背景技術：

1、來自原核成簇、規(guī)則間隔短回文重復序列(crispr)和crispr相關蛋白(crispr-cas)系統(tǒng)的酶已經(jīng)被用作可重編程且高度特異性的基因組編輯工具，以用于真核生物。除了基因組編輯和切割外，crispr-cas9還可用于將效應子分子定位到基因組上的特定位點，從而允許通過各種機制進行遺傳和表觀遺傳調控以及轉錄調節(jié)。

2、然而，不同的基因組和基因組靶標需要多種工具來進行有效的基因工程化，并且仍然需要通過發(fā)現(xiàn)能夠識別和靶向不同序列的新型cas蛋白并對其進行工程化來擴展crispr工具箱。

3、雖然crispr-cas9系統(tǒng)可用于敲除基因或修改基因的表達，但某些類型的基因編輯需要對靶基因進行精確修飾，例如編輯基因內的單個堿基。這種精確修飾仍然是一個挑戰(zhàn)，并且需要多樣化的基因編輯工具包來實現(xiàn)多種靶基因的精確基因組修飾。

技術實現(xiàn)思路

1、對獨特原間隔相鄰基序(pam)具有特異性的新型cas9酶的識別允許擴展基因編輯的可用工具。除其他外，本發(fā)明提供了從以下項中分離的工程化的、非天然存在的新型cas9酶：馬鏈球菌atcc?33317、海氏腸球菌菌株f1129e、馬鏈球菌菌株ag46、擬葡萄球菌菌株19、中間鏈球菌b196菌株g1552、血鏈球菌sk330、鏈球菌屬c150、口腔鏈球菌亞種口腔菌株rh_1735_08、口腔鏈球菌sk313、沃氏葡萄球菌菌株691、松鼠葡萄球菌菌株snuc?2430、解沒食子酸鏈球菌菌株am24-4、庫拉堡乳桿菌菌株biut2和豬鏈球菌菌株lss83。

2、本發(fā)明部分地基于以下驚人發(fā)現(xiàn)：從不同細菌中發(fā)現(xiàn)的識別特定pam序列的新型cas9酶可以被工程化以用于在真核細胞(例如，人、植物等)中表達。因此，所描述的cas9酶及其變體在真核生物中具有功能。此處提供的實例顯示了在具有不同的pam識別序列的人類細胞中使用工程化的非天然cas9酶來靶向不同的基因組位點。例如，由馬鏈球菌atcc33317工程化的cas9識別共有pam序列5'-nrgnr-3'，由海氏腸球菌菌株f1129e工程化的cas9識別共有pam序列5'-nrg-3'，由馬鏈球菌ag46、沃氏葡萄球菌菌株691和松鼠葡萄球菌菌株snuc?2430工程化的cas9識別共有pam序列5'-nngr-3'，由擬葡萄球菌菌株19工程化的cas9識別共有pam序列5'-nngrrt-3'，由中間鏈球菌b196菌株g1552工程化的cas9識別共有pam序列5'-nnaaaa-3'，由血鏈球菌sk330工程化的cas9識別共有pam序列5'-nggng-3'，由鏈球菌屬c150工程化的cas9識別共有pam序列5'-nngnrg-3'，由口腔鏈球菌亞種口腔菌株rh_1735_08工程化的cas9識別共有pam序列5'-nnaaac-3'，由口腔鏈球菌sk313工程化的cas9識別共有pam序列5'-nnraag-3'，由解沒食子酸鏈球菌菌株am24-4工程化的cas9識別共有pam序列5'-nnayaa-3'，由庫拉堡乳桿菌菌株biut2工程化的cas9識別共有pam序列5'-nngaaa-3'，以及由豬鏈球菌菌株工程化的cas9識別共有pam序列5'-nnaaa-3'(h＝a、c或t；r＝a或g)。

3、在一方面中，本文提供了一種工程化的、非天然存在的cas9蛋白，其由以下項修飾：馬鏈球菌atcc?33317cas9、海氏腸球菌菌株f1129e?cas9、馬鏈球菌菌株ag46cas9、擬葡萄球菌菌株19cas9、中間鏈球菌b196菌株g1552、血鏈球菌sk330?cas9、鏈球菌屬c150cas9、口腔鏈球菌亞種口腔菌株rh_1735_08cas9、口腔鏈球菌sk313cas9、沃氏葡萄球菌菌株691cas9、松鼠葡萄球菌菌株snuc?2430?cas9、解沒食子酸鏈球菌菌株am24-4?cas9、庫拉堡乳桿菌菌株biut2?cas9和豬鏈球菌菌株lss83?cas9。

