強的增敏效應(yīng)；
[0028]
3)可有效抑制由放療所致dna損傷后的修復(fù)過程，有利于促進(jìn)放療對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)；
[0029]
4)可有效協(xié)同激活干擾素基因激活蛋白(sting)信號通路，有利于免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的清除；
[0030]
因此，本發(fā)明提供的多芳乙烯β-二酮類化合物作為放療增敏活性成分應(yīng)用于腫瘤的放射治療中，可大幅提高腫瘤的放療效果。
附圖說明
[0031]
圖1為多芳乙烯β-二酮類化合物pt33分別在hct116和sw837腫瘤細(xì)胞模型中的放療增敏活性。
[0032]
圖2為多芳乙烯β-二酮類化合物pt33在乏氧(5v/v％o2)條件下的放療增敏活性。
[0033]
圖3為多芳乙烯β-二酮類化合物pt33與放射治療聯(lián)用對hct116腫瘤細(xì)胞的協(xié)同放療增敏作用。
[0034]
圖4為多芳乙烯β-二酮類化合物pt33對小鼠下咽癌移植腫瘤的放療的影響。
[0035]
圖5為多芳乙烯β-二酮類化合物pt33對小鼠結(jié)直腸癌移植腫瘤的放療的影響。
[0036]
圖6為多芳乙烯β-二酮類化合物pt33對放療后dna損傷的影響。
[0037]
圖7為多芳乙烯β-二酮類化合物pt33對dna修復(fù)的完成時間的影響。
[0038]
圖8為多芳乙烯β-二酮類化合物pt33對γ-h2ax在dna的dsb位點聚集停留時間的影響。
[0039]
圖9為多芳乙烯β-二酮類化合物pt33對dna同源重組修復(fù)酶rad51入核的影響。
[0040]
圖10為多芳乙烯β-二酮類化合物pt33對放療作用下sting免疫通路的影響。
具體實施方式
[0041]
為更好地說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0042]
實施例中，所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043]
本文中，縮寫“me”為甲基，“藥學(xué)上可接受的鹽”可以為多芳乙烯β-二酮類化合物與合適的非毒性有機堿或無機堿形成的鹽。
[0044]
我們早期曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)多芳乙烯β-二酮類化合物具有抗腫瘤作用潛力
(cn200810220580.x)，但將其作為抗腫瘤化療藥物使用，其體內(nèi)效應(yīng)不高。此后我們將多芳乙烯β-二酮類化合物t83應(yīng)用于鼻咽癌細(xì)胞模型cne2中(bmc cancer,2013,13,323)，發(fā)現(xiàn)在50nm t83聯(lián)合4gy輻射劑量情況下，能減少40％的細(xì)胞集落生成率，相比單獨使用50nm t83(8％)效果與4gy輻射劑量(25％)效果之和進(jìn)一步減少7％左右，相比單獨4gy輻射劑量(25％)作用下細(xì)胞集落生成率進(jìn)一步減少20％左右，表明t83具有一定的協(xié)同增強效應(yīng)；還將多芳乙烯β-二酮類化合物t63應(yīng)用于鼻咽癌細(xì)胞模型cne2中(中國病理生理雜志,2013，29(5)，821)，發(fā)現(xiàn)在100nm t63聯(lián)合6gy輻射劑量情況下，能減少80.2％細(xì)胞集落生成率，接近單獨使用100nm t63(43％)以及6gy輻射劑量(37％)效應(yīng)之和，表明在此條件下t63表現(xiàn)加和作用，但沒有表現(xiàn)明顯的協(xié)同增強效應(yīng)；但在耐藥細(xì)胞株cner模型上，在100nm t63聯(lián)合6gy輻射劑量情況下，能減少87.0％細(xì)胞集落生成率，相比單獨使用100nm t63(48％)以及6gy輻射劑量(18％)效應(yīng)之和增強21％左右。
[0045][0046]
在此基礎(chǔ)上，我們又進(jìn)行了廣泛設(shè)計與篩選，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)如式(1)所示的多芳乙烯β-二酮類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽對惡性腫瘤具有顯著放療增敏作用，將其作為放療增敏活性成分可用于制備放射性治療藥物，該放射性治療藥物與放療方法聯(lián)用可以發(fā)揮較好的抗腫瘤作用，在細(xì)胞水平的有效濃度為納摩爾級，在多種荷瘤小鼠模型中的有效劑量甚至可低至小于1毫克/千克級；
