本發(fā)明屬于基因治療的平臺技術，特別是涉及一種基于微型crispr?cas蛋白cas12f1的堿基編輯器系統(tǒng)及其應用，可以通過腺相關病毒(adeno-associated?virus，aav)，lnp等手段遞送至體內，用于定點突變基因組dna中的單個堿基以進行單堿基突變遺傳疾病的基因治療。

背景技術：

1、人類的疾病大多與基因密切相關，所以根據(jù)基因進行針對性的改變一直是生命科學的長期愿望。據(jù)統(tǒng)計，在人類遺傳疾病中有超過32000種基因突變是由單堿基突變引起的[1]。因此，開發(fā)一種精確、高效并且安全的基因編輯工具來修復這些單堿基突變，對于基礎研究和遺傳疾病的基因治療有著極為重要的意義。

2、在2016～2017年，哈佛大學的david?r.liu實驗室首次開發(fā)了兩種不同的單堿基編輯器：胞嘧啶堿基編輯器(cytosine?base?editor，cbe)和腺嘌呤堿基編輯器(adeninebase?editor，abe)[2-3]?；赾be和abe，能夠在基因組dna中實現(xiàn)4種堿基之間的轉換(cto?t，ato?g，t?to?c，and?g?to?a)，為相當大一部分的單堿基遺傳疾病基因治療的實現(xiàn)提供了極大的可能性。

3、不過，大多數(shù)單堿基遺傳疾病需要在體內進行治療，這就需要一種有效的遞送載體，將單堿基編輯工具遞送至體內。腺相關病毒(adeno-associated?virus，aav)是美國食品和藥物管理局(fda)批準的一種相對安全，且能進行大規(guī)模生產(chǎn)的載體。但是，aav載荷有限，僅能包裝<4.7kb的基因[4]。目前，大部分的堿基編輯器是基于crispr-cas9系統(tǒng)的，spcas9蛋白>4.1kb，在此基礎上所開發(fā)的堿基編輯器將近6.2kb，遠遠超出了這一限制，阻礙了大多數(shù)堿基編輯器的臨床應用。因此，迫切需要開發(fā)一個更緊湊、高效的微型cas系統(tǒng)來進行基因治療的臨床應用。

4、un1cas12f1是ii類v-f型crispr-cas蛋白，只有529個氨基酸，大小遠遠小于cas9蛋白，更適合通過aav遞送至體內[5]。兩個cas12f分子以二聚體的形式與一個sgrna分子組裝在一起，形成cas12f1-sgrna復合體[6]。通過sgrna識別tttr?pam序列，結合到靶基因位點，切割單鏈或雙鏈dna[7]。2021年，韓國生命科學技術研究院的kim實驗室通過改造un1cas12f1的guide?rna，使該系統(tǒng)轉化為高效且特異的基因組編輯工具，并證實了un1cas12f1通過aav遞送的可行性[8]。同年，斯坦福大學的亓磊實驗室對un1cas12f1蛋白進行了迭代飽和突變，將改造后的系統(tǒng)命名為casmini，并證實了un1cas12f1可以在哺乳動物細胞中實現(xiàn)堿基編輯和基因編輯[9]。

5、基于un1cas12f1的胞嘧啶堿基編輯器理論上只有3.7kb大小，小于aav包裝容量所限制的4.7kb，因此有望開發(fā)以un1cas12f1為基礎的堿基編輯器用于遺傳疾病的基因治療。雖然un1cas12f1已被證實可以在哺乳動物細胞中實現(xiàn)堿基編輯，但是目前的編輯效率極低，不到10％，這顯然不足以應用于基因治療。

6、因此，現(xiàn)有技術中亟需提高un1cas12f1堿基編輯器的編輯效率，以實現(xiàn)通過aav遞送進行遺傳疾病基因治療。

技術實現(xiàn)思路

1、鑒于以上所述現(xiàn)有技術的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種基于微型crispr?cas蛋白dun1cas12f1(d326a&d510a)的堿基編輯器系統(tǒng)及其應用，用于解決現(xiàn)有技術中casmini編輯器編輯效率不高的問題。