4、在一些實施例中，馬鏈球菌atcc?33317cas9蛋白與以下項具有至少80％序列同一性

5、

6、

7、在一些實施例中，海氏腸球菌菌株f1129e?cas9蛋白與以下項具有至少80％序列同一性

8、

9、

10、在一些實施例中，馬鏈球菌菌株ag46?cas9蛋白與以下項具有至少80％序列同一性

11、

12、在一些實施例中，擬葡萄球菌菌株19cas9蛋白與以下項具有至少80％序列同一性

13、

14、

15、在一些實施例中，中間鏈球菌b196菌株g1552?cas9蛋白與以下項具有至少80％序列同一性

16、

17、在一些實施方案中，血鏈球菌sk330?cas9蛋白與以下項具有至少80％序列同一性

18、

19、

20、在一些實施例中，所述鏈球菌屬c150?cas9蛋白與以下項具有至少80％序列同一性

21、

22、

23、在一些實施例中，所述口腔鏈球菌亞種口腔菌株rh_1735_08cas9蛋白與以下項具有至少80％序列同一性

24、

25、在一些實施例中，口腔鏈球菌sk313?cas9蛋白與以下項具有至少80％序列同一性

26、

27、

28、在一些實施例中，沃氏葡萄球菌菌株691cas9蛋白與以下項具有至少80％序列同一性

29、

30、在一些實施例中，松鼠葡萄球菌菌株snuc?2430?cas9蛋白與以下項具有至少80％序列同一性

31、

32、

33、在一些實施例中，解沒食子酸鏈球菌菌株am24-4?cas9蛋白與以下項具有至少80％序列同一性

34、

35、在一些實施例中，庫拉堡乳桿菌菌株biut2?cas9蛋白與以下項具有至少80％序列同一性

36、

37、

38、在一些實施例中，豬鏈球菌菌株lss83?cas9蛋白與以下項具有至少80％序列同一性

39、

40、

41、在一些實施例中，該cas9蛋白包含與seq?id?no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。

42、在一些實施例中，cas9蛋白進一步包含核定位序列(nls)和/或flag、his或ha標簽。

43、在一些實施例中，馬鏈球菌atcc?33317cas9(seq2cas9)具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

44、

45、

46、在一些實施例中，海氏腸球菌菌株f1129e?cas9(ehicas9)具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

47、

48、(d10a突變，粗體下劃線斜體)

49、在一些實施例中，馬鏈球菌菌株ag46(seqcas9)具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

50、

51、

52、在一些實施例中，擬葡萄球菌菌株19(ssicas9)具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

53、

54、

55、在一些實施例中，中間鏈球菌b196菌株g1552(sincas9)具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

56、

57、在一些實施例中，血鏈球菌sk330?cas9具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

58、

59、

60、在一些實施例中，鏈球菌屬c150?cas9具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

61、

62、在一些實施例中，口腔鏈球菌亞種口腔菌株rh_1735_08cas9具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

63、

64、在一些實施例中，口腔鏈球菌sk313?cas9具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

65、

66、

67、在一些實施例中，口腔鏈球菌sk313?cas9具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

68、

69、在一些實施例中，沃氏葡萄球菌菌株691cas9具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

70、

71、

72、在一些實施例中，解沒食子酸鏈球菌菌株am24-4?cas9具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

73、

74、在一些實施例中，庫拉堡乳桿菌菌株biut2?cas9具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

75、

76、在一些實施例中，豬鏈球菌菌株lss83?cas9具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

77、

78、

79、在一些實施例中，cas9蛋白的氨基酸序列包含seq?id?no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少10個突變。

80、在一些實施例中，突變是氨基酸取代。

81、在一些實施例中，cas9蛋白具有切口酶活性。

82、在一些實施例中，至少一個突變產(chǎn)生失活cas9(dcas9)。

83、在一些實施例中，cas9蛋白包含pam相互作用結構域、hnh和/或ruvc結構域中的至少一個氨基酸突變。

84、在一些實施例中，cas9蛋白進一步包含核定位序列(nls)和/或flag、his或ha標簽。

85、在一個方面中，本文提供了一種工程化的、非天然存在的cas9融合蛋白，其包含與seq?id?no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14具有至少80％同一性的cas9蛋白，并且其中該cas9蛋白融合至組蛋白去甲基化酶、轉錄激活劑或融合至脫氨酶。

86、在一些實施例中，cas9蛋白融合至胞嘧啶脫氨酶或融合至腺苷脫氨酶。

87、在一些實施例中，cas9蛋白融合至腺苷脫氨酶并且具有與以下項至少80％相同的氨基酸序列

88、(a)

89、

90、

91、

92、

93、

94、

95、

96、

97、

98、

99、

100、在一些實施例中，cas9蛋白融合至胞嘧啶脫氨酶。

101、在一些實施例中，馬鏈球菌atcc?33317cas9蛋白識別包含5'-nrgnr-3'的pam共有序列。

102、在一些實施例中，海氏腸球菌菌株f1129e識別包含5'-nrg-3'的pam共有序列在一些實施例中，馬鏈球菌菌株ag46識別包含5'-nngr-3'的pam共有序列。

