背景技術(shù)：

1、在沒(méi)有專門(mén)的蛋白質(zhì)來(lái)促進(jìn)插入事件的情況下，目的核酸整合到基因組中的頻率較低且位點(diǎn)特異性極低。一些現(xiàn)有的方法，如crispr/cas9，更適合依賴宿主修復(fù)途徑的小型編輯，并且在整合較長(zhǎng)序列時(shí)效率較低。其他現(xiàn)有的方法如cre/loxp需要第一步先將loxp位點(diǎn)插入基因組中，然后第二步將目的序列插入loxp位點(diǎn)中。本領(lǐng)域需要改善的組合物(例如，蛋白質(zhì)和核酸)和方法，以在基因組中插入、改變、或缺失目的序列。

2、aatd的特點(diǎn)是aat的循環(huán)水平低。aat主要在肝細(xì)胞中產(chǎn)生并分泌到血液中，但它也由其他細(xì)胞類型產(chǎn)生，包括肺上皮細(xì)胞和某些白細(xì)胞。aat抑制炎癥細(xì)胞分泌的幾種絲氨酸蛋白酶(最顯著的是中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶[ne]、蛋白酶3和組織蛋白酶g)，從而保護(hù)器官(如肺)免受蛋白酶誘導(dǎo)的損害，尤其是在炎癥期間。

3、aat最常見(jiàn)的兩種臨床變體是e264v(pis)和e342k(piz)等位基因。臨床單核苷酸變體e342k(piz)導(dǎo)致aat蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和/或無(wú)活性，從而導(dǎo)致肝臟毒性和肺部無(wú)活性。遺傳方式為常染色體共顯性。超過(guò)一半的aatd患者至少攜帶一個(gè)突變e342k拷貝。

4、最常見(jiàn)與aatd相關(guān)的突變涉及編碼aat蛋白的serpina1基因中谷氨酸取代賴氨酸(e342k)。e342k突變位于aat蛋白的β片層和反應(yīng)中心環(huán)(rcl)之間的鉸鏈處，并導(dǎo)致環(huán)-片二聚體形成，該二聚體隨后可以延伸形成長(zhǎng)鏈環(huán)-片聚合物，這些聚合物在生物合成期間在肝細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rer)內(nèi)聚集aat-z蛋白。此突變(稱為z突變或z等位基因)導(dǎo)致翻譯蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，因此不會(huì)分泌到血液中。因此，z等位基因純合(pizz)個(gè)體的循環(huán)aat水平顯著降低；只有大約15％的突變z-aat蛋白正確折疊并被細(xì)胞分泌。z突變的另一個(gè)后果是與野生型蛋白相比，分泌的z-aat活性降低，該活性為正常抗蛋白酶活性的40％至80％(american?thoracic?society/european?respiratory?society[美國(guó)胸科協(xié)會(huì)/歐洲呼吸協(xié)會(huì)]，am?j?respir?crit?care?med.[美國(guó)呼吸與重癥監(jiān)護(hù)醫(yī)學(xué)雜志]2003；168(7)：818-900；和ogushi等人j?clin?invest.[臨床研究雜志]1987；80(5)：1366-74)。

5、有兩種疾病表型與pizz基因型相關(guān)。肝細(xì)胞內(nèi)聚合z-aat蛋白的積累會(huì)導(dǎo)致功能獲得性細(xì)胞毒性，從而可導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激、炎癥、纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌(hcc)和新生兒肝病(12％的患者)。這種積累可能會(huì)自行緩解，但對(duì)少數(shù)兒童來(lái)說(shuō)可能是致命的。功能喪失表型是由于aat的全身水平降低導(dǎo)致蛋白酶對(duì)下呼吸道結(jié)締組織的消化增加。結(jié)締組織和肺泡內(nèi)壁的過(guò)量蛋白酶消化會(huì)降低肺彈性和肺功能，導(dǎo)致肺氣腫，即慢性阻塞性肺病(copd)的標(biāo)志。這種影響在pizz個(gè)體中非常嚴(yán)重，并且典型地在中年時(shí)期顯現(xiàn)，導(dǎo)致生活質(zhì)量下降和壽命縮短(平均68歲)(tanash等人int?j?chron?obstruct?pulm?dis.[國(guó)際慢性阻塞性肺疾病雜志]2016；11：1663-9)。該影響對(duì)吸煙的pizz個(gè)體來(lái)說(shuō)更明顯，導(dǎo)致壽命進(jìn)一步縮短(58歲)。piitulainen和tanash，copd?2015；12(1)：36-41。pizz個(gè)體占臨床相關(guān)aatd肺病患者的大多數(shù)。

6、aatd的較輕微形式與其中z等位基因與s等位基因組合的sz基因型有關(guān)。s等位基因與循環(huán)aat水平略有降低有關(guān)，但不會(huì)引起肝細(xì)胞的細(xì)胞毒性。結(jié)果是臨床上顯著的肺病，但沒(méi)有肝病。fregonese和stolk，orphanet?j?rare?dis.[罕見(jiàn)病孤兒雜志]2008；33：16。與zz基因型一樣，sz基因型受試者的循環(huán)aat缺乏會(huì)導(dǎo)致蛋白酶活性不受調(diào)節(jié)，從而隨著時(shí)間的推移降解肺組織，并可能導(dǎo)致肺氣腫(尤其是在吸煙者中)。

