本發(fā)明涉及一種發(fā)酵培養(yǎng)基及卡那霉素的制備方法。

背景技術(shù)：

1、卡那霉素(kanamycin)是于1957年從卡那鏈霉菌發(fā)酵液中提取出的一種氨基糖苷類抗生素?？敲顾刂饕?個組分，分別為卡那霉素a、b和c，其中主要成分為卡那霉素a?？敲顾赝ㄟ^與30s核糖體結(jié)合從而致使mrna密碼誤讀，干擾其蛋白質(zhì)的矯正過程使其翻譯錯誤而產(chǎn)生無功能或者功能缺失的蛋白，從而達(dá)到抗菌目的。

2、卡那霉素的衍生物硫酸卡那霉素，臨床上主要用于由敏感菌所致的肺部感染、尿路感染、膽道感染敗血癥及腹腔感染等，對耐藥性金色葡萄球菌也有良好的抗菌作用?？敲顾剡m用于治療敏感腸桿菌科細(xì)菌如大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、產(chǎn)氣腸桿菌及志賀菌屬等引起的嚴(yán)重感染，后兩者常需與其他抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用。

3、生物發(fā)酵是卡那霉素的主要生產(chǎn)方法，主要包括生物菌種選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化。

4、趙鏡巖等人(趙靜巖，李靜英，陳岳花等.卡那霉素鏈霉菌亞硝基胍誘變育種[j].遺傳，1980，2(003)：17-19)通過在卡那霉素?fù)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中添加ntg進(jìn)行誘變育種，找到了最合適的誘變條件，所用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的具體配方為：黃豆餅粉2.5wt％、淀粉4.0wt％、葡萄糖0.5wt％、硝酸鈉0.8wt％、硫酸鋅0.01wt％。經(jīng)過誘變后搖瓶發(fā)酵效價可達(dá)5101?u/ml，比出發(fā)菌株提高29.5％。

5、杜潤泮等人(杜潤泮，趙靜巖.卡那霉素鏈霉菌耐高濃度自身代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株的選育[j].抗生素，1983(01)：26-30)通過利用γ射線照射卡那霉素鏈霉菌孢子懸液后，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗證篩選，所用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的具體配方為：黃豆餅粉3.0wt％、淀粉2.5wt％、麥芽糖2.5wt％、硝酸鈉0.8wt％、硫酸鋅0.01wt％，ph7.2。經(jīng)誘變后搖瓶發(fā)酵效價最高可達(dá)7000u/ml，相比對照提高了32.78％。

6、趙鏡巖等人(趙靜巖，虞明霞，方舜瓊.卡那霉素鏈霉菌誘變育種和發(fā)酵的研究[j].抗生素，1982(04)：11-17)通過紫外誘變、ems、ntg和亞硝酸誘變對卡那霉素菌懸液進(jìn)行處理，并改變發(fā)酵培養(yǎng)基中單一淀粉為麥芽糖淀粉混合培養(yǎng)基，并將黃豆餅粉由3.5wt％提升至5.0wt％，在新的培養(yǎng)條件下卡那霉素的發(fā)酵效價提升了29.5％。

7、沈建峰等人(沈劍鋒，樊偉明.西索米星在卡那霉素鏈霉菌育種中的應(yīng)用[j].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2011(12)：899-901)通過加入卡那霉素結(jié)構(gòu)類似物西索米星結(jié)合多輪次uv誘變進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并探究了卡那霉素在搖瓶發(fā)酵過程中溶氧對發(fā)酵的影響，所用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：黃豆餅粉3.0wt％、淀粉6.0wt％、葡萄糖0.5wt％、碳酸鈣0.2wt％、硝酸鈉0.4wt％、硫酸鋅0.01wt％、淀粉酶0.1wt％。優(yōu)化后的搖瓶發(fā)酵效價可達(dá)8521?u/ml。