103、在一些實施例中，沃氏葡萄球菌菌株691識別包含5'-nngr-3'的pam共有序列。

104、在一些實施例中，松鼠葡萄球菌菌株snuc?2430識別包含5'-nngr-3'的pam共有序列。

105、在一些實施例中，擬葡萄球菌菌株19識別包含5'-nngrrt-3'的pam共有序列。

106、在一些實施例中,中間鏈球菌b196菌株g1552識別包含5'-nnaaaa-3'的共有pam序列。

107、在一些實施例中，血鏈球菌sk330識別包含5'-nggng-3'的共有pam序列。

108、在一些實施例中，鏈球菌屬c150識別包含5'-nngnrg-3'的共有pam序列。

109、在一些實施例中，口腔鏈球菌亞種口腔菌株rh_1735_08識別包含5'-nnaaac-3'的共有pam序列。

110、在一些實施例中，口腔鏈球菌sk313識別包含5'-nnraag-3'的共有pam序列。

111、在一些實施例中,解沒食子鏈球菌菌株am24-4識別包含5'-nnayaa-3'的共有pam序列。

112、在一些實施例中，庫拉堡乳桿菌菌株biut2識別包含5'-nngaaa-3'的共有pam序列。

113、在一些實施例中，豬鏈球菌菌株識別包含5'-nnaaa-3'的共有pam序列(h＝a、c或t；r＝a或g)。

114、在一些實施例中，提供了編碼cas9蛋白的核酸。

115、在一些實施例中，核酸經(jīng)過密碼子優(yōu)化以用于在哺乳動物細胞中表達。

116、在一些實施例中，核酸經(jīng)過密碼子優(yōu)化以用于在人細胞中表達。

117、在一些實施例中，提供了包含cas9蛋白的真核細胞。

118、在一些實施例中，細胞是人細胞。在一些實施例中，細胞是植物細胞。

119、在一個方面中，本發(fā)明提供了一種切割真核細胞中的靶核酸的方法，該方法包括：使細胞與本文所述的cas9以及rna向導或編碼rna向導的核酸接觸，其中rna向導包含能夠與靶核酸雜交的正序重復序列和間隔序列，并且其中cas9蛋白能夠結合至rna向導并引起與rna向導互補的靶核酸序列中的斷裂。

120、在一個方面中，本發(fā)明提供了一種改變真核細胞中的靶核酸表達的方法，該方法包括：使細胞與本文所述的cas9以及rna向導或編碼rna向導的核酸接觸，其中rna向導包含能夠與靶核酸雜交的正序重復序列和間隔序列，并且其中cas9蛋白能夠結合至rna向導并引起與rna向導互補的靶核酸序列中的斷裂。

121、在一個方面中，本發(fā)明提供了一種改變真核細胞中的靶核酸表達的方法，該方法包括：使細胞與本文所述的cas9以及rna向導或編碼rna向導的核酸接觸，其中rna向導包含能夠與靶核酸雜交的正序重復序列和間隔序列，并且其中cas9蛋白能夠結合至rna向導并編輯與rna向導互補的靶核酸序列。

122、在一個方面中，本發(fā)明提供了一種修飾真核細胞中的靶核酸的方法，該方法包括：使細胞與本文所述的cas9以及rna向導或編碼rna向導的核酸接觸，其中rna向導包含能夠與靶核酸雜交的正序重復序列和間隔序列，并且其中cas9蛋白能夠結合至rna向導并編輯與rna向導互補的靶核酸序列。

123、在一些實施例中，cas9蛋白是失活cas9(dcas9)。

124、在一些實施例中，dcas9融合至脫氨酶。

125、在一些實施例中，rna向導包括crrna和tracrrna。

126、在一些實施例中，rna向導包含sgrna。

127、在一些實施例中，與seq2cas9一起使用的sgrna包含支架，該支架包含與

128、

129、具有至少80％同一性的序列。

130、在一些實施例中，與ehicas9一起使用的sgrna包含支架，該支架包含與

131、

132、具有至少80％同一性的序列。

133、在一些實施例中，與seqcas9一起使用的sgrna包含支架，該支架包含與

134、

135、具有至少80％同一性的序列。

136、在一些實施例中，與ssicas9一起使用的sgrna包含支架，該支架包含與

137、

138、具有至少80％同一性的序列。

139、在一些實施例中，與sincas9一起使用的sgrna包含支架，該支架包含與5'-

140、

141、有至少80％同一性的序列。

142、在一些實施例中，與ssacas9一起使用的sgrna包含支架，該支架包含與

143、

144、具有至少80％同一性的序列。

145、在一些實施例中，與ssc2cas9一起使用的sgrna包含支架，該支架包含與

146、

147、具有至少80％同一性的序列。

148、在一些實施例中，與sor2cas9一起使用的sgrna包含支架，該支架包含與

149、

150、具有至少80％同一性的序列。

151、在一些實施例中，與sorcas9一起使用的sgrna包含支架，該支架包含與

152、

153、id?no:51)具有至少80％同一性的序列。

154、在一些實施例中，與swacas9一起使用的sgrna包含支架，該支架包含與

155、

156、具有至少80％同一性的序列。

157、在一些實施例中，與ssccas9一起使用的sgrna包含支架，該支架包含與

158、

159、具有至少80％同一性的序列。

160、在一些實施例中，與sgacas9一起使用的sgrna包含支架，該支架包含與5'-

161、

162、具有至少80％同一性的序列。

163、在一些實施例中，與lkucas9一起使用的sgrna包含支架，該支架包含與

164、

165、具有至少80％同一性的序列。

166、在一些實施例中，與ssucas9一起使用的sgrna包含支架，該支架包含與5'-

167、

168、56)具有至少80％同一性的序列。

169、在前述實施例中，對于seq?id?no?43-56：正向重復(斜體和下劃線)、四環(huán)(斜體)、tracrrna(下劃線)

170、在一些實施例中，crrna包含介于16個核苷酸長與26個核苷酸長之間的向導序列。

171、在一些實施例中，crrna包含介于18個核苷酸長與24個核苷酸長之間的向導序列。

172、在一些實施例中，靶核酸中的斷裂是單鏈的或雙鏈的斷裂。

173、在一些實施例中，靶核酸中的斷裂是單鏈的斷裂。

174、在一些實施例中，cas9蛋白是切割靶核酸序列的兩條鏈的核酸酶。在一些實施例中，cas9是切割靶核酸序列的一條鏈的切口酶。

175、在一些實施例中，靶核酸是5'到原間隔相鄰基序(pam)序列。

176、在一些實施例中，cas9可操作地連接至用于在真核細胞中表達的啟動子序列，并且其中向導rna可操作地連接至用于在真核細胞中表達的啟動子序列。

177、在一些實施例中，真核細胞是人細胞。

178、在一些實施例中，啟動子序列是真核啟動子或病毒啟動子。

179、在一個方面中，本文提供了一種工程化的、非天然存在的crispr-cas系統(tǒng)，其包含：rna向導或編碼該rna向導的核酸，其中該rna向導包含能夠與靶核酸雜交的正序重復序列和間隔序列；以及與seq?id?no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14具有至少80％序列同一性的經(jīng)密碼子優(yōu)化的crispr相關(cas)蛋白，并且其中cas蛋白能夠結合至rna向導并引起與rna向導互補的靶核酸序列中的斷裂。