7、雖然存在aatd的有限治療選擇，但目前尚無(wú)治愈方法。一小部分新生兒患者和晚期肝病患者接受肝移植。對(duì)于患有嚴(yán)重肺病或表現(xiàn)出發(fā)展嚴(yán)重肺病的跡象的aat缺乏個(gè)體，目前的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理是增強(qiáng)療法或蛋白質(zhì)替代療法。增強(qiáng)療法包括施用從匯集的供體血漿中純化的人aat蛋白濃縮物來(lái)增強(qiáng)缺失的aat。此治療包括每周輸注從健康血液供體純化的aat蛋白。盡管已經(jīng)證明血漿蛋白的輸注改善存活率或減緩肺氣腫進(jìn)展的速度，但在具有挑戰(zhàn)性的條件下(例如活動(dòng)性肺部感染)，增強(qiáng)療法通常是不夠的。增強(qiáng)療法也無(wú)法恢復(fù)患者aat的正常生理調(diào)節(jié)，且療效難以證明。此外，增強(qiáng)療法無(wú)法解決由z等位基因的毒性功能獲得引起的肝病。因此，需要新的、更有效的aatd治療方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本披露涉及用于體內(nèi)或體外改變宿主細(xì)胞、組織或受試者中一個(gè)或多個(gè)位置處的基因組的新型組合物、系統(tǒng)和方法。本披露提供了能夠調(diào)節(jié)(例如，插入、改變或缺失目的序列)α-1抗胰蛋白酶(aat)活性的基因修飾系統(tǒng)，以及通過(guò)施用一種或多種這樣的系統(tǒng)以改變單個(gè)核苷酸處的基因組序列來(lái)糾正導(dǎo)致α-1抗胰蛋白酶缺乏癥的serpina1piz突變來(lái)治療α-1抗胰蛋白酶缺乏癥(aatd)的方法。

2、一方面，本披露涉及一種用于修飾dna以糾正引起aatd的人serpina1基因突變的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含(a)編碼能夠靶向引發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄的基因修飾多肽的核酸，該多肽包含(i)逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域和(ii)結(jié)合dna并具有核酸內(nèi)切酶活性的cas9切口酶；和(b)模板rna，其包含(i)與人serpina1基因的第一部分互補(bǔ)的grna間隔子，(ii)結(jié)合該多肽的grna支架，(iii)包含突變區(qū)以糾正突變的異源對(duì)象序列，以及(iv)引物結(jié)合位點(diǎn)(pbs)序列，其包含與該模板rna的3′端處的靶dna鏈具有100％同源性的至少3、4、5、6、7或8個(gè)堿基。serpina1基因可能包含e342k突變(也稱為piz突變)。模板rna序列可以包含本文所述，例如表1、3、4、5、6a、6b、x2、x3、x3a、x5、或xx中的序列。

3、grna間隔子可以包含與模板rna的5’端處的靶dna具有100％同一性的至少15個(gè)堿基。模板rna可以進(jìn)一步包含pbs序列，該pbs序列包含與靶dna鏈具有至少80％同源性的至少5個(gè)堿基。模板rna可以包含一個(gè)或多個(gè)化學(xué)修飾。

4、基因修飾多肽的結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)肽接頭連接。該多肽可包含一個(gè)或多個(gè)肽接頭?；蛐揎椂嚯目梢赃M(jìn)一步包含核定位信號(hào)。該多肽可包含多于一個(gè)核定位信號(hào)，例如，多個(gè)相鄰的核定位信號(hào)或在該多肽的不同區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)核定位信號(hào)，例如，在該多肽的n末端中的一個(gè)或多個(gè)核定位信號(hào)以及在該多肽的c末端中的一個(gè)或多個(gè)核定位信號(hào)。編碼基因修飾多肽的核酸可以編碼一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含肽結(jié)構(gòu)域。

5、將該系統(tǒng)引入靶細(xì)胞可以導(dǎo)致插入至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500或1000個(gè)堿基對(duì)的外源dna。將該系統(tǒng)引入靶細(xì)胞可導(dǎo)致缺失，其中該缺失是該插入上游或下游的基因組dna的少于2、3、4、5、10、50或100個(gè)堿基對(duì)。將該系統(tǒng)引入靶細(xì)胞可導(dǎo)致取代，例如1、2或3個(gè)核苷酸(例如連續(xù)核苷酸)的取代。

6、異源對(duì)象序列可以是至少5、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600或700個(gè)堿基對(duì)。

7、一方面，本披露涉及一種藥物組合物，其包含上述系統(tǒng)和藥學(xué)上可接受的賦形劑或載劑，其中該藥學(xué)上可接受的賦形劑或載劑選自由以下組成的組：質(zhì)粒載體、病毒載體、囊泡和脂質(zhì)納米顆粒。一方面，本披露涉及一種藥物組合物，其包含上述系統(tǒng)和多種藥學(xué)上可接受的賦形劑或載劑，其中該藥學(xué)上可接受的賦形劑或載劑選自由以下組成的組：質(zhì)粒載體、病毒載體、囊泡和脂質(zhì)納米顆粒，例如，其中上述系統(tǒng)由兩種不同的賦形劑或載劑遞送，例如兩種脂質(zhì)納米顆粒、兩種病毒載體、或一種脂質(zhì)納米顆粒和一種病毒載體。該病毒載體可以是腺相關(guān)病毒(aav)。

8、一方面，本披露涉及一種宿主細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人細(xì)胞)，其包含上述系統(tǒng)。

