本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種prs4xx載體及其在提高陽性菌落篩選率中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、載體，即基因工程載體，是指基因或分子的選殖載體，是可攜帶外來遺傳物質(zhì)進入另一細(xì)胞的媒介dna或rna分子且能復(fù)制和/或表達。含有外源dna的載體，稱為重組dna。載體主要有四種類型，分別為質(zhì)粒、病毒載體、黏質(zhì)體和人工染色體。

2、prs4xx系列載體是用于釀酒酵母基因克隆的穿梭載體，也能夠在大腸桿菌中復(fù)制。prs4xx系列載體主要分為prs41x低拷貝系列載體和prs42x高拷貝系列載體。prs41x低拷貝系列載體以多功能質(zhì)粒pbluescript為骨架，構(gòu)建了一套ycp質(zhì)粒(yeast?centromereplasmid，酵母著絲粒質(zhì)粒)，這些載體在結(jié)構(gòu)上都是一致的，僅在所使用的酵母選擇標(biāo)記基因(如his3、trpl、leu2、ura3)上有所不同，它們擁有pbluescript的所有屬性以及一些酵母特有的特性。prs42x高拷貝系列載體則是以pbluescript?ii?sk+為骨架，但以釀酒酵母天然質(zhì)粒2μ復(fù)制子(ori)的序列取代prs41x低拷貝系列載體中酵母著絲粒cen/ars復(fù)制子，構(gòu)建了一套yep游離型質(zhì)粒(yeast?episomal?plasmids或yeast?extrachromosomalplasmid)。

3、yeast?fab?assembly從釀酒酵母標(biāo)準(zhǔn)生物組件的模塊化設(shè)計開始，定義了三類組件：啟動子組件(pro)、開放閱讀框組件(orf)和終止子組件(ter)。此方法采用golden?gate(金門組裝)不僅具有相對便宜和高效的優(yōu)勢，而且還允許根據(jù)預(yù)定義的遺傳規(guī)則有序地組裝這些生物組件。組裝過程中分別設(shè)計了三個載體來承載這三種類型的部分，其設(shè)計方式如下：一個部分使用兩種不同的iis酶(即bsaⅰ和bsmbⅰ)進行克隆和釋放，但具有相同的粘性末端，這些部分的克隆可以以高效率和高通量的方式進行；然后對轉(zhuǎn)錄單位(tu)的組裝進行了優(yōu)化，將pro、orf和ter結(jié)合在一起，進而可以達到近100％的效率。通過將組裝好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母，可以很容易地檢測到每個tu的表達。此外，yeast?fab?assembly的分層設(shè)計允許多個tu通過簡單的體外反應(yīng)直接組裝并整合到酵母中的一個目標(biāo)位點，為代謝工程領(lǐng)域的研究人員提供了一種快速、經(jīng)濟有效地測試和優(yōu)化釀酒酵母新的異源途徑的策略。

4、目前，在釀酒酵母中表達異源代謝通路的方法就是將外源通路基因用yeast?fabassembly策略采用golden?gate組裝的方法組裝成pot(pro、orf和ter)，然后將數(shù)個pot連接到prs41x低拷貝系列載體或prs42x高拷貝系列載體中，之后轉(zhuǎn)化酵母或整合到酵母基因組中。常用的prs4xx系列載體在原始載體的骨架上，添加了適用于golden?gate組裝的酶切位點，并在酶切位點之間添加了rfp報告基因，但所用的抗性仍為氨芐青霉素(amp),與yeast?fab?assembly協(xié)議組裝中所用的pot質(zhì)粒的抗性一致，未經(jīng)bsaⅰ成功切割的pot質(zhì)粒也會同時進入到大腸桿菌感受態(tài)中并使得大腸桿菌在抗性篩選培養(yǎng)基中生長，增加假陽性的概率。而改造后的prs4xx(kan)系列載體在保留了rfp的基礎(chǔ)上，將氨芐青霉素(amp)替換成為卡那霉素(kan)，使其可以在golden?gate組裝過程中去除pot質(zhì)粒的污染，提高陽性率，并且即使使用另外的連接方式(如in-fusion、gibson等同源重組方式)也不會產(chǎn)生星狀菌落，這與amp抗性相比具有明顯的優(yōu)勢。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一系列新載體，以解決prs4xx系列載體因攜帶和pot質(zhì)粒相同的氨芐青霉素(ampicillin)導(dǎo)致偽陽性太高的問題。

2、本發(fā)明首先保護一種載體，為將prs4xx系列載體上的amp抗性基因替換為與pot載體上不同的抗性基因，以消除pot載體在大腸桿菌轉(zhuǎn)化后對陽性菌落的影響。