[0047][0048]
式(1)中，r1和r
4-r9分別為h、oh、nh2、ch2oh、ch2nh2、ome、oc2h5、ocf3、f、cl、br、i中的一種，r2和r3分別為h、oh、nh2、ch2oh、ch2nh2、ome、oc2h5、ocf3、f、cl、br、i中的一種，但當(dāng)r1＝r5＝r9＝h，r2＝r3＝r4＝r6＝ome，r7＝oh時，r8不為h；當(dāng)r1＝r2＝r5＝r9＝h，r3＝r4＝r6＝ome，r7＝oh時，r8不為h。
[0049]
在一些實施方案中，式(1)中，r1＝r5＝r9＝h，r2、r3、r4與r6分別為ome、oc2h5、ocf3中的一種，r7為oh、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一種，r8為ome、oc2h5、ocf3、br、cl、f或i中的一種，所得多芳乙烯β-二酮類化合物表現(xiàn)出較強的放療增敏活性；在其中一些優(yōu)選實施方案中，
式(1)中，r1＝r5＝r9＝h，r2＝r3＝r4＝r6＝ome，r7為oh；r8為ome、br中的一種。
[0050]
在一些實施方案中，式(1)中，r1＝r5＝r6＝r9＝h，r2、r3、r4與r7分別為ome、oc2h5、ocf3中的一種，r8為oh、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一種，所得多芳乙烯β-二酮類化合物表現(xiàn)出較強的放療增敏活性；在其中一些優(yōu)選實施方案中，式(1)中，r1＝r5＝r6＝r9＝h，r2＝r3＝r4＝r7＝ome，r8為oh。
[0051]
在一些實施方案中，式(1)中，r3＝r4＝r6＝r8＝h，r1、r2、r5、r7與r9分別ome、oc2h5、ocf3中的一種，所得多芳乙烯β-二酮類化合物表現(xiàn)出較強的放療增敏活性；在其中一些優(yōu)選實施方案中，式(1)中，r3＝r4＝r6＝r8＝h，r1＝r2＝r5＝r7＝r9＝ome。
[0052]
在一些實施方案中，式(1)中，r3＝r4＝r5＝r6＝r9＝h，r1、r2、r7與r8分別為ome、oc2h5、ocf3中的一種，所得多芳乙烯β-二酮類化合物表現(xiàn)出較強的放療增敏活性。
[0053]
在一些實施方案中，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2與r3分別為oh、ome、oc2h5、ocf3中的一種，r6為h、f、cl、br、i、oh、ome、oc2h5、ocf3中的一種，r7為oh、ome、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一種，r8為h、ome、ocf3、oc2h5、br、cl、f、i中的一種，所得多芳乙烯β-二酮類化合物表現(xiàn)出較強的放療增敏活性；在其中一些優(yōu)選實施方案中，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2和r3分別為ome或oh，r6為h、f、br、oh、ome中的一種，r7為oh或ome，r8為h、ome、oc2h5、br中的一種。
[0054]
在一些實施方案中，式(1)中，r1＝r4＝r6＝r8＝h，r2與r3分別為ome、oc2h5、ocf3中的一種，r5、r7與r9分別為ome、oc2h5、ocf3中的一種。在其中一些優(yōu)選實施方案中，式(1)中，r1＝r4＝r6＝r8＝h，r2＝r3＝r5＝r7＝r9＝ome，所得多芳乙烯β-二酮類化合物表現(xiàn)出較強的放療增敏活性。
[0055]
在一些實施方案中，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2和r3連接成為-och2o-，r6為f、cl、br、i、ome、oc2h5、ocf3中的一種，r7為oh、ch2oh、nh2、ch2nh2中的一種，r8為h、ome、oc2h5、ocf3、br、cl、f、i中的一種，所得多芳乙烯β-二酮類化合物表現(xiàn)出較強的放療增敏活性；在其中一些優(yōu)選實施方案中，式(1)中，式(1)中，r1＝r4＝r5＝r9＝h，r2和r3連接成為-och2o-，r6為f、br或ome，r7為oh，r8為h、ome、br中的一種。
[0056]