9、一方面，本披露涉及一種糾正細(xì)胞、組織或受試者中人serpina1基因突變的方法，該方法包括向該細(xì)胞、組織或受試者施用上述系統(tǒng)，其中任選地，突變serpina1基因的糾正包括k342e的氨基酸取代(逆轉(zhuǎn)致病性取代e342k)。該系統(tǒng)可以體內(nèi)、體外、離體或原位引入。(a)的核酸可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中。在一些實(shí)施例中，(a)的核酸未整合到宿主細(xì)胞的基因組中。在一些實(shí)施例中，異源對(duì)象序列僅插入宿主細(xì)胞基因組中的一個(gè)靶位點(diǎn)。異源對(duì)象序列可以插入宿主細(xì)胞基因組中的兩個(gè)或更多個(gè)靶位點(diǎn)，例如，插入兩個(gè)同源染色體中的相同對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，或相同或不同染色體上的兩個(gè)不同位點(diǎn)。異源對(duì)象序列可以編碼哺乳動(dòng)物多肽或其片段或變體。該系統(tǒng)的組分可以在1、2、3、4或更多個(gè)不同的核酸分子上遞送?？梢酝ㄟ^(guò)電穿孔或通過(guò)使用選自質(zhì)粒載體、病毒載體、囊泡和脂質(zhì)納米顆粒的至少一種媒介物將該系統(tǒng)引入宿主細(xì)胞中。

10、這些組合物或方法的特征可包括以下列舉的實(shí)施例中的一個(gè)或多個(gè)。

11、列舉的實(shí)施例

12、1.一種模板rna，其例如從5’至3’包含：

13、(i)與人serpina1基因的第一部分互補(bǔ)的grna間隔子，其中該grna間隔子具有包含表1中g(shù)rna間隔子序列的核心核苷酸的序列，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該grna間隔子的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸(例如，包含與這些核心核苷酸相鄰的一個(gè)或多個(gè)側(cè)翼核苷酸)，或者其中該grna間隔子具有表6a、6b、x2、x3、x3a、x5、或xx中g(shù)rna間隔子的序列，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列；

14、(ii)結(jié)合基因修飾多肽(例如，結(jié)合該基因修飾多肽的cas結(jié)構(gòu)域)的grna支架，

15、(iii)異源對(duì)象序列，其包含突變區(qū)，以將突變引入該人serpina1基因的第二部分中(例如，以糾正該第二部分中的突變)(其中任選地該異源對(duì)象序列從5’至3’包含編輯后同源區(qū)、突變區(qū)和編輯前同源區(qū))，以及

16、(iv)引物結(jié)合位點(diǎn)(pbs)序列，其包含與該人serpina1基因的第三部分具有100％同一性的至少3、4、5、6、7或8個(gè)堿基。

17、2.如實(shí)施例1所述的模板rna，其中該異源對(duì)象序列包含表3中rt模板序列的核心核苷酸，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該rt模板序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸，或其中該異源對(duì)象序列包含表6a或6b中rt模板序列的序列。

18、3.如實(shí)施例1所述的模板rna，其中該異源對(duì)象序列包含對(duì)應(yīng)于該grna間隔子序列的表3中的rt模板序列的核心核苷酸，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該rt模板序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸(例如，包含與這些核心核苷酸相鄰的一個(gè)或多個(gè)側(cè)翼核苷酸)，或其中該異源對(duì)象序列包含表6a或6b中rt模板序列的序列。

19、4.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該異源對(duì)象序列具有來(lái)自表x3或x3a中所示的模板rna的異源對(duì)象序列的序列，或與其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列，或相對(duì)于其具有1、2、或3個(gè)取代的序列。

20、5.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該異源對(duì)象序列的長(zhǎng)度為6-16個(gè)核苷酸(例如，6、8、10、12、14、15、或16個(gè)核苷酸)。

21、6.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該pbs序列具有包含來(lái)自表3中與該rt模板序列同一行的pbs序列的核心核苷酸的序列，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該pbs序列的側(cè)翼核苷酸的5’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸(例如，包含與這些核心核苷酸相鄰的一個(gè)或多個(gè)側(cè)翼核苷酸)。

22、7.如實(shí)施例1-5中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該pbs序列具有包含對(duì)應(yīng)于該rt模板序列或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列、該grna間隔子序列或兩者的表3中的pbs序列的核心核苷酸的序列，并且任選地包含從該pbs序列的側(cè)翼核苷酸的5’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸，或其中該pbs序列具有包含對(duì)應(yīng)于該rt模板序列、該grna間隔子序列或兩者的表6a或6b中的pbs序列或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列的序列。

23、8.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該pbs序列具有來(lái)自表x3或x3a中所示的模板rna的pbs的序列，或與其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列，或相對(duì)于其具有1、2、或3個(gè)取代的序列。

24、9.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該pbs序列的長(zhǎng)度為8-12個(gè)核苷酸(例如，8、9、10、11、或12個(gè)核苷酸)。

25、10.如實(shí)施例1-9中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該grna支架包含表12中g(shù)rna支架的序列，或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

26、11.如實(shí)施例1-9中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該grna支架包含對(duì)應(yīng)于該rt模板序列、該grna間隔子序列、或兩者的表12中g(shù)rna支架的序列，或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

27、12.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該grna支架具有來(lái)自表x2、x3、或x3a中所示的模板rna的grna支架的序列，或與其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列。

28、13.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna，其包含表x2、x3、或x3a中所示的模板rna的序列，或與其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列。