180、在一個方面中，本文提供了一種工程化的、非天然存在的crispr-cas系統(tǒng)，其包含：rna向導或編碼該rna向導的核酸，其中該rna向導包含能夠與靶核酸雜交的正序重復序列和間隔序列；以及與seq?id?no:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14具有至少80％序列同一性的經(jīng)密碼子優(yōu)化的crispr相關(cas)蛋白；其中cas蛋白融合至脫氨酶，并且其中cas蛋白融合物能夠結合至rna向導并編輯與rna向導互補的靶核酸序列。

181、在一個實施例中，cas9蛋白是失活cas9(dcas9)。

182、在一個實施例中，rna向導包含crrna和tracrrna。

183、在一個實施例中，rna向導包含sgrna。

184、在一個實施例中，cas蛋白可操作地連接至用于在真核細胞中表達的啟動子序列，并且其中向導rna可操作地連接至用于在真核細胞中表達的啟動子序列。

185、在一些實施例中，真核細胞是人類細胞。

186、在一個實施例中，啟動子序列是真核啟動子序列。

187、在一個實施例中，提供了編碼本文所述系統(tǒng)的核酸。

188、在一個實施例中，提供了包含本文所述系統(tǒng)的載體。

189、在一個實施例中，載體是質粒載體或病毒載體。

190、在一個實施例中，病毒載體是腺相關病毒(aav)載體或慢病毒載體。

191、在一些實施例中，病毒載體是aav載體。

192、在一個實施例中，使用多于一種aav載體來包裝系統(tǒng)。

193、在一個實施例中，治療有此需要的受試者中的疾患或疾病的方法包括向受試者施用本文所述的系統(tǒng)，其中向導rna與靶核酸的至少10個核苷酸互補，該靶核酸與病癥或疾病相關；其中cas蛋白與向導rna締合；其中向導rna結合至靶核酸；其中cas蛋白引起靶核酸中的斷裂，任選地其中cas9是融合至脫氨酶的失活cas9(dcas9)并導致靶核酸中的一個或多個堿基編輯，從而治療疾患或疾病。

194、在一些實施例中，向導rna與約18個至24個核苷酸互補。

195、在一些實施例中，向導rna與20個核苷酸互補。

196、在一些實施例中，堿基編輯器包含融合蛋白。

197、在一些實施例中，堿基編輯器包含腺苷脫氨酶結構域或胞苷脫氨酶結構域。

198、在一些實施例中，本文提供了一種編輯多核苷酸的核堿基的方法，該方法包括使多核苷酸與堿基接觸，該堿基與一種或多種向導rna復合，其中堿基編輯器包含腺苷脫氨酶結構域，并且其中一種或多種向導rna靶向堿基編輯器以實現(xiàn)多核苷酸中的a·t到g·c改變。

199、在一些實施例中，本文提供了一種編輯多核苷酸的核堿基的方法，該方法包括使多核苷酸與堿基編輯器接觸，該堿基編輯器與一種或多種向導rna復合，其中堿基編輯器包含胞苷脫氨酶結構域，并且其中一種或多種向導rna靶向堿基編輯器以實現(xiàn)多核苷酸中c·g到t·a改變。

200、在一些實施例中，編輯導致靶多核苷酸序列中小于50％的插入缺失的形成。

201、在一些實施例中，編輯產(chǎn)生點突變。

202、定義

203、為了更容易理解本發(fā)明，下面首先定義某些術語。用于以下術語和其它術語的另外的定義在整個說明書中闡述。

204、冠詞“一個”和“一種”在本文中指代冠詞的一個/種或多于一個/種(即，至少一個/種)語法賓語。舉例來說，“要素”意指一個要素或多于一個要素。

205、大約(approximately)或約(about)：如本文中所用的術語“大約”或“約”在應用于所關注的一個或多個值時是指與所述參考值類似的值。在某些實施方案中，術語“大約”或“約”是指處于在任一方向上(大于或小于)所述參考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的值的范圍，除非另有說明或從上下文可以明顯看出(除非該數(shù)字將超過一個可能的值的100％)。

206、關聯(lián)(associated?with)：如果一個事件或實體的存在、水平和/或形式與另一個事件或實體的存在、水平和/或形式有關，則兩個事件或實體彼此“相關”，如該術語在本文所使用。例如，如果特定實體(例如，多肽)的存在、水平和/或形式與疾病、疾患或病癥的發(fā)病率和/或易感性有關(例如，跨相關群體)，則所述特定實體被認為與特定疾病、疾患或病癥相關。在一些實施例中，如果兩個或更多個實體直接或間接相互作用，使得其在物理上彼此接近和保持彼此接近，則其在物理上彼此“締合”。在一些實施例中，彼此物理關聯(lián)的兩個或更多個實體彼此共價連接；在一些實施例中，在彼此物理關聯(lián)的兩個或更多個實體彼此不共價連接，而是非共價關聯(lián)，例如，借助于氫鍵、范德華力相互相用(van?der?waalsinteraction)、疏水性相互作用、磁性和它們的組合。