在一些實施方案中，式(1)中，r1＝r5＝r9＝h，r2＝r6＝ome，r7＝oh；當(dāng)r3＝r4＝ome時，r8為f、cl、i中的一種；當(dāng)r3和r4連接成為-och2o-時，r8為f、cl、br、i中的一種，這些多芳乙烯β-二酮類化合物均是我們新設(shè)計的化合物，表現(xiàn)出較強的放療增敏活性。
[0057]
在一些實施方案中，多芳乙烯β-二酮類化合物為以下結(jié)構(gòu)式所示化合物中的一種：
[0058][0059]
相較于其它多芳乙烯β-二酮類化合物，這22種化合物具有更優(yōu)異的放療增敏作用。其中，單獨使用20nm pt33能使細(xì)胞集落生成率減少1％，單獨使用4gy能使細(xì)胞集落生成率減少77％，二者聯(lián)用能使細(xì)胞集落生成率減少91％，相比單獨使用20nm pt33(1％)效果與4gy輻射劑量(77％)效果之和進(jìn)一步減少13％左右，相比單獨4gy輻射劑量(77％)作用下細(xì)胞集落生成率進(jìn)一步減少61％左右，這表明pt33活性顯著高于t83。
[0060]
本發(fā)明所述放射性治療藥物包括但不限于腫瘤放療增敏藥物。相較于常氧環(huán)境，本發(fā)明的多芳乙烯β-二酮類化合物對低氧環(huán)境(如，5v/v％o2)腫瘤細(xì)胞顯示出更強的增敏效應(yīng)，可作為乏氧腫瘤細(xì)胞放療增敏劑，提高放療效果。
[0061]
本發(fā)明中涉及的多芳乙烯β-二酮類化合物可以以藥物組合物的形式存在，所述組合物含有治療有效量的多芳乙烯β-二酮類化合物以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0062]
本發(fā)明所述“藥學(xué)上可接受的載體”表示任何藥學(xué)上可接受的物質(zhì)，其可以是液體或固體，比如氯化鈉、甘油、葡萄糖、聚乙二醇、丙二醇、d-甘露糖醇、果糖、木糖醇、磷酸二氫鈉、磷酸鈉等。
[0063]
本發(fā)明所述“治療有效量”是指能夠有效抑制所治療個體的已有癥狀發(fā)展或減輕已有癥狀的量。應(yīng)當(dāng)理解，治療過程中所需本發(fā)明多芳乙烯β-二酮類化合物的劑量將隨所治療病癥的性質(zhì)、年齡和身體狀況而變。
[0064]
本發(fā)明的放療增敏藥物可以是液體，除了上述多芳乙烯β-二酮類化合物之外，本發(fā)明的放療增敏藥物還可包括生理鹽水、磷酸緩沖液(例如，氯化鈉、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉等)。
[0065]
本發(fā)明對于放療增敏劑的使用方法不存在特別限制。例如，當(dāng)本發(fā)明的放療增敏藥物是注射劑形態(tài)時，在放射治療時可使用注射器將所述放療增敏藥物注射至目標(biāo)腫瘤區(qū)域內(nèi)。
[0066]
本發(fā)明提供的多芳乙烯β-二酮類化合物對于腫瘤細(xì)胞的放療增敏作用，具有普適性，并不僅限于某種特定的腫瘤細(xì)胞，本發(fā)明所述腫瘤包括但不限于：
[0067]
生殖系統(tǒng)腫瘤：包括不限于宮頸癌、子宮內(nèi)膜上皮癌、會陰癌、卵巢癌，前列腺癌和陰莖癌；
[0068]
消化系統(tǒng)腫瘤：包括不限于食管癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌；
[0069]
呼吸系統(tǒng)腫瘤：包括不限于鼻咽癌、下咽癌、喉癌和肺癌；
[0070]
神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤：包括不限于星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤、髓母細(xì)胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)鞘瘤和神經(jīng)纖維瘤；
[0071]
泌尿系統(tǒng)腫瘤：包括但不限于腎細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、腎母細(xì)胞瘤、膀胱癌和尿道癌；
[0072]
皮膚癌：包括不限于皮膚基底細(xì)胞癌、皮膚鱗癌和黑色素瘤；
[0073]
骨與軟組織肉瘤：骨肉瘤和軟組織肉瘤；
[0074]
乳腺癌、甲狀腺癌與垂體瘤。
[0075]
實施例1多芳乙烯β-二酮類化合物pt33-f、pt33-cl、pt33-i、ptdo-f、ptdo-cl、ptdo-br、ptdo-i的合成及結(jié)構(gòu)表征
[0076]