29、14.一種模板rna，其例如從5’至3’包含：

30、(i)與人serpina1基因的第一部分互補(bǔ)的grna間隔子，

31、(ii)結(jié)合基因修飾多肽(例如，結(jié)合該基因修飾多肽的cas結(jié)構(gòu)域)的grna支架，

32、(iii)異源對(duì)象序列，其包含突變區(qū)，以將突變引入該人serpina1基因的第二部分(例如，以糾正該第二部分中的突變)，其中該異源對(duì)象序列包含表3中rt模板序列的核心核苷酸，或相對(duì)于其具有1、2、或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該rt模板序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸，或其中該異源對(duì)象序列包含表6a或6b的rt模板序列；以及

33、(iv)pbs序列，其包含與該人serpina1基因的第三部分具有100％同一性的至少3、4、5、6、7或8個(gè)堿基。

34、15.如實(shí)施例14所述的模板rna，其中該grna間隔子包含表1中g(shù)rna間隔子序列的核心核苷酸，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該grna間隔子序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸，或者其中該grna間隔子包含表6a或6b中的grna間隔子序列。

35、16.如實(shí)施例14所述的模板rna，其中該異源對(duì)象序列包含對(duì)應(yīng)于該rt模板序列的表1中的grna間隔子序列的核心核苷酸，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該grna間隔子序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸，或其中該異源對(duì)象序列包含表6a或6b的grna間隔子序列的核苷酸。

36、17.如實(shí)施例14-16中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該pbs序列具有包含來(lái)自表3中與該rt模板序列同一行的pbs序列的核心核苷酸的序列，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該pbs序列的側(cè)翼核苷酸的5’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

37、18.如實(shí)施例14-17中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該pbs序列具有包含對(duì)應(yīng)于該rt模板序列或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列、該grna間隔子序列或兩者的表3中的pbs序列的核心核苷酸的序列，并且任選地包含從該pbs序列的側(cè)翼核苷酸的5’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸，或其中該pbs序列具有包含對(duì)應(yīng)于該rt模板序列、該grna間隔子序列或兩者的表6a或6b中pbs序列的序列。

38、19.如實(shí)施例14-18中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該grna支架包含表6a或12中g(shù)rna支架的序列，或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

39、20.如實(shí)施例14-18中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該grna支架包含對(duì)應(yīng)于該rt模板序列、該grna間隔子序列、或兩者的表6a或12中g(shù)rna支架的序列，或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

40、21.一種用于修飾dna的基因修飾系統(tǒng)，其包含：

41、(a)第一rna，其從5’至3包含：(i)與人serpina1基因的第一部分互補(bǔ)的指導(dǎo)rna序列，其中該指導(dǎo)rna序列具有包含表1中間隔子序列的核心核苷酸的序列，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該指導(dǎo)rna序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸；以及(ii)結(jié)合基因修飾多肽(例如，結(jié)合該基因修飾多肽的cas結(jié)構(gòu)域)的序列(例如，支架區(qū))，以及

42、(b)第二rna，其包含：(iii)異源對(duì)象序列，其包含核苷酸取代以將突變引入該人serpina1基因的第二部分(其中任選地，該異源對(duì)象序列從5’至3’包含編輯后同源區(qū)、突變區(qū)和編輯前同源區(qū))；(iv)引物區(qū)，其包含與該人serpina1基因的第三部分具有100％同一性的至少5、6、7或8個(gè)堿基；以及(v)結(jié)合基因修飾蛋白的rrs(rna結(jié)合蛋白識(shí)別序列)。

43、22.如實(shí)施例21所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該異源對(duì)象序列包含表3中rt模板序列的核心核苷酸，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該rt模板序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

44、23.如實(shí)施例21所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該異源對(duì)象序列包含對(duì)應(yīng)于該grna間隔子序列的表3中的rt模板序列的核心核苷酸，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該rt模板序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

45、24.如實(shí)施例21-23中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該pbs序列具有包含來(lái)自表3中與該rt模板序列同一行的pbs序列的核心核苷酸的序列，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該pbs序列的側(cè)翼核苷酸的5’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

46、25.如實(shí)施例21-23中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該pbs序列具有包含對(duì)應(yīng)于該rt模板序列或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列、該grna間隔子序列或兩者的表3中的pbs序列的核心核苷酸的序列，并且任選地包含從該pbs序列的側(cè)翼核苷酸的5’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

47、26.如實(shí)施例21-25中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該grna支架包含表12中g(shù)rna支架的序列，或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

48、27.如實(shí)施例21-25中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該grna支架包含對(duì)應(yīng)于該rt模板序列、該grna間隔子序列、或兩者的表12中g(shù)rna支架的序列，或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

49、28.一種用于修飾dna的基因修飾系統(tǒng)，其包含：

50、(a)第一rna，其從5’至3包含：(i)與人serpina1基因的第一部分互補(bǔ)的指導(dǎo)rna序列，和(ii)結(jié)合基因修飾多肽(例如，結(jié)合該基因修飾多肽的cas結(jié)構(gòu)域)的序列(例如，支架區(qū))，以及

51、(b)第二rna，其包含：(iii)異源對(duì)象序列，其包含核苷酸取代，以將突變引入該人serpina1基因的第二部分，其中該異源對(duì)象序列包含表3中rt模板序列的核心核苷酸，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該rt模板序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸，和(iv)引物區(qū)，其包含與該人serpina1基因的第三部分具有100％同源性的至少5、6、7或8個(gè)堿基，以及(v)結(jié)合基因修飾蛋白的rrs(rna結(jié)合蛋白識(shí)別序列)。

