本發(fā)明屬于生物，涉及多基因編輯提高水稻抗性淀粉含量的方法。

背景技術(shù)：

1、抗性淀粉(resistant?starch,rs)是一類(lèi)無(wú)法被小腸吸收利用，但能在結(jié)腸中被微生物菌群發(fā)酵降解的淀粉。由于抗性淀粉具有不被小腸消化吸收和緩慢釋放葡萄糖的營(yíng)養(yǎng)特性，使其具有較低的血糖生成指數(shù)，可以延緩餐后血糖濃度的劇烈增加。因此抗性淀粉在控制餐后血糖、預(yù)防結(jié)(直)腸癌、控制體重等方面發(fā)揮重要生理功能，是預(yù)防和控制糖尿病的優(yōu)良功能型食物?？剐缘矸蹚V泛存在于谷物、豆類(lèi)和薯類(lèi)中，但常規(guī)食物中的抗性淀粉含量一般低于3％。水稻(oryza?sativa?l.)是最重要的糧食作物之一，為全世界一半以上的人口提供主糧。普通水稻品種的抗性淀粉含量普遍小于1％，若能將其改良成為高抗性淀粉功能型稻米，就可通過(guò)主食攝入滿(mǎn)足人體對(duì)抗性淀粉攝入的膳食需求。

2、目前已經(jīng)報(bào)道的抗性淀粉合成功能基因主要有控制直鏈淀粉合成的wx，以及控制支鏈淀粉合成的ssiiia和beiib。其中，控制直鏈淀粉合成的gbssi由wx基因編碼，該基因不同的等位變異導(dǎo)致直鏈淀粉和抗性淀粉含量的變化。粳稻中為wxb，抗性淀粉含量一般小于1％；而秈稻中wxa，抗性淀粉含量一般可達(dá)2％。迅猛發(fā)展的基因編輯技術(shù)是作物改良的有效手段?；蚓庉嬒到y(tǒng)可以高效地對(duì)單個(gè)或多個(gè)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，利用此方法可以快速的創(chuàng)制和鑒定出豐富的遺傳資源，為作物育種提供了一條新的途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供多基因編輯提高水稻抗性淀粉含量的方法。

2、第一方面，本發(fā)明提供了抑制ssivb、bei和beiib蛋白中至少一種蛋白或抑制對(duì)應(yīng)蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在如下任一中的應(yīng)用；

3、具體為：

4、抑制ssivb蛋白或抑制對(duì)應(yīng)蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在如下任一中的應(yīng)用；

5、或，抑制bei蛋白和ssivb蛋白或抑制對(duì)應(yīng)蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在如下任一中的應(yīng)用：

6、或，抑制bei蛋白和beiib蛋白或抑制對(duì)應(yīng)蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在如下任一中的應(yīng)用：

7、1)提高植物種子抗性淀粉含量；

8、2)改變植物種子淀粉顆粒結(jié)構(gòu)；

9、3)培育高抗性淀粉含量種子的植物；

10、4)培育種子淀粉顆粒結(jié)構(gòu)改變的植物；

11、所述ssiiib蛋白為如下任一種：

12、1)由序列表中seq?id?no:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

13、2)將序列表中seq?id?no:1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且與植物抗性淀粉含量相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)；

14、所述植物為基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物。

15、在上文中，所述基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物為rs4突變體(物理誘變得到ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物)或抑制基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因表達(dá)得到的植物。

16、第二方面，本發(fā)明提供了抑制ssiiib蛋白、ssiiia蛋白、ssivb蛋白或抑制對(duì)應(yīng)蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在如下任一中的應(yīng)用：

17、1)提高植物種子抗性淀粉含量；

18、2)改變植物種子淀粉顆粒結(jié)構(gòu)；

19、3)培育高抗性淀粉含量種子的植物；

20、4)培育種子淀粉顆粒結(jié)構(gòu)改變的植物；

21、所述ssiiib蛋白為如下任一種：

22、1)由序列表中seq?id?no:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

23、2)將序列表中seq?id?no:1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且與植物抗性淀粉含量相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。

24、上文第一或二方面所述應(yīng)用中，

25、所述抑制ssivb蛋白或其編碼基因表達(dá)為敲除ssivb蛋白或其編碼基因，或，改變敲除ssivb蛋白編碼基因的編碼區(qū)使其無(wú)法表達(dá)；