207、堿基編輯器：“堿基編輯器(be)”或“核堿基編輯器(nbe)”意指結合多核苷酸并具有核堿基修飾活性的藥劑。在各個實施例中，堿基編輯器包括核堿基修飾多肽(例如，脫氨酶)和多核苷酸可編程核苷酸結合結構域以及向導多核苷酸(例如，向導rna)。在各個實施例中，藥劑是生物分子復合物，該生物分子復合物包括具有堿基編輯活性的蛋白質結構域，即，能夠修飾核酸分子(例如，dna)內的堿基(例如，a、t、c、g或u)的結構域。在一些實施例中，多核苷酸可編程dna結合結構域融合或連接至脫氨酶結構域。在一個實施例中，藥劑是包括一個或多個具有堿基編輯活性的結構域的融合蛋白。在另一個實施例中，具有堿基編輯活性的蛋白質結構域與向導rna連接(例如，通過向導rna上的rna結合基序和融合至脫氨酶的rna結合結構域)。在一些實施例中，具有堿基編輯活性的結構域能夠使核酸分子內的堿基脫氨基。在一些實施例中，堿基編輯器能夠使dna分子內的一個或多個堿基脫氨基。在一些實施例中，堿基編輯器能夠使dna內的胞嘧啶(c)或腺苷(a)脫氨基。在一些實施例中，堿基編輯器能夠使dna內的胞嘧啶(c)和腺苷(a)脫氨基。在一些實施例中，堿基編輯器是胞苷堿基編輯器(cbe)。在一些實施例中，堿基編輯器是腺苷堿基編輯器(abe)。在一些實施例中，堿基編輯器是腺苷堿基編輯器(abe)和胞苷堿基編輯器(cbe)。在一些實施例中，堿基編輯器為融合至腺苷脫氨酶的無核酸酶活性的cas9(dcas9)。在一些實施例中，堿基編輯器融合至堿基切除修復抑制劑(例如ugi結構域或disn結構域)。在一些實施例中，融合蛋白包括融合至脫氨酶的cas9切口酶和堿基切除修復抑制劑，如ugi或disn結構域。在其它實施例中，堿基編輯器是無堿基堿基編輯器。堿基編輯器的細節(jié)在國際pct申請第pct/2017/045381號(wo2018/027078)和第pct/us2016/058344號(wo2017/070632)中進行了描述，這些申請中的每一個都通過引用整體并入本文。另請參見komor,a.c.等人,“programmableediting?of?a?target?base?in?genomic?dna?without?double-stranded?dna?cleavage”nature?533,420-424(2016)；gaudelli,n.m.等人,“programmable?base?editing?of?a·tto?g·c?in?genomic?dna?without?dna?cleavage”nature?551,464-471(2017)；komor,a.c.等人,“improved?base?excision?repair?inhibition?and?bacteriophage?mu?gamprotein?yields?c:g-to-t:a?base?editors?with?higher?efficiency?and?productpurity”science?advances3:eaao4774(2017)以及rees,h.a.等人,“base?editing:precision?chemistry?on?the?genome?and?transcriptome?of?living?cells.”nat?revgenet.2018年12月；19(12):770-788.doi:10.1038/s41576-018-0059-1，這些文獻的全部內容特此通過引用并入本文。

208、堿基編輯活性：“堿基編輯活性”意指對多核苷酸內的堿基進行化學改變。在一個實施例中，第一堿基轉化為第二堿基。在一個實施例中，堿基編輯活性是胞苷脫氨酶活性，例如，將靶c·g轉化為t·a。在另一實施例中，堿基編輯活性是腺苷或腺嘌呤脫氨酶活性，例如，將a·t轉化為g·c。在另一實施例中，堿基編輯活性是胞嘧啶或胞苷脫氨酶活性，例如，將靶c·g轉化為t·a，以及腺苷或腺嘌呤脫氨酶活性，例如，將a·t轉化為g·c。

209、堿基編輯器系統(tǒng)：術語“堿基編輯器系統(tǒng)”是指用于編輯靶核苷酸序列的核堿基的系統(tǒng)。在各種實施例中，堿基編輯器(be)系統(tǒng)包含(1)多核苷酸可編程核苷酸結合結構域(例如，cas9)、脫氨酶結構域和胞苷脫氨酶結構域，其用于使靶核苷酸序列中的核堿基脫氨基；以及(2)與多核苷酸可編程核苷酸結合結構域結合的一種或多種向導多核苷酸(例如，向導rna)。在各個實施例中，堿基編輯器(be)系統(tǒng)包括選自腺苷脫氨酶或胞苷脫氨酶的核堿基編輯器結構域，以及具有核酸序列特異性結合活性的結構域。在一些實施例中，堿基編輯器系統(tǒng)包括(1)堿基編輯器(be)，該堿基編輯器包括多核苷酸可編程dna結合結構域和脫氨酶結構域，其用于將靶核苷酸序列中的一個或多個核堿基脫氨基；以及(2)與多核苷酸可編程dna結合結構域結合的一種或多種向導rna。在一些實施例中，多核苷酸可編程核苷酸結合結構域是多核苷酸可編程dna結合結構域。在一些實施例中，堿基編輯器是胞苷堿基編輯器(cbe)。在一些實施例中，堿基編輯器是腺嘌呤或腺苷堿基編輯器(abe)。在一些實施例中，堿基編輯器是腺嘌呤或腺苷堿基編輯器(abe)或胞苷堿基編輯器(cbe)。