多芳乙烯β-二酮類化合物pt33-f、pt33-cl、pt33-i、ptdo-f、ptdo-cl、ptdo-br、ptdo-i的合成按如下反應(yīng)式進(jìn)行：
[0077][0078]
具體為：在100ml圓底燒瓶中，將硼酐(0.35g,5mmol,1.0eq)、乙酰丙酮(1g,10mmol,2eq)溶于10ml乙酸乙酯，70℃反應(yīng)3h。抽濾除去溶劑，環(huán)己烷清洗兩次，得白色固體。在100ml圓底燒瓶中，將白色固體、相應(yīng)的芳香醛i(20mmol,4eq)、硼酸三正丁酯(4.60g，20mmol,4.0eq)溶于20ml乙酸乙酯，70℃攪拌30min。正丁胺(73mg，1mmol,0.2eq)用5ml乙酸乙酯稀釋，加入滴液漏斗緩慢滴加到反應(yīng)液中，升溫到85℃，繼續(xù)反應(yīng)24h。冷卻到60℃，加入1n hcl調(diào)節(jié)ph約5，60℃攪拌繼續(xù)反應(yīng)30min。分液得有機層，乙酸乙酯萃取水層，合并有機層，再用水洗兩遍，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到粗品，用柱層析分離得到中間體ii。
[0079]
將中間體ii(1mmol,1.0eq)和相應(yīng)芳香醛iii(2mmol,2.0eq)溶于25ml甲苯，再加入哌啶(4.0mg,0.05mmol,0.05eq)和乙酸(4.8mg,0.08mmol,0.08eq)做催化劑。140℃攪拌過夜，用分水器分離反應(yīng)過程中產(chǎn)生的水。tlc檢測反應(yīng)完全，反應(yīng)液用水洗2次，除去哌啶和乙酸，減壓濃縮得到粗品，用柱層析分離得到各終產(chǎn)物。
[0080]
pt33-f:黃色固體，產(chǎn)率30％；hplc tr＝27.78min；1h nmr(400mhz,cdcl3),δ7.73(d,j＝15.4hz,1h),7.72(s,1h),7.44(d,j＝16.1hz,1h),6.97(d,j＝15.4hz,1h),6.95(m,1h),6.85(s,1h),6.83(d,j＝16.1hz,1h),6.79(s,2h),6.70(s,2h),3.89(s,6h),3.88(s,
3h),3.87(s,3h),3.86(s,3h),3.85(s,6h)；hrms calcd for c
33h33o10
f[m+h]
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[0081]
pt33-cl:黃色固體，產(chǎn)率47％；hplc tr＝29.12min；1h nmr(400mhz,cdcl3),δ7.73(d,j＝15.4hz,1h),7.71(s,1h),7.44(d,j＝16.1hz,1h),7.16(d,j＝1.7hz,1h),6.98(d,j＝15.4hz,1h),6.95(d,j＝1.7hz,1h),6.83(d,j＝16.1hz,1h),6.80(s,2h),6.70(s,2h),3.89(s,6h),3.88(s,3h),3.87(s,3h),3.86(s,6h),3.85(s,3h)；hrms calcd for c
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[0083]
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[0084]
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[0085]
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[0086]
ptdoi:黃色固體，產(chǎn)率25％；hplc tr＝30.95min；1h nmr(400mhz,dmso),δ10.33(s,1h),7.99(s,1h),7.68(d,j＝15.4hz,1h),7.59(s,1h),7.55(d,j＝15.4hz,1h),7.41(d,j＝16.1hz,1h),7.29(s,1h),7.15(s,1h),7.10(s,2h),7.03(s,1h),6.99(d,j＝16.1hz,1h),6.09(s,2h),6.05(s,2h),3.89(s,3h),3.82(s,3h),3.73(s,3h)；hrms calcd for c
31h25o10
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+
:685.0565,found 685.0578.