26、所述抑制bei蛋白或其編碼基因表達(dá)為敲除bei蛋白或其編碼基因，或，改變敲除bei蛋白編碼基因的編碼區(qū)使其無(wú)法表達(dá)；

27、所述抑制beiib蛋白或其編碼基因表達(dá)為敲除beiib蛋白或其編碼基因，或，改變敲除beiib蛋白編碼基因的編碼區(qū)使其無(wú)法表達(dá)；

28、所述抑制ssiiib蛋白或其編碼基因表達(dá)為敲除ssiiib蛋白或其編碼基因，或，改變敲除ssiiib蛋白編碼基因的編碼區(qū)使其無(wú)法表達(dá)；

29、所述抑制ssiiia蛋白或其編碼基因表達(dá)為敲除ssiiia蛋白或其編碼基因，或，改變敲除ssiiia蛋白編碼基因的編碼區(qū)使其無(wú)法表達(dá)。

30、上文中，上述敲除或改變可以采用現(xiàn)有的方式實(shí)現(xiàn)，如pe定點(diǎn)刪除、同源重組+基因編輯、物理或化學(xué)誘變等；只要能夠敲除或改變水稻基因組ssiiia、ssiiib、ssivb、bei、和/或beiib基因的編碼區(qū)的任何物質(zhì)和任何方式，使ssiiia、ssiiib、ssivb、bei、和/或beiib基因無(wú)法正常表達(dá)蛋白即可。

31、進(jìn)一步地，上述改變?yōu)閷?duì)水稻基因組各個(gè)基因的編碼區(qū)完全或部分刪除、堿基替換改造、片段插入或以上幾種方式的綜合，使各個(gè)基因突變無(wú)法正常表達(dá)蛋白。

32、可以構(gòu)建敲除或改變系統(tǒng)，將該敲除或改變系統(tǒng)導(dǎo)入受體植物，具體可為：通過(guò)使用ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。

33、所述ssiiib編碼基因?yàn)槿缦氯我环N：

34、1)seq?id?no:2所示的核苷酸序列；

35、2)在嚴(yán)格條件下與1)所限定的dna分子雜交且具有相同功能的dna分子；

36、3)與1)所限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的dna分子。

37、第三方面，本發(fā)明提供了一種制備植物種子性狀改變轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：抑制或敲除植物中bei蛋白編碼基因和ssivb蛋白編碼基因的表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物；

38、所述轉(zhuǎn)基因植物種子的抗性淀粉含量高于所述植物；

39、或，所述轉(zhuǎn)基因植物種子的淀粉顆粒結(jié)構(gòu)較所述植物有顯著改變；

40、所述植物為基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物。

41、在上文中，所述基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物為rs4突變體(物理誘變得到ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物)或抑制基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因表達(dá)得到的植物。

42、第四方面，本發(fā)明提供了一種制備植物種子性狀改變轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：抑制或敲除植物中bei蛋白編碼基因和beiib蛋白編碼基因的表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物；

43、所述轉(zhuǎn)基因植物種子的抗性淀粉含量高于所述植物；

44、或，所述轉(zhuǎn)基因植物種子的淀粉顆粒結(jié)構(gòu)較所述植物有顯著改變；

45、所述植物為基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物。

46、在上文中，所述基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物為rs4突變體(物理誘變得到ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物)或抑制基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因表達(dá)得到的植物。

47、第五方面，本發(fā)明提供了一種制備植物種子性狀改變轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：抑制或敲除植物中ssiiib蛋白編碼基因、ssiiia蛋白編碼基因和ssivb蛋白編碼基因的表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物；

48、所述轉(zhuǎn)基因植物種子的抗性淀粉含量高于所述植物；

49、或，所述轉(zhuǎn)基因植物種子的淀粉顆粒結(jié)構(gòu)較所述植物有顯著改變。

50、在上文第五方面的所述方法中，所述植物為水稻栽培種，進(jìn)一步地，為zh11或r7954。

51、上文所述方法中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；

52、或，所述單子葉植物具體為水稻，進(jìn)一步具體為水稻栽培種。

53、第六方面，本發(fā)明提供了一種基因編輯植物中ssiiib蛋白編碼基因、ssiiia蛋白編碼基因和ssivb蛋白編碼基因的方法，包括如下步驟：對(duì)出發(fā)植物中ssiiib蛋白編碼基因、ssiiia蛋白編碼基因和ssivb蛋白編碼基因進(jìn)行基因編輯，使出發(fā)植物中的ssiiib蛋白編碼基因、ssiiia蛋白編碼基因和ssivb蛋白編碼基因均不表達(dá)，得到基因編輯植物，