52、29.如實(shí)施例28所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該grna間隔子包含表1中g(shù)rna間隔子序列的核心核苷酸，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該grna間隔子序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

53、30.如實(shí)施例28所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該異源對(duì)象序列包含對(duì)應(yīng)于該rt模板序列的表1中的grna間隔子序列的核心核苷酸，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該grna間隔子序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

54、31.如實(shí)施例28-30中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該pbs序列具有包含來(lái)自表3中與該rt模板序列同一行的pbs序列的核心核苷酸的序列，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該pbs序列的側(cè)翼核苷酸的5’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

55、32.如實(shí)施例28-30中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該pbs序列具有對(duì)應(yīng)于該rt模板序列、該grna間隔子序列、或兩者的表3中的pbs序列的核心核苷酸的序列，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該pbs序列的側(cè)翼核苷酸的5’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

56、33.如實(shí)施例28-32中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該grna支架包含表12中g(shù)rna支架的序列，或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

57、34.如實(shí)施例28-32中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該grna支架包含對(duì)應(yīng)于該rt模板序列、該grna間隔子序列、或兩者的表12中g(shù)rna支架的序列，或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

58、35.一種grna，其包含：(i)與人serpina1基因的第一部分互補(bǔ)的grna間隔子序列，其中該grna間隔子具有包含表1、表2、或表4中g(shù)rna間隔子序列的核心核苷酸的序列，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該grna間隔子序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸；以及(ii)grna支架。

59、36.如實(shí)施例35所述的grna，其中該grna支架包含表12中g(shù)rna支架的序列，或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

60、37.如實(shí)施例35所述的grna，其中該grna支架包含對(duì)應(yīng)于該grna間隔子序列的表12中的grna支架的序列，或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

61、38.一種模板rna，其包含：(iii)異源對(duì)象序列，其包含突變區(qū)，以將突變引入人serpina1基因的第二部分，其中該異源對(duì)象序列包含表3中rt模板序列的核心核苷酸，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該rt模板序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸，以及(iv)pbs序列，其包含與該人serpina1基因的第三部分具有100％同源性的至少5、6、7或8個(gè)堿基。

62、39.如實(shí)施例38所述的模板rna，其中該pbs序列具有包含來(lái)自表3中與該rt模板序列同一行的pbs序列的核心核苷酸的序列，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該pbs序列的側(cè)翼核苷酸的5’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

63、40.如實(shí)施例38所述的模板rna，其中該pbs序列具有包含對(duì)應(yīng)于該rt模板序列的表3中的pbs序列的核心核苷酸的序列，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且任選地包含從該pbs序列的側(cè)翼核苷酸的5’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

64、41.如實(shí)施例1-20或38-40中任一項(xiàng)所述的模板rna、如實(shí)施例21-34中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)、或如實(shí)施例35-37中任一項(xiàng)所述的grna，其中由該系統(tǒng)引入的突變是該serpina1基因的k342e突變(例如，以糾正致病性e342k突變)。

65、42.如實(shí)施例1-20或38-41中任一項(xiàng)所述的模板rna，或如實(shí)施例21-34或41中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該編輯前序列長(zhǎng)度包含約1個(gè)核苷酸至約35個(gè)核苷酸(例如，包含約1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30或30-35個(gè)核苷酸)。

66、43.如實(shí)施例1-20或38-42中任一項(xiàng)所述的模板rna，或如實(shí)施例21-34、41或42中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該突變區(qū)包含單核苷酸。

67、44.如實(shí)施例1-20或38-42中任一項(xiàng)所述的模板rna，或如實(shí)施例21-34、41、或42中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該突變區(qū)長(zhǎng)度為至少兩個(gè)核苷酸。

68、45.如實(shí)施例1-20、38-42或44中任一項(xiàng)所述的模板rna，或如實(shí)施例21-34、41、42或44中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該突變區(qū)長(zhǎng)度為高達(dá)32個(gè)(例如，高達(dá)5、10、15、20、25、30或32個(gè))核苷酸，并且相對(duì)于該人serpina1基因的第二部分包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)序列差異。

69、46.如實(shí)施例1-20、38-42、44或45中任一項(xiàng)所述的模板rna，或如實(shí)施例21-34、41、42、44或45中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該突變區(qū)相對(duì)于該人serpina1基因的第二部分包含兩個(gè)序列差異。

70、47.如實(shí)施例1-20、38-42或44-46中任一項(xiàng)所述的模板rna，或如實(shí)施例21-34、41、42或44-46中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該突變區(qū)包含設(shè)計(jì)用于糾正該serpina1基因中的致病性突變的第一區(qū)(例如，第一核苷酸)和設(shè)計(jì)用于滅活pam序列(例如，如表5中所述的“pam-殺滅”突變)的第二區(qū)(例如，第二核苷酸)。

71、48.如實(shí)施例1-20、38-46中任一項(xiàng)所述的模板rna，或如實(shí)施例21-34或41-46中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該突變區(qū)與該人serpina1基因的對(duì)應(yīng)部分包含小于80％、70％、60％、50％、40％或30％同一性。

72、49.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該模板rna包含一種或多種沉默突變(例如，沉默取代)，例如，如表7b中所例示的。

73、50.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna，其中該突變區(qū)包含設(shè)計(jì)用于糾正該serpina1基因中的致病性突變的第一區(qū)和設(shè)計(jì)用于引入沉默取代的第二區(qū)。

74、51.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna，其包含一個(gè)或多個(gè)化學(xué)修飾的核苷酸。