[0087]
實施例2式(1)所示化合物對代表性腫瘤細(xì)胞的放療增敏活性
[0088]
選取各系統(tǒng)代表性腫瘤細(xì)胞株，含
①
生殖系統(tǒng)腫瘤包括宮頸癌(sw756)，子宮內(nèi)膜上皮癌(ess-1)、卵巢癌(ovcar-5)和前列腺癌(pc-3)細(xì)胞株；
②
消化系統(tǒng)腫瘤包括胃癌(ags)、肝癌(huh-7)、結(jié)直腸癌(hct116)和胰腺癌(panc1)細(xì)胞株；
③
呼吸系統(tǒng)腫瘤包括鼻咽癌(cne2)、下咽癌(fadu)和肺癌(a549)細(xì)胞株；
④
神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤包括星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤(u87)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤(acn)和髓母細(xì)胞瘤(pfsk-1)細(xì)胞株；
⑤
泌尿系統(tǒng)腫瘤包括腎細(xì)胞癌(a704)和膀胱癌(t24)細(xì)胞株；
⑥
皮膚癌包括皮膚鱗癌(a431)和黑色素瘤(colo-829)細(xì)胞
株；
⑦
骨與軟組織肉瘤包括骨肉瘤(u2os)和軟組織肉瘤(ht-1080)細(xì)胞株；以及
⑧
乳腺癌細(xì)胞株(mcf-7)、甲狀腺癌(htc-c3)與垂體瘤(rc-4bc)細(xì)胞株。將各細(xì)胞系生長期細(xì)胞以1000個細(xì)胞/孔的密度接種到6孔板中。24小時后，用6gy的x射線和/或50nm多芳乙烯β-二酮類化合物處理細(xì)胞，以不加化合物處理組為對照組，25μm的甘胺雙唑鈉(cmna)處理組作為參考組，然后培養(yǎng)48小時，cck8法檢測各體系中腫瘤細(xì)胞的生長抑制情況。以放療+化合物處理組各細(xì)胞死亡百分比/單獨加化合物組細(xì)胞死亡百分比作為協(xié)同作用變化倍數(shù)(fc)，以不含化合物放療組與不放療組的各細(xì)胞死亡百分比值為單獨放療作用變化倍數(shù)(fc0)，以fc/fc0為化合物增敏比，結(jié)果見表1。
[0089]
表1各化合物在不同細(xì)胞株中與放療聯(lián)用時的增敏比(fc/fc0)
[0090][0091][0092]
由表1可見，在存在50nm各代表性分子化合物的情況下，用6gy x射線處理引發(fā)的細(xì)胞死亡率增敏比(fc/fc0)達(dá)到2.06～6.97，其中pt33-f、pt33-cl、pt33-i、ptdo-f、ptdo-cl、ptdo-br、ptdo-i、pt5、pt6、pt11、pt12、pt14、pt33、pt34、pt35、pt41、pt43、pt61、pt62、pt66、pt67以及pt68的放療增敏效果也顯著優(yōu)于同濃度下的t83(fc/fc0為1.13～1.84之間)；而我們早期報道的另個分子t63，在100nm濃度下，其fc/fc0為1.00～1.49之間，顯著低于pt33-f、pt33-cl、pt33-i、ptdo-f、ptdo-cl、ptdo-br、ptdo-i、pt5、pt6、pt11、pt12、pt14、pt33、pt34、pt35、pt41、pt43、pt61、pt62、pt66、pt67以及pt68的放療增敏效果；另外，臨床藥物甘胺雙唑鈉(cmna)，雖然被報道具有放療增敏作用，但在本實驗條件下，沒有體現(xiàn)出活性，表明本發(fā)明中所述分子，活性遠(yuǎn)高于甘胺雙唑鈉。
[0093]
實施例3pt33在不同腫瘤細(xì)胞模型中的增敏活性
[0094]