210、在一些實施例中，多核苷酸可編程核苷酸結合結構域可以通過與脫氨酶結構域非共價相互作用或締合而將脫氨酶結構域靶向至靶核苷酸序列。例如，在一些實施例中，核堿基編輯組分(例如，脫氨酶組分)可以包含能夠與為多核苷酸可編程核苷酸結合結構域的一部分的另外的異源部分或結構域相互作用、締合或能夠形成復合物的另外的異源部分或結構域。在一些實施例中，另外的異源部分能夠結合至多肽、與多肽相互作用、締合或形成復合物。在一些實施例中，另外的異源部分能夠結合至多核苷酸、與多核苷酸相互作用、締合或形成復合物。在一些實施例中，另外的異源部分能夠結合至向導多核苷酸。在一些實施例中，另外的異源部分能夠結合至多肽接頭。在一些實施例中，另外的異源部分能夠結合至多核苷酸接頭。另外的異源部分可以是蛋白結構域。在一些實施例中，另外的異源部分可以是k同源(kh)結構域、ms2外殼蛋白結構域、pp7外殼蛋白結構域、sfmu?com外殼蛋白結構域、sterilα基序、端粒酶ku結合基序和ku蛋白、端粒酶sm7結合基序和sm7蛋白、或rna識別基序。

211、生物活性：如本文所用，短語“生物活性”是指在生物系統(tǒng)中，特別是在生物體中具有活性的任何藥劑的特性。例如，當施用于生物體時對所述生物體具有生物效應的藥劑被視為是生物活性的。在特定實施例中，當肽具有生物活性時，所述肽的共享肽的至少一種生物活性的部分通常被稱為“生物活性”部分。

212、切割：如本文所用，切割是指由本文所述的crispr系統(tǒng)的核酸酶產(chǎn)生的靶核酸中的斷裂。在一些實施例中，切割事件是雙鏈dna斷裂。在一些實施例中，切割事件是單鏈dna斷裂。在一些實施例中，切割事件是單鏈rna斷裂。在一些實施例中，切割事件是雙鏈rna斷裂。

213、互補：如本文所用，互補是指核酸鏈形成沃森-克里克(watson-crick)堿基配對，使得a堿基與t配對，并且c堿基與g配對，或與第二核酸鏈上的堿基形成非傳統(tǒng)堿基配對。換句話說，它是指在適當?shù)臈l件下彼此雜交的核酸。

214、成簇規(guī)律間隔的短回文重復序列(clustered?interspaced?short?palindromicrepeat，crispr)相關(cas)系統(tǒng)：如本文所用，crispr-cas9系統(tǒng)是指參與crispr效應子的表達或指導crispr效應子活性的核酸和/或蛋白質，包含編碼crispr效應子的序列、rna向導以及來自crispr基因座的其它序列和轉錄物。在一些實施例中，crispr系統(tǒng)是經(jīng)工程化、非天然存在的crispr系統(tǒng)。在一些實施例中，crispr系統(tǒng)的組分可以包含編碼系統(tǒng)的一種或多種組分的核酸(例如，載體)、蛋白質形式的組分或其組合。

215、crispr陣列：如本文所用，術語“crispr陣列”是指包含crispr重復序列和間隔子的核酸(例如，dna)區(qū)段，該區(qū)段從第一個crispr重復的第一個核苷酸開始并且到最后一個(末端)crispr重復的最后一個核苷酸結束。通常，crispr陣列中的每個間隔子位于兩個重復序列之間。如本文所用，術語“crispr重復序列”或“crispr同向重復序列”或“同向重復序列”是指多個短的同向重復序列，這些短的直接重復序列在crispr陣列內顯示非常少或無序列變異。

216、crispr相關蛋白(cas)：如本文所用，術語“crispr相關蛋白”、“crispr效應子”、“效應子”或“crispr酶”是指執(zhí)行酶活性或結合由rna向導指定的核酸上的靶位點的蛋白。在不同實施例中，crispr效應子具有核酸內切酶活性、切口酶活性、核酸外切酶活性、轉座酶活性和/或切除活性。應當理解，本文提供的任何cas9蛋白包括天然存在的cas9蛋白及其非天然存在的變體。

217、crrna：如本文所用，術語“crispr?rna”或“crrna”是指包含由crispr效應子用于靶向特定核酸序列的向導序列的rna分子。通常，crrna含有介導靶識別的序列和與tracrrna形成雙鏈體的序列。在一些實施例中，crrna:tracrrna雙鏈體與crispr效應子結合。

218、離體：如本文所用，術語“離體”是指在細胞或組織中發(fā)生的事件，該細胞或組織在多細胞生物體外而不是在多細胞生物體內生長。

219、功能等同物或類似物：如本文所用，術語“功能等同物”或“功能類似物”在氨基酸序列的功能衍生物的上下文中表示保留與原始序列的生物活性(功能或結構)基本上類似的生物活性的分子。功能衍生物或等同物可以是天然衍生物或是合成制備的。示例性功能衍生物包含具有一個或多個氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列，條件是蛋白質的生物活性是保守的。取代氨基酸理想地具有與所述取代氨基酸相似的化學物理性質。理想的相似化學物理性質包含電荷、體積、疏水性、親水性等的相似性。