3、上述載體中，所述與pot載體上不同的抗性基因具體可為kan抗性基因。

4、上述載體中，所述prs4xx系列載體可為prs41x低拷貝系列載體和prs42x高拷貝系列載體。所述prs41x低拷貝系列載體以多功能質(zhì)粒pbluescript為骨架，構(gòu)建了一套ycp質(zhì)粒，這些載體在結(jié)構(gòu)上都是一致的，僅在所使用的酵母選擇標(biāo)記基因(如his3、trpl、leu2、ura3)上有所不同，它們擁有pbluescript的所有屬性以及一些酵母特有的特性。所述prs42x高拷貝系列載體則是以pbluescript?ii?sk+為骨架，但以釀酒酵母天然質(zhì)粒2μ復(fù)制子(ori)的序列取代prs41x低拷貝系列載體中酵母著絲粒cen/ars復(fù)制子，構(gòu)建了一套yep游離型質(zhì)粒。所述prs4xx系列載體具體可為載體prs413(amp)。所述prs42x高拷貝系列載體具體可為載體prs423(amp)。

5、上述任一所述載體還添加了一個rfp報告基因并在其兩端各加入一組限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在pot完成組裝后會替換掉rfp。所述一組限制性內(nèi)切酶的酶切位點可為限制性內(nèi)切酶bsaⅰ/bsmbⅰ。

6、上述任一所述載體具體可為重組載體prs413(kan-rfp)、重組載體prs414(kan-rfp)、重組載體prs415(kan-rfp)、重組載體prs416(kan-rfp)、重組載體prs423(kan-rfp)、重組載體prs424(kan-rfp)、重組載體prs425(kan-rfp)或重組載體prs426(kan-rfp)。

7、本發(fā)明還保護上述任一所述載體在將目的基因?qū)胨拗髦械膽?yīng)用。

8、本發(fā)明還保護上述任一所述載體在提高將目的基因?qū)胨拗鞯年栃月手械膽?yīng)用。

9、上述任一所述的應(yīng)用通過如下方式實現(xiàn)：將上述任一所述載體和目的基因進行組裝，之后導(dǎo)入宿主。

10、上述任一所述的應(yīng)用中，所述組裝的方式可為golden?gate組裝方式或同源重組組裝方式。優(yōu)選的，同源重組可為in-fusion同源重組。

11、上述任一所述的應(yīng)用中，所述宿主可為酵母、細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞或哺乳細(xì)胞。所述酵母可為啤酒酵母。所述細(xì)菌可為大腸桿菌。

12、本發(fā)明還保護一種將目的基因?qū)胨拗鞯姆椒ǎㄈ缦虏襟E：將上述任一所述載體和目的基因進行組裝，之后導(dǎo)入宿主并在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過重組宿主的顏色判斷是否含有目的基因。所述培養(yǎng)基的抗性可為與pot載體上不同的抗性。

13、所述培養(yǎng)基具體可為含卡那霉素抗性的培養(yǎng)基。

14、上述方法中，當(dāng)宿主為大腸桿菌時：如果重組大腸桿菌的菌落為白色，則該重組大腸桿菌含有目的基因；如果重組大腸桿菌的菌落為紅色，則該重組大腸桿菌不含有目的基因。

15、上述方法中，當(dāng)宿主為大腸桿菌時，還可以在培養(yǎng)基上添加iptg和xgal，如果重組大腸桿菌的菌落為藍(lán)色，則該重組大腸桿菌含有目的基因；如果重組大腸桿菌的菌落為紫色，則該重組大腸桿菌不含有目的基因。即合并使用原本質(zhì)粒上帶的laczα基因進行藍(lán)白斑篩選，含有陽性重組載體的菌落表現(xiàn)為藍(lán)色，可直觀地區(qū)分帶假陽性的空載的紫色菌落。

16、本發(fā)明的關(guān)鍵點在于將傳統(tǒng)的prs4xx系列載體的細(xì)菌篩選抗性從amp替換成kan，與yeast?fab?assembly策略中pot質(zhì)粒的抗性(amp)區(qū)分開來，從而在后續(xù)pot組裝中降低pot質(zhì)粒帶來的假陽性的影響，從而提高陽性率。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：使用kan抗性基因可以降低因為pot轉(zhuǎn)入大腸桿菌中所引起偽陽性菌落生長,提高篩選陽性正確菌落效率；利用rfp紅色熒光蛋白和藍(lán)白篩選，可直觀地區(qū)分含有插入片段質(zhì)粒的菌落，減少后續(xù)質(zhì)粒提取及驗證的工作量。本發(fā)明對傳統(tǒng)的釀酒酵母表達載體prs4xx系列進行了優(yōu)化，通過替換載體抗性和添加rfp報告基因，可以使其應(yīng)用到基于金門組裝的yeast?fab?assembly策略中，并且大大降低了假陽性，提高了異源代謝通路在釀酒酵母中表達的效率。本發(fā)明具有重要的應(yīng)用價值。