使用平板克隆實驗表征放射治療與藥物聯(lián)用對細(xì)胞克隆形成的影響。將hct116和sw837細(xì)胞以1000個細(xì)胞/孔的密度接種到6孔板中，分別在常氧與乏氧狀態(tài)下(5v/v％o2)培養(yǎng)。24小時后，用指定劑量的x射線和/或不同濃度的藥物處理細(xì)胞，然后培養(yǎng)10-14天，然后用甲醇固定，0.5％結(jié)晶紫染色。對含有50個以上細(xì)胞的集落進(jìn)行計數(shù)，化合物的增敏能力以聯(lián)用前后細(xì)胞克隆形成減少的倍數(shù)fc表示，結(jié)果如圖1所示。
[0095]
圖1結(jié)果表明，pt33可有效增強多種腫瘤細(xì)胞株的放療效果，且在低氧條件下，其
增敏活性進(jìn)一步增強。
[0096]
實施例4pt33在乏氧條件下的放療增敏活性
[0097]
使用平板克隆實驗表征放射治療與藥物聯(lián)用對細(xì)胞克隆形成的影響。將hct116和sw837細(xì)胞以1000個細(xì)胞/孔的密度接種到6孔板中，在乏氧狀態(tài)下(5v/v％o2)培養(yǎng)。24小時后，用指定劑量的x射線和/或藥物(pt33或btz)處理細(xì)胞，然后培養(yǎng)10-14天，然后用甲醇固定，0.5％結(jié)晶紫染色。對含有50個以上細(xì)胞的集落進(jìn)行計數(shù)，化合物的增敏能力以聯(lián)用前后細(xì)胞克隆形成數(shù)，結(jié)果如圖2所示。
[0098]
代表性多芳乙烯β-二酮類化合物pt33可在乏氧條件下，可有效增強腫瘤細(xì)胞株的放療效果；另外，臨床使用的蛋白酶體抑制劑btz雖然也可產(chǎn)生增敏效果，但其在低氧條件下，活性顯著低于pt33。由此可見，本發(fā)明所提供的多芳乙烯β-二酮類化合物，在納摩爾級低濃度下即可有效增強腫瘤細(xì)胞株的放療效果，特別是對腫瘤缺氧細(xì)胞有更強的放療增敏效應(yīng)。
[0099]
實施例5pt33對腫瘤細(xì)胞的協(xié)同放療增敏作用
[0100]
采用hct116細(xì)胞增殖實驗?zāi)Ｐ?，使用cck-8檢測法分析放射治療與藥物聯(lián)用對細(xì)胞增殖抑制的效應(yīng)。將hct116細(xì)胞(1500個/孔)在96個孔板中培養(yǎng)24小時，然后用放療x射線和/或pt33處理后繼續(xù)培養(yǎng)72小時。細(xì)胞活力用cck-8試劑盒通過od450 nm測定。用chou-talalay法評價放射x線與藥物聯(lián)合應(yīng)用的療效。用于計算聯(lián)合指數(shù)(combination index,ci)，ci＝c/cx+d/dx+c
×
d/cx
×
dx(c和d分別代表聯(lián)用時達(dá)到某抑制效果時所用藥物的濃度和放射的劑量，cx和dx分別代表達(dá)到同等抑制效果時單獨所用藥物的濃度或放射的劑量)。當(dāng)ci《1說明兩藥聯(lián)合表現(xiàn)出協(xié)同作用；當(dāng)ci＝1說明兩藥聯(lián)合表現(xiàn)出相加作用；當(dāng)ci》1說明兩藥聯(lián)合表現(xiàn)為拮抗作用。圖3結(jié)果說明pt33與放療聯(lián)用對腫瘤細(xì)胞具有顯著的協(xié)同效應(yīng)。
[0101]
實施例6pt33對小鼠下咽癌移植腫瘤的放療的影響
[0102]
用雌性balb/c裸鼠(4-5周齡，15-18g)將fadu(下咽癌)細(xì)胞移植瘤塊(約5mm3)皮下種植到裸鼠右側(cè)，建立異種移植模型。當(dāng)異種移植物體積達(dá)到150mm3左右，用指定濃度的pt33(總量為1.75mg/kg/只，分7次腹腔注射給藥)和放療x射線(總劑量為14gy)交替治療小鼠14天(第7天到第20天)。放射治療時，除異種移植物區(qū)域以外，均采用鉛板覆蓋。每隔7天監(jiān)測異種移植瘤生長情況，腫瘤體積的計算公式如下：腫瘤體積＝0.52
×
寬度2×
長度。治療4周后處死，取出腫瘤并進(jìn)行分析。結(jié)果如圖4所示。