2、為實現(xiàn)上述目的及其他相關目的，本發(fā)明提供一種完整的主題名稱一種基于微型crispr?cas蛋白dun1cas12f1(d326a&d510a)的堿基編輯器系統(tǒng)，其特征在于，所述堿基編輯器系統(tǒng)至少包括：dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子或編碼其的核酸；所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子具有d143r/t147r/t203r/e206r中一種或多種突變；所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

3、具體是通過突變改造dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白，并融合雙鏈dna結合蛋白或染色質重塑多肽來增強其結合dna的能力，極大地提升了堿基編輯的效率。進而，發(fā)明人也對dun1cas12f1(d326a&d510a)的guide?rna進行了改造，將其尺寸縮小到了原始尺寸的一半的同時，能維持較高的編輯效率。

4、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子具有d143r/t147r/e206r、d143r/t203r/e206r、或t147r/t203r/e206r三重突變。

5、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子具有d143r/t147r/t203r/e206r四重突變。

6、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述堿基編輯器系統(tǒng)還包括sgrna的突變子或編碼其的核酸。

7、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述sgrna的突變子在3’端具有20個堿基長度的spacer；

8、作為本發(fā)明的某些實施方式，優(yōu)選地，所述sgrna的突變子具有如下突變中的一種或多種，sgrna的突變d1，所述sgrna的突變d1為所述sgrna的核酸序列第136位到第148位的核苷酸刪除；

9、sgrna的突變d2，所述sgrna的突變d2為所述sgrna的核酸序列第1位到第24位的核苷酸刪除；

10、sgrna的突變d3，所述sgrna的突變d3為所述sgrna的核酸序列第36位到第62位的核苷酸刪除；

11、sgrna的突變d4，所述sgrna的突變d4為所述sgrna的核酸序列第29位到第70位的核苷酸刪除；

12、所述sgrna的核酸序列如seq?id?no.2所示。

13、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述sgrna的突變子具有如下突變中的一種：

14、sgrna的突變v1，為所述sgrna的突變d1基礎上還有所述突變d2；

15、sgrna的突變v2，為所述sgrna的突變d1基礎上還有所述突變d3；

16、sgrna的突變v3，為所述sgrna的突變d1基礎上還有所述突變d4；

17、sgrna的突變v4，為所述sgrna的突變d2基礎上還有所述突變d3；

18、sgrna的突變v5，為所述sgrna的突變d2基礎上還有所述突變d4；

19、sgrna的突變v6，為所述sgrna的突變d1基礎上還有所述突變d2和所述突變d3；

20、sgrna的突變v7，為所述sgrna的突變d1基礎上還有所述突變d2和所述突變d4。作為本發(fā)明的某些實施方式，所述sgrna的突變子為sgrna的突變子v6。

21、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子或編碼其的核酸在dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子的n端還含有sso7d。

22、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子和所述sso7d融合表達。

23、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述sso7d其氨基酸序列如seq?id?no.5所示。作為本發(fā)明的某些實施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子或編碼其的核酸在dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子其n段端還含有脫氨基酶的基因序列；所述脫氨基酶包括腺嘌呤脫氨酶、胞嘧啶脫氨酶。

24、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述腺嘌呤脫氨酶包括可用于abe編輯系統(tǒng)的腺嘌呤脫氨酶。

25、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述腺嘌呤脫氨酶包括ectada及其進化體。

26、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述腺嘌呤脫氨酶包括tada7.10、或tada8e。

27、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述腺嘌呤脫氨酶為腺嘌呤脫氨酶tada和tada8e二聚體。

28、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述腺嘌呤脫氨酶與所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子融合表達。

29、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述腺嘌呤脫氨酶tada其氨基酸序列如seq?idno.3所示，所述腺嘌呤脫氨酶tada8e其氨基酸序列如seq?id?no.4所示。

30、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述腺嘌呤脫氨酶的基因序列5’段還包括sso7d的基因序列。

31、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述腺嘌呤脫氨酶和所述sso7d融合表達。

32、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述sso7d其氨基酸序列如seq?id?no.5所示。