220、半衰期：如本文所用，術語“半衰期”是量(如蛋白濃度或活性)下降到其在時間段開始時測量的值的一半所需的時間。

221、改善、增加或減少：如本文所用，術語“改善”、“增加”或“減少”或其語法等效物表示相對于基線測量值的值，該基線測量值如在開始本文所述的治療之前在同一個體中的測量值，或在不存在本文所述的治療的情況下在對照受試者(或多個對照受試者)中的測量值。“對照受試者”是患有與正在治療的受試者相同形式的疾病的受試者，該受試者與正在接受治療的受試者的年齡大致相同。

222、抑制：如本文所用，術語“抑制(inhibition)”、“抑制(inhibit)”和“抑制(inhibiting)”是指減少或降低所關注的蛋白質或基因的活性和/或表達的過程或方法。通常，抑制蛋白質或基因是指將蛋白質或基因的表達或相關活性降低至少10％或更多，例如，20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多，或表達或相關活性降低大于1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多，如通過本文所述或本領域公認的一種或多種方法測量的。

223、雜交：如本文所用，術語“雜交”是指兩個或更多個核酸通過沃森-克里克配對、胡斯坦(hoogstein)結合或其它序列特異性結合在兩個核酸的堿基之間通過氫鍵而彼此結合的反應。能夠與另一序列雜交的序列被稱為該序列的“補體”，并且被稱為“互補的”或表現(xiàn)出“互補性”。

224、插入缺失(indel)：如本文所用，術語“插入缺失”是指核酸序列中堿基的插入缺失。它通常會導致突變并且是遺傳變異的一種常見形式。

225、體外：如本文所使用的，術語“體外”是指發(fā)生在人工環(huán)境，例如測試管或反映器皿中、細胞培養(yǎng)基等中而不是多細胞生物體內的事件。

226、體內：如本文所用，術語“體內”是指在多細胞生物體如人或非人動物內發(fā)生的事件。在基于細胞的系統(tǒng)的情況下，該術語可用于指代在活細胞(與例如體外系統(tǒng)相反)內發(fā)生的事件。

227、接頭：術語“接頭”是指用于連接兩個或更多個實體的任何手段、實體或部分。在一些實施例中，接頭為共價接頭。在一些實施例中，接頭為非共價接頭。共價接頭的實例包括共價鍵或共價連接至待連接的蛋白質或結構域中的一者或多者的接頭部分。在一些實施例中，接頭是非共價鍵，例如通過金屬中心(諸如鉑原子)的有機金屬鍵。連接可以是永久的或可逆的。對于共價連接，可以使用各種官能，諸如酰胺基團(包括碳酸衍生物)、醚、酯(包括有機和無機酯)、氨基、氨基甲酸酯、脲等。為了提供連接，可以通過氧化、羥基化、取代、還原等修飾結構域以提供用于偶聯(lián)的位點。用于綴合的方法是本領域技術人員眾所周知的并且被包括以用于本發(fā)明中。接頭部分包括但不限于化學接頭部分，或例如肽接頭部分(接頭序列)。應當理解，不顯著降低rna結合結構域和效應子結構域的功能的修飾是優(yōu)選的。

228、突變：如本文所用，術語“突變”具有本領域的普通含義，并且包含例如點突變、取代、插入、缺失、倒位和缺失。

229、寡核苷酸：如本文所用，術語“寡核苷酸”通常是指單鏈或雙鏈dna的介于約5與約100個核苷酸之間的多核苷酸。寡核苷酸也稱為“寡聚物(oligomer)”或“寡聚物(oligo)”，并且可以從基因中分離出來，或化學合成。

230、pam：術語“pam”或“原間隔相鄰基序”是指短核酸序列(長度通常為2至6個堿基對)，該序列位于如crispr-cas9等crispr系統(tǒng)所靶向切割的核酸區(qū)域之后。cas核酸酶切割需要pam并且通常在切割位點下游3至4個核苷酸處發(fā)現(xiàn)pam。

231、多肽：如本文所用，術語“多肽”是指通過肽鍵連接在一起的連續(xù)氨基酸鏈。術語用于指任何長度的氨基酸鏈，但本領域普通技術人員將理解術語不限于長鏈并且可以指包括通過肽鍵連接在一起的兩個氨基酸的最小鏈。如本領域技術人員所知，可以加工和/或修飾多肽。如本文所用，術語“多肽”和“肽”可互換使用。

232、預防：如本文所用，當與疾病、疾患和/或病癥的發(fā)生結合使用時，術語“預防(prevent)”或“預防(prevention)”是指降低發(fā)生疾病、疾患和/或病癥的風險。

233、蛋白質：如本文所使用的術語“蛋白質”是指一種或多種作為離散單元發(fā)揮作用的多肽。如果單個多肽為離散功能單元且不需要與其它多肽進行永久或暫時的物理締合以形成離散功能單元，那么術語“多肽”和“蛋白質”可以互換地使用。如果離散功能單位由多于一種物理上彼此締合的多肽組成，則術語“蛋白質”是指物理偶聯(lián)并作為離散單位一起發(fā)揮作用的多種多肽。

234、參考：“參考”實體、系統(tǒng)、數(shù)量、條件集合等是與本文所述的測試實體、系統(tǒng)、數(shù)量、條件集合等進行比較的實體、系統(tǒng)、數(shù)量、條件集合等。例如，在一些實施例中，“參考”抗體是如本文所述未經(jīng)工程化的對照抗體。