75、52.一種基因修飾系統(tǒng)，其包含：

76、如實(shí)施例1-20、38-42中任一項(xiàng)所述的模板rna，或如實(shí)施例21-34或41-46中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，以及

77、基因修飾多肽或編碼該基因修飾多肽的核酸(例如rna)。

78、53.如實(shí)施例52所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該基因修飾多肽包含：

79、逆轉(zhuǎn)錄酶(rt)結(jié)構(gòu)域(例如，來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒的rt結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的多肽結(jié)構(gòu)域)；和

80、與靶dna分子結(jié)合且與該rt結(jié)構(gòu)域異源的cas結(jié)構(gòu)域(例如，cas9結(jié)構(gòu)域)；以及

81、任選地，布置在該rt結(jié)構(gòu)域和該cas結(jié)構(gòu)域之間的接頭。

82、54.如實(shí)施例53所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該rt結(jié)構(gòu)域包含：

83、(a)表6的rt結(jié)構(gòu)域；或

84、(b)來(lái)自以下的rt結(jié)構(gòu)域：鼠白血病病毒(mmlv)、豬內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒(perv)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(avire)、貓白血病病毒(flv)、猿泡沫病毒(sfv)(例如sfv3l)、牛白血病病毒(blv)、梅森-菲合猴病毒(mpmv)、人泡沫病毒(hfv)、或牛泡沫/合胞病毒(bfv/bsv)。

85、55.如實(shí)施例53或54所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該cas結(jié)構(gòu)域包含表x1、xx、或x5的cas結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性的序列。

86、56.如實(shí)施例53-55中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該間隔子包含表xx的間隔子，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且該cas結(jié)構(gòu)域包含表xx中同一行的cas結(jié)構(gòu)域或與其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性的序列。

87、57.如實(shí)施例53-56中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該間隔子包含表xx的間隔子，并且該cas結(jié)構(gòu)域包含表xx中同一行的cas結(jié)構(gòu)域。

88、58.如實(shí)施例53-57中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該間隔子包含表x5的間隔子，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且該cas結(jié)構(gòu)域包含表x5中同一行的cas結(jié)構(gòu)域或與其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性的序列。

89、59.如實(shí)施例53-58中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該間隔子包含表x5的間隔子，并且該cas結(jié)構(gòu)域包含表x5中同一行的cas結(jié)構(gòu)域。

90、60.如實(shí)施例53-59中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該間隔子包含表6a的間隔子，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且該cas結(jié)構(gòu)域包含表6a中同一行的cas結(jié)構(gòu)域或與其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性的序列。

91、61.如實(shí)施例53-60中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該間隔子包含表6a的間隔子，并且該cas結(jié)構(gòu)域包含表6a中同一行的cas結(jié)構(gòu)域。

92、62.如實(shí)施例53-51中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該間隔子包含表6b的間隔子，或相對(duì)于其具有1、2或3個(gè)取代的序列，并且該cas結(jié)構(gòu)域包含表6b中同一行的cas結(jié)構(gòu)域或與其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性的序列。

93、63.如實(shí)施例53-62中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該間隔子包含表6b的間隔子，并且該cas結(jié)構(gòu)域包含表6b中同一行的cas結(jié)構(gòu)域。

94、64.如實(shí)施例53-63中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該cas結(jié)構(gòu)域包含表7或表8的cas結(jié)構(gòu)域。

95、65.如實(shí)施例53-64中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該cas結(jié)構(gòu)域：

96、(a)是cas9結(jié)構(gòu)域；

97、(b)是spcas9結(jié)構(gòu)域、blatcas9結(jié)構(gòu)域、nme2cas9結(jié)構(gòu)域、pnpcas9結(jié)構(gòu)域、saucas9結(jié)構(gòu)域、saucas9-kkh結(jié)構(gòu)域、sauricas9結(jié)構(gòu)域、sauricas9-kkh結(jié)構(gòu)域、scacas9-sc++-結(jié)構(gòu)域、spycas9結(jié)構(gòu)域、spycas9-ng結(jié)構(gòu)域、spycas9-spry結(jié)構(gòu)域或st1cas9結(jié)構(gòu)域；和/或

98、(c)是包含n670a突變、n611a突變、n605a突變、n580a突變、n588a突變、n872a突變、n863突變、n622a突變或h840a突變的cas9結(jié)構(gòu)域。

99、66.如實(shí)施例65所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該cas9結(jié)構(gòu)域結(jié)合表7或表12中列出的pam序列。

100、67.如實(shí)施例66所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該人serpina1基因的第二部分與該cas結(jié)構(gòu)域識(shí)別的pam重疊，例如，其中該人serpina1基因的第二部分在該pam內(nèi)或其中該pam在該人serpina1基因的第二部分內(nèi)。

101、68.如實(shí)施例53-67中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該grna間隔子是根據(jù)表1的grna間隔子，并且該cas結(jié)構(gòu)域包含表1同一行中列出的cas結(jié)構(gòu)域，或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。

102、69.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該模板rna包含表6a或6b中模板rna序列的序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。

103、70.如實(shí)施例53-69中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中：

104、(a)該模板rna包含表3中模板rna序列的序列；

105、(b)該cas結(jié)構(gòu)域包含表7或表8的cas結(jié)構(gòu)域；

106、(c)該接頭包含表10的接頭序列(例如seq?id?no：5217、5106、5190和5218中任一個(gè)的接頭序列)；并且

107、(d)該基因修飾多肽包含來(lái)自表11的一個(gè)或兩個(gè)nls序列(例如seq?id?no：5245、5290、5323、5330、5349、5350、5351和4001中任一個(gè)的nls序列)。