54、所述基因編輯植物種子的抗性淀粉含量高于所述出發(fā)植物；

55、或，所述基因編輯植物種子的淀粉顆粒結(jié)構(gòu)較所述出發(fā)植物有顯著改變。

56、在上文第六方面的所述方法中，所述植物為水稻栽培種，進(jìn)一步地，為zh11或r7954。

57、第七方面，本發(fā)明提供了一種基因編輯植物中bei蛋白編碼基因和beiib蛋白編碼基因的方法，包括如下步驟：對(duì)出發(fā)植物中bei蛋白編碼基因和beiib蛋白編碼基因進(jìn)行基因編輯，使出發(fā)植物中的bei蛋白編碼基因和beiib蛋白編碼基因均不表達(dá)，得到基因編輯植物；

58、所述基因編輯植物種子的抗性淀粉含量高于所述出發(fā)植物；

59、或，所述基因編輯植物種子的淀粉顆粒結(jié)構(gòu)較所述出發(fā)植物有顯著改變；

60、所述植物為基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物。

61、在上文中，所述基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物為rs4突變體(物理誘變得到ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物)或抑制基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因表達(dá)得到的植物。

62、第八方面，本發(fā)明提供了一種基因編輯植物中bei蛋白編碼基因和ssivb蛋白編碼基因的方法，包括如下步驟：對(duì)出發(fā)植物中bei蛋白編碼基因和ssivb蛋白編碼基因進(jìn)行基因編輯，使出發(fā)植物中的bei蛋白編碼基因和ssivb蛋白編碼基因均不表達(dá)，得到基因編輯植物，所述基因編輯植物種子的抗性淀粉含量高于所述出發(fā)植物；

63、或，所述基因編輯植物種子的淀粉顆粒結(jié)構(gòu)較所述出發(fā)植物有顯著改變；

64、所述植物為基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物。

65、在上文中，所述基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物為rs4突變體(物理誘變得到ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因發(fā)生突變使其無(wú)法表達(dá)蛋白的植物)或抑制基因組中ssiiib蛋白編碼基因和ssiiia蛋白編碼基因表達(dá)得到的植物。

66、上述植物為水稻，水稻可以為普通栽培稻、誘變后的水稻突變體或轉(zhuǎn)基因編輯水稻，包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。

67、近年來(lái)，通過(guò)對(duì)秈稻材料r7954進(jìn)行物理誘變得到高抗性淀粉突變體rs4，其抗性淀粉含量約為11％。前期研究表明，rs4突變體的高抗性淀粉表型是由于控制支鏈淀粉合成的ssiiia和ssiiib共同突變導(dǎo)致。然而，是否能夠通過(guò)對(duì)不同水稻遺傳背景，以及多個(gè)淀粉合成基因的同時(shí)基因編輯，來(lái)改變水稻種子中抗性淀粉含量尚沒(méi)有研究。因此，采用基因編輯的技術(shù)對(duì)水稻多個(gè)基因進(jìn)行同時(shí)編輯，為營(yíng)養(yǎng)健康功能水稻育種材料的快速創(chuàng)制提供新思路。

68、實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明具有有益的技術(shù)效果：使用本發(fā)明基因編輯方法，對(duì)普通栽培稻中的ssiiia和ssiiib基因共同編輯，使得兩個(gè)基因功能缺失，使得抗性淀粉含量提高至7-11％的水平。對(duì)普通栽培稻中ssiiia、ssiiib和ssivb基因共同編輯，使得三個(gè)基因功能缺失，使得抗性淀粉含量提高至約為14％的水平。在高抗性淀粉突變體rs4中，同時(shí)編輯bei和beiib，或bei和ssivb基因，使得多個(gè)基因功能缺失，同樣會(huì)使得抗性淀粉含量由原先的11％提高至16-17％，或22-23％的水平。因此該方法的應(yīng)用不僅對(duì)功能基因的基礎(chǔ)研究具有重要的理論意義，還對(duì)高抗性淀粉作物育種具有重大的應(yīng)用潛力。