[0103]
圖4結(jié)果證明，在放射處理后，pt33與放療聯(lián)合組腫瘤體積較生理鹽水與放療聯(lián)合組顯著減少，在治療后一周即出現(xiàn)差異，隨后pt33與放療聯(lián)合組和ns-x射線聯(lián)合組體積差異逐漸增大，說明pt33在極低劑量下即可在動物模型上顯著增強移植瘤的放療效果，有效解決了現(xiàn)有大多數(shù)放療增敏劑存在活性低，使用劑量大的問題。
[0104]
實施例7pt33對小鼠結(jié)直腸癌移植腫瘤的放療的影響
[0105]
用雌性balb/c裸鼠(4-5周齡，15-18g)將hct116(結(jié)直腸癌)細(xì)胞移植瘤塊(約5mm3)皮下種植到裸鼠右側(cè)，建立異種移植模型。當(dāng)異種移植物體積達(dá)到150mm3左右，用指定濃度的pt33(0.10mg/kg/次，共7次腹腔注射給藥)和放療x射線(總劑量為14gy)交替治療小鼠14天(第7天到第20天)。放射治療時，除異種移植物區(qū)域以外，均采用鉛板覆蓋。每隔7天監(jiān)測異種移植瘤生長情況，腫瘤體積的計算公式如下：腫瘤體積＝0.52
×
寬度2×
長度。治
療5周后處死，取出腫瘤并進(jìn)行分析。結(jié)果如圖5所示。
[0106]
圖5結(jié)果證明，在放射處理后，pt33與放療聯(lián)合組腫瘤體積較生理鹽水與放療聯(lián)合組顯著減少，在治療后一周即出現(xiàn)差異，隨后pt33與放療聯(lián)合組和ns-x射線聯(lián)合組體積差異逐漸增大，說明pt33在極低劑量下即可在動物模型上顯著增強移植瘤的放療效果。
[0107]
實施例8pt33增強放療后dna損傷
[0108]
腫瘤細(xì)胞(3000個/孔)鋪板培養(yǎng)24小時后，用pt33(ht-29:25nm；hct116:10nm)處理12小時，然后用x射線照射腫瘤細(xì)胞(ht-29:12gy；hct116:6gy)。6小時后，用胰蛋白酶消化，用dna彗星測試試劑盒檢測dna拖尾情況，利用casp軟件計算彗尾長度。彗尾長度的增加表示dna損傷程度增加。結(jié)果如圖6所示。
[0109]
圖6顯示放射治療后會造成核dna損傷；pt33加入后，可明顯擴大放射所致的損傷效應(yīng)。
[0110]
實施例9pt33明顯延長dna修復(fù)的完成時間
[0111]
hct116腫瘤細(xì)胞(3000個/孔)鋪板培養(yǎng)24小時，用pt33(10nm)處理12小時后，x射線照射腫瘤細(xì)胞(6gy)，不同時間后，用蛋白免疫印跡(wb)觀察γ-h2ax的含量變化。結(jié)果如圖7所示。
[0112]
由圖7可知，pt33處理組明顯延長了γ-h2ax的消失時間。由于γ-h2ax是dna雙鏈斷裂(dsb)修復(fù)起始的關(guān)鍵標(biāo)志物，這一結(jié)果表明，pt33明顯延長了dna修復(fù)的完成時間，阻斷了修復(fù)進(jìn)程。
[0113]
實施例10pt33明顯延長γ-h2ax在dna的dsb位點聚集停留時間
[0114]
hct116腫瘤細(xì)胞實施如實施例8同樣處理，在設(shè)定的時間后，用相應(yīng)抗體進(jìn)行免疫熒光(if)顯色，結(jié)果見圖8。
[0115]
圖8顯示，放射治療后會γ-h2ax與dsb位點共定位在6小時左右存在，但12小時后，已經(jīng)不能明顯地觀察到γ-h2ax及其與dsb位點的共定位情況，說明γ-h2ax招募修復(fù)因子的功能在這一時間段內(nèi)完成；然而，pt33加入后，24小時后，仍然可以觀察到γ-h2ax及其與的共定位。由于γ-h2ax是dna dsb修復(fù)起始的關(guān)鍵標(biāo)志物，它在dsb位點的停留時間可以直接反映修復(fù)進(jìn)程，這一結(jié)果表明pt33顯著延長了γ-h2ax在dsb位點聚集停留時間，說明pt33抑制了dna修復(fù)過程。