108、71.如實(shí)施例53-70中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其在該人serpina1基因的第一鏈中產(chǎn)生第一切口。

109、72.如實(shí)施例71所述的基因修飾系統(tǒng)，其進(jìn)一步包含第二鏈靶向性grna間隔子，該第二鏈靶向性grna間隔子將第二切口引導(dǎo)至該人serpina1基因的第二鏈。

110、73.如實(shí)施例72所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該第二鏈靶向性grna包含含有來(lái)自表2的左grna間隔子序列或右grna間隔子序列的核心核苷酸的序列，并且任選地包含從該左grna間隔子序列或右grna間隔子序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

111、74.如實(shí)施例72所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該第二鏈靶向性grna包含含有對(duì)應(yīng)于(i)的grna間隔子序列的表2中的左grna間隔子序列或右grna間隔子序列的核心核苷酸的序列，并且任選地包含從該左grna間隔子序列或右grna間隔子序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

112、75.如實(shí)施例72所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該第二鏈靶向性grna包含含有表4中第二切口grna序列的核心核苷酸的序列，或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且任選地包含從該第二切口grna序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

113、76.如實(shí)施例72所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該第二鏈靶向性grna包含含有對(duì)應(yīng)于(i)的grna間隔子序列的表4中的第二切口grna序列的核心核苷酸的序列，或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且任選地包含從該第二切口grna序列的側(cè)翼核苷酸的3’端開(kāi)始的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)核苷酸。

114、77.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該第二鏈靶向性grna與該基因修飾系統(tǒng)的模板rna具有“pam-在內(nèi)取向(pam-in?orientation)”，例如，如表4中所例示的。

115、78.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，該第二鏈靶向性grna靶向與該模板rna的靶突變重疊的序列。

116、79.如實(shí)施例78所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該第二鏈靶向性grna包含：

117、(i)與serpina1突變互補(bǔ)的序列(例如，間隔子序列)；

118、(ii)與靶基因座處的野生型序列互補(bǔ)的序列(例如，間隔子序列)；

119、(iii)與接近該靶基因座的snp、例如受試者(例如，患者)的基因組dna中包含的snp互補(bǔ)的序列(例如，間隔子序列)；

120、(iv)與接近該靶基因座的一個(gè)或多個(gè)沉默取代互補(bǔ)或包含該一個(gè)或多個(gè)沉默取代的序列(例如，間隔子序列)。

121、80.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna、基因修飾系統(tǒng)或grna，其中該grna間隔子包含該grna間隔子的約1、2、3或更多個(gè)側(cè)翼核苷酸。

122、81.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna或基因修飾系統(tǒng)，其中該異源對(duì)象序列包含該rt模板序列的約2、3、4、5、10、20、30、40或更多個(gè)側(cè)翼核苷酸。

123、82.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna或基因修飾系統(tǒng)，其中該異源對(duì)象序列包含約8-30、9-25、10-20、11-16、或12-15個(gè)(例如，約11-16個(gè))核苷酸。

124、83.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna或基因修飾系統(tǒng)，其中相對(duì)于該人serpina1基因的對(duì)應(yīng)部分，該突變區(qū)包含1、2或3個(gè)核苷酸位置的序列差異。

125、84.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna或基因修飾系統(tǒng)，其中相對(duì)于該人serpina1基因的對(duì)應(yīng)部分，該突變區(qū)包含至少2個(gè)核苷酸位置的序列差異。

126、85.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna或基因修飾系統(tǒng)，其中該編輯后同源區(qū)和/或編輯前同源區(qū)與該serpina1基因包含100％同一性。

127、86.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna或基因修飾系統(tǒng)，其中該pbs序列另外包含約1、2、3、4、5、6、7或更多個(gè)側(cè)翼核苷酸。

128、87.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna或基因修飾系統(tǒng)，其中該pbs序列包含約5-20、8-16、8-14、8-13、9-13、9-12或10-12個(gè)(例如，約9-12個(gè))核苷酸。

129、88.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna或基因修飾系統(tǒng)，其中該pbs序列在該serpina1基因切口位點(diǎn)的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸內(nèi)結(jié)合。

130、89.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該基因修飾多肽的結(jié)構(gòu)域通過(guò)肽接頭連接。

131、90.如實(shí)施例89所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該接頭包含表10的接頭序列(例如seqid?no：5217、5106、5190和5218中任一個(gè)的接頭序列)。

132、91.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該基因修飾多肽進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)核定位序列(nls)。

133、92.如實(shí)施例91所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該基因修飾多肽包含第一nls和第二nls。

134、93.如實(shí)施例91或92所述的基因修飾系統(tǒng)，其中該nls包含表11的nls序列(例如，seq?id?no：5245、5290、5323、5330、5349、5350、5351和4001中任一個(gè)的序列)。

135、94.一種模板rna，其包含表4中模板rna的序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。

136、95.一種模板rna，其包含表4中模板rna的序列。

137、96.一種基因修飾系統(tǒng)，其包含：

138、(i)模板rna，其包含表4中模板rna的序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列；以及

139、(ii)來(lái)自表4中與(i)同一行的第二切口grna序列，與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