235、rna向導：術語rna向導是指促進本文所述的蛋白質靶向靶核酸的rna分子。示例性“rna向導”或“向導rna”包含但不限于crrna或crrna與同源tracrrna的組合。后者可能是獨立的rna或使用接頭(sgrna)融合為單個rna。在一些實施例中，rna向導經(jīng)工程化以包含化學或生物化學修飾。在一些實施例中，rna向導可以包含一個或多個核苷酸。

236、受試者：如本文所用，術語“受試者”意指需要對其進行診斷、預后或治療的任何受試者。例如，受試者可以是哺乳動物，例如人或非人靈長類動物(如猿、猴、猩猩或黑猩猩)、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、?；蚰膛?。

237、sgrna：術語“sgrna”或“單向導rna”是指含有(i)向導序列(crrna序列)和(ii)cas9核酸酶募集序列(tracrrna)的單向導rna。

238、基本同一性：短語“基本同一性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之間的比較。如本領域普通技術人員將理解的，如果兩個序列在對應位置含有相同殘基，則它們通常被認為是“基本上相同的”。如本領域所熟知的，可以使用多種算法中的任何一種來比較氨基酸或核酸序列，所述算法包含商業(yè)計算機程序中可用的那些，如用于核苷酸序列的blastn和用于氨基酸序列的blastp、有空位的blast和psi-blast。此類示例性程序在以下中描述：altschul等人,basic?local?alignment?search?tool,j.mol.biol.,215(3):403-410,1990；altschul等人,methods?in?enzymology；altschul等人,nucleic?acids?res.25:3389-3402,1997；baxevanis等人,bioinformatics:a?practical?guide?to?the?analysisof?genes?and?proteins,wiley,1998；和misener等人,(編輯),bioinformatics?methodsand?protocols(methods?in?molecular?biology,第132卷),humana?press,1999。除了鑒定相同序列之外，上述程序通常提供對同一性程度的指示。在一些實施例中，如果在相關延伸段的殘基上至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的對應殘基相同，則認為兩個序列基本上相同。在一些實施例中，相關延伸段是完整序列。在一些實施例中，相關延伸段為至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500個或更多個殘基。

239、靶核酸：如本文所用，術語“靶核酸”是指crispr-cas9系統(tǒng)結合到的任何長度的核苷酸(寡核苷酸或多核苷酸)，脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其類似物。靶核酸可以具有三維結構，可以包含編碼區(qū)或非編碼區(qū)，可以包含外顯子、內含子、mrna、trna、rrna、sirna、shrna、mirna、核酶、cdna、質粒、載體、外源序列、內源序列。靶核酸可以包括經(jīng)修飾的核苷酸，該經(jīng)修飾的核苷酸包含甲基化核苷酸或核苷酸類似物。靶核酸可以散布有非核酸組分。靶核酸不限于單鏈、雙鏈或多鏈dna或rna、基因組dna、cdna、dna-rna雜交體或包括嘌呤和嘧啶堿基或其它天然的、經(jīng)化學或生化修飾的、非天然的或衍生的核苷酸堿基的聚合物。

240、治療有效量：如本文所用，術語“治療有效量”是指以適用于任何醫(yī)學治療的合理益處/風險比賦予經(jīng)治療受試者治療效果的治療性分子(例如，本文所描述的工程化的抗體)的量。療效可以是客觀的(即，可通過某一測試或標記測量)或主觀的(即，受試者給出效果的指示或感受到效果)。具體地，“治療有效量”是指有效治療、改善或預防特定疾病或病癥，或表現(xiàn)出可檢測的治療或預防作用的治療性分子或組合物的量，如通過改善與疾病相關的癥狀、預防或延遲疾病發(fā)作，和/或還減輕疾病癥狀的嚴重性或頻率?？梢栽诳梢园ǘ鄠€單位劑量的給藥方案中施用的治療有效量。對于任何特定的治療性分子，治療有效量(和/或有效給藥方案內的適當單位劑量)可以變化，例如，取決于施用途徑，以及與其它藥劑的組合。此外，對于任何特定受試者的具體治療有效量(和/或單位劑量)可以取決于多種因素，包括所治療的疾患和疾患的嚴重程度；所用特定藥劑的活性；采用的具體成分；受試者的年齡、體重、總體健康狀況、性別和飲食；所采用的特定治療分子的施用時間、施用途徑和/或排泄或代謝速率；治療的持續(xù)時間；以及醫(yī)學領域眾所周知的類似因素。

241、tracrrna：如本文所用，術語“tracrrna”或“反式激活crrna”是指包含形成crispr相關蛋白結合特定靶核酸所需結構的序列的rna。

242、治療：如本文所用，術語“治療(treatment)”(還有“治療(treat/treating)”是指施用治療性分子(例如，本文所述的crispr-cas治療性蛋白或系統(tǒng))，該治療性分子部分或完全減輕、改善、緩解、抑制疾病、疾患和/或病癥的一種或多種癥狀或特征，延遲疾病、疾患和/或病癥的一種或多種癥狀或特征的發(fā)作，降低疾病、疾患和/或病癥的一種或多種癥狀或特征的嚴重程度和/或降低疾病、疾患和/或病癥的一種或多種癥狀或特征的發(fā)病率。此類治療可以是針對未出現(xiàn)相關疾病、疾患和/或病癥的病征的受試者和/或針對僅出現(xiàn)疾病、疾患和/或病癥的早期病征的受試者?；蛘呋蛄硗猓@種治療可以是針對出現(xiàn)相關疾病、疾患和/或病癥的一種或多種確定病征的受試者。