33、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子、所述腺嘌呤脫氨酶和所述sso7d融合表達，從n端開始次序依次為所述sso7d蛋白、所述腺嘌呤脫氨酶tada、所述腺嘌呤脫氨酶tada8e、所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子。

34、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子或編碼其的核酸在dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子其n段端還含有胞嘧啶脫氨酶。

35、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述胞嘧啶脫氨酶包括可用于cbe編輯系統(tǒng)的胞嘧啶脫氨酶，所述可用于cbe編輯系統(tǒng)的胞嘧啶脫氨酶包括apobec1家族、apobec3家族、aid家族脫氨酶、cda家族以及進化后的ectada突變體。

36、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述dun1cas12f1(d326a&d510a)突變子的編碼其的核酸為質粒、腺病毒、或慢病毒；所述sgrna突變子的編碼其的核酸為質粒、腺病毒、或慢病毒。

37、優(yōu)選地，所述質粒為pcmv。

38、為了上述目的以及其他目的，本發(fā)明還提供了一種重組載體，所述重組載體包含有所述的dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白突變子的編碼核酸、和/或所述sgrna突變子的編碼核酸。

39、本發(fā)明還提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞包含所述的堿基編輯器系統(tǒng)，所述宿主細胞為哺乳動物細胞、昆蟲細胞、大腸桿菌、酵母細胞。

40、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述宿主細胞為是hek293ft細胞。

41、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述宿主細胞包括人原代細胞。

42、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述人原代細胞包括人誘導多能干細胞、人原代t細胞或人造血干細胞中的任意一種。

43、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述宿主細胞包括人免疫細胞。

44、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述人免疫細胞包括人t淋巴細胞、b淋巴細胞、自然殺傷細胞(nk)、細胞因子誘導的殺傷細胞(cik)、樹突狀細胞(dc)、巨噬細胞中的任意一種。

45、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述宿主細胞包括人血液病細胞。

46、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述人血液病細胞包括人白血病細胞、人白血病腫瘤細胞、人單核細胞白血病細胞、人急性t細胞白血病細胞、人急性髓系細胞白血病、人急性粒細胞白血病、人急性淋巴母細胞白血病細胞中的任意一種。

47、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述宿主細胞包括腫瘤細胞。

48、作為本發(fā)明的某些實施方式，所述腫瘤細胞包括人肺癌細胞、人卵巢癌細胞、人黑色素肉瘤細胞、人肝癌細胞、人結腸癌細胞、人結直腸癌細胞、人宮頸癌細胞、人胃癌細胞、人乳腺癌細胞、人淋巴瘤細胞、人前列腺癌、人食道癌細胞、人甲狀腺癌細胞、人胰腺癌細胞、人神經(jīng)膠質瘤細胞中的任意一種。

49、本發(fā)明還提供了所述的堿基編輯器系統(tǒng)、所述的重組載體、所述的宿主細胞在堿基編輯中的應用。

50、本發(fā)明還提供了所述的堿基編輯器系統(tǒng)、所述的重組載體、所述的宿主細胞在制備基因編輯的細胞和/或藥物中的應用。

51、本發(fā)明還提供了所述的堿基編輯器系統(tǒng)、所述的重組載體、所述的宿主細胞在定向進化中的應用。

52、本發(fā)明還提供了所述的dun1cas12f1(d326a&d510a)蛋白的突變子。

53、本發(fā)明還提供了所述的sgrna突變子。

54、如上所述，本發(fā)明的基于微型crispr?cas蛋白dun1cas12f1(d326a&d510a)的堿基編輯器系統(tǒng)及其應用，具有以下有益效果：

55、un1cas12f1雖已被證實可在哺乳動物細胞中實現(xiàn)堿基編輯，但目前效率不到10％。本發(fā)明通過突變篩選，改造un1cas12f1蛋白，以此來增強蛋白與靶向dna的結合能力，將堿基編輯效率提升到30％。在此基礎上，融合了雙鏈dna結合蛋白sso7d，將編輯效率進一步提高到了60％左右。此外，本發(fā)明將un1cas12f1?sgrna尺寸截短了一半，并能維持60％左右的編輯效率。