[0116]
實施例11pt33阻斷dna同源重組修復(fù)酶rad51的入核，阻斷dna修復(fù)
[0117]
hct116腫瘤細(xì)胞實施如實施例8同樣處理，在設(shè)定的時間后，用rad51抗體進(jìn)行免疫熒光顯色，觀察rad51的入核情況，結(jié)果見圖9。
[0118]
圖9顯示，在不加pt33的細(xì)胞中，rad51在細(xì)胞核內(nèi)外均有分布，而加入pt33處理6小時后，核內(nèi)rad51含量顯著減少。由于rad51是同源重組修復(fù)的關(guān)鍵重組酶，它在核內(nèi)中的聚集分布依賴于上游dna損傷修復(fù)信號的傳遞，在下游端也能說明同源重組修復(fù)的正常進(jìn)行，這一結(jié)果說明，放射治療后會使rad51被招募到dsb位點進(jìn)行重組修復(fù)；但是pt33加入后，可明顯阻斷rad51入核，說明pt33抑制了rad51被招募的信號傳遞。
[0119]
實施例12pt33對放療作用下sting免疫通路的協(xié)同激活作用
[0120]
腫瘤細(xì)胞(10000個/孔)鋪板培養(yǎng)24小時，然后設(shè)置x射線治療組(4gy每隔24小時照射一次，共三次，每次4分鐘)、不同濃度pt33處理組以及聯(lián)合治療組，其中pt33提前給藥處理12小時。最后一次照射24小時后，用qpcr檢測干擾素β1的表達(dá)情況。
[0121]
結(jié)果見圖10，放射治療后會造成腎癌renca(圖10上部分圖，各試驗組左柱狀圖對應(yīng)ifnβ1，右柱狀圖對應(yīng)ip10)以及結(jié)腸癌ct26(圖10下部分圖)中dna的損傷，并輕微激活renca與ct26細(xì)胞中sting介導(dǎo)的ifnβ1以及其下游因子ip10的表達(dá)。而聯(lián)用pt33時，兩株細(xì)胞中ifnβ1以及其下游因子ip10的表達(dá)顯著增強。在renca細(xì)胞中，我們觀察到明確的濃度依賴性，當(dāng)放療與pt33(250nm)聯(lián)用后ifnβ1及ip10的表達(dá)分別增長58及40倍左右；在ct26細(xì)胞中，但當(dāng)放療與pt33(250nm)聯(lián)用后，ifnβ1及ip10的表達(dá)分別增長50及38倍左右。這一結(jié)果表明，在放療條件下，sting通路也可以被激活，同時被pt33進(jìn)一步增強。表明，pt33可在放療條件下提升ifnβ1及其下游因子ip10的表達(dá)，表現(xiàn)出優(yōu)良的協(xié)同促進(jìn)sting效應(yīng)通路的能力。為了進(jìn)一步證明pt33的活性與sting有關(guān)，我們將ct26腫瘤細(xì)胞中sting敲除后，進(jìn)行類似測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在sting被敲除的情況下，pt33的活性增強效應(yīng)消失(圖10下部分圖)，這表明pt33穩(wěn)定并增強sting效應(yīng)通路的活性是sting依賴的。
[0122]
實施例13pt33的體內(nèi)半衰期測試
[0123]
用雄性sd大鼠，每組三織，分別尾靜脈注射2mg/kg劑量的pt33以及前期已報道分子t83，分別按不同時間取血樣，用lc-ms檢測血液中化合物的含量，并計算其清除半衰期(t
1/2
)。發(fā)現(xiàn)pt33的t
1/2
為11.9小時，遠(yuǎn)高于t83的t
1/2
(2.4小時)，表明pt33比t83具有更優(yōu)良的體內(nèi)代謝穩(wěn)定性。
[0124]
最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。