140、97.一種基因修飾系統(tǒng)，其包含：

141、(i)模板rna，其包含表4中模板rna的序列；以及

142、(ii)來(lái)自表4中與(i)同一行的第二切口grna序列。

143、98.一種dna，其編碼如實(shí)施例1-20、38-48、80-88、94或95中任一項(xiàng)所述的模板rna，或如實(shí)施例35-37中任一項(xiàng)所述的grna。

144、99.一種藥物組合物，其包含如實(shí)施例52-93、96或97中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，或編碼該系統(tǒng)的一種或多種核酸，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑或載劑。

145、100.如實(shí)施例99所述的藥物組合物，其中該藥學(xué)上可接受的賦形劑或載劑選自由以下組成的組：質(zhì)粒載體、病毒載體、囊泡和脂質(zhì)納米顆粒。

146、101.如實(shí)施例100所述的藥物組合物，其中該病毒載體是腺相關(guān)病毒。

147、102.一種宿主細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人細(xì)胞)，其包含如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的模板rna或基因修飾系統(tǒng)。

148、103.一種制備如實(shí)施例1-20、38-48、80-88、94或953中任一項(xiàng)所述的模板rna的方法，該方法包括通過(guò)以下來(lái)合成該模板rna：通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄(例如固態(tài)合成)或通過(guò)在允許產(chǎn)生該模板rna的條件下將編碼該模板rna的dna引入宿主細(xì)胞。

149、104.一種用于修飾細(xì)胞中人serpina1基因中的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括使該細(xì)胞與如實(shí)施例52-93、96或97中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)或編碼該基因修飾系統(tǒng)的dna接觸，從而修飾細(xì)胞中該人serpina1基因中的靶位點(diǎn)。

150、105.一種用于修飾細(xì)胞中人serpina1基因中的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括使該細(xì)胞與以下接觸：(i)如實(shí)施例52-93、96或97中任一項(xiàng)所述的模板rna，或編碼其的dna；以及(ii)基因修飾多肽或編碼基因修飾多肽的核酸，從而修飾細(xì)胞中該人serpina1基因中的靶位點(diǎn)。

151、106.一種用于治療患有與人serpina1基因突變相關(guān)的疾病或病況的受試者的方法，該方法包括向該受試者施用如實(shí)施例52-93、96或97中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)或編碼該基因修飾系統(tǒng)的dna，從而治療該患有與人serpina1基因突變相關(guān)的疾病或病況的受試者。

152、107.一種用于治療患有與人serpina1基因突變相關(guān)的疾病或病況的受試者的方法，該方法包括向該受試者施用如實(shí)施例52-93、96或97中任一項(xiàng)所述的模板rna或編碼其的dna；以及(ii)基因修飾多肽或編碼基因修飾多肽的核酸，從而治療該患有與人serpina1基因突變相關(guān)的疾病或病況的受試者。

153、108.如實(shí)施例106或107所述的方法，其中該疾病或病況是α-1抗胰蛋白酶缺乏癥(aatd)。

154、109.如實(shí)施例106-108中任一項(xiàng)所述的方法，其中該受試者具有e342k突變(即，piz突變)。

155、110.一種用于治療患有aatd的受試者的方法，該方法包括向該受試者施用如實(shí)施例52-93、96或97中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)或編碼該基因修飾系統(tǒng)的dna，從而治療該患有aatd的受試者。

156、111.一種用于治療患有aatd的受試者的方法，該方法包括向該受試者施用(i)如實(shí)施例52-93、96或97中任一項(xiàng)所述的模板rna或編碼其的dna，以及(ii)基因修飾多肽或編碼基因修飾多肽的核酸，從而治療該患有aatd的受試者。

157、112.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)或方法，其中將該系統(tǒng)引入靶細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致該serpina1基因的致病性突變糾正。

158、113.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)或方法，其中該致病性突變是e342k突變，并且其中該糾正包括k342e的氨基酸取代。

159、114.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)或方法，其中該突變的糾正發(fā)生在至少30％(例如，30％、40％、50％、60％、70％或更多)的靶核酸中。

160、115.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)或方法，其中該突變的糾正發(fā)生在至少30％(例如，30％、40％、50％、60％、70％或更多)的靶細(xì)胞中。

161、116.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)或方法，其中該基因修飾系統(tǒng)包含第二鏈靶向性grna，并且其中相對(duì)于用包含模板rna而無(wú)第二鏈靶向性grna的基因修飾系統(tǒng)處理的靶細(xì)胞群體，靶細(xì)胞群體中突變的糾正增加。

162、117.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的基因修飾系統(tǒng)或方法，其中該模板rna包含一個(gè)或多個(gè)沉默取代(例如，如表7b中例示的)，并且其中相對(duì)于用包含不含有一個(gè)或多個(gè)沉默取代的模板rna的基因修飾系統(tǒng)處理的靶細(xì)胞群體，靶細(xì)胞群體中該突變的糾正增加。

163、118.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的方法，其中該細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人細(xì)胞。

164、119.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的方法，其中該受試者是人。

165、120.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的方法，其中該接觸離體發(fā)生，例如，其中該細(xì)胞或受試者的dna離體修飾。

166、121.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的方法，其中該接觸在體內(nèi)發(fā)生，例如，其中該細(xì)胞或受試者的dna在體內(nèi)修飾。

167、122.如前述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的方法，其中使該細(xì)胞或該受試者與該系統(tǒng)接觸包括在允許產(chǎn)生該基因修飾多肽的條件下使該細(xì)胞或該受試者體內(nèi)的細(xì)胞與編碼該基因修飾多肽的核酸(例如dna或rna)接觸。