8、上述現(xiàn)有的卡那霉素的制備方法均需特殊的誘變條件，尚無適用于普通發(fā)酵條件但可獲得優(yōu)異效價的培養(yǎng)基的報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有的發(fā)酵制備卡那霉素的方法需特殊誘變條件的缺陷，而提供一種發(fā)酵培養(yǎng)基及卡那霉素的制備方法。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基用于制備卡那霉素時，無需特殊的誘變處理，即可獲取優(yōu)異的效價。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明第一方面提供了一種發(fā)酵培養(yǎng)基，其包括碳源、氮源、碳酸鈣、硫酸鋅、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、鉬酸鈉和水；其中，

4、所述碳源包括葡萄糖、玉米淀粉和玉米粉；

5、所述氮源包括硝酸鈉、豆餅粉、豆粕粉、酵母粉、斯凱爾蛋白胨和氨基酸；所述氨基酸包括谷氨酸鈉和/或賴氨酸。

6、本發(fā)明中，所述碳源的含量可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)的含量范圍選用，較佳地為2.6-11.5wt％。

7、其中，所述葡萄糖的含量可為0.1-1.5wt％，較佳地為0.1-1wt％，例如0.5wt％。

8、其中，所述玉米粉和所述玉米淀粉的總含量可為2.5-10wt％，較佳地為2.5-8.5wt％，例如5.5wt％。所述玉米粉的含量可為0.5-3.5wt％，例如2wt％。所述玉米淀粉的含量可為2-5wt％，例如3.5wt％。

9、較佳地，所述玉米粉的含量為2wt％，所述玉米淀粉的含量為3.5wt％。

10、本發(fā)明中，所述氮源的含量可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)的含量范圍選用，較佳地為1.22-10.4wt％。

11、其中，所述硝酸鈉的含量可為0.3-2.5wt％，較佳地為0.5-2wt％，例如1.2wt％。

12、其中，所述豆餅粉和所述豆粕粉的總含量可為0.8-5.6wt％，較佳地為2-4wt％，例如為3.2wt％。所述豆餅粉的含量可為1-2wt％，例如1.6wt％。所述豆粕粉的含量可為1-2wt％，例如1.6wt％。

13、較佳地，所述豆餅粉的含量為1.6wt％，所述豆粕粉的含量為1.6wt％。

14、其中，所述酵母粉的含量可為0.01-0.7wt％，較佳地為0.01-0.5wt％，例如0.2wt％。

15、其中，所述斯凱爾蛋白胨的含量可為0.1-1.2wt％，較佳地為0.1-1wt％，例如0.5wt％。

16、其中，所述氨基酸的含量可為0.01-0.4wt％，較佳地為0.03-0.3wt％，例如0.03wt％、0.05wt％、0.08wt％、0.1wt％、0.15wt％、0.2wt％或0.25wt％。所述氨基酸作為氮源提供細(xì)胞生長繁殖的氮素的同時，還參與了發(fā)酵過程中卡那霉素的具體合成。

17、本發(fā)明中，所述碳酸鈣的含量可為0.05-0.3wt％，較佳地為0.1-0.3wt％，例如0.2wt％。

18、本發(fā)明中，所述硫酸鋅的含量可為0.01-0.06wt％，較佳地為0.01-0.05wt％，例如0.02wt％。

19、本發(fā)明中，所述磷酸二氫鉀的含量可為0.005-0.025wt％，較佳地為0.01-0.02wt％，例如0.015wt％。

20、本發(fā)明中，所述硫酸亞鐵的含量可為0.002-0.009wt％，較佳地為0.004-0.006wt％，例如0.005wt％。

21、本發(fā)明中，所述鉬酸鈉的含量可為0.03-0.2wt％，較佳地為0.04-0.06wt％，例如0.05wt％。所述鉬酸鈉在發(fā)酵過程中可有效促進(jìn)菌體代謝，尤其是提高卡那霉素合成中合成酶的活性，進(jìn)而提升卡那霉素的效價。

22、在一些實例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分：葡萄糖0.1-1wt％，玉米淀粉2-5wt％，玉米粉0.5-3.5wt％，豆餅粉1-2wt％，豆粕粉1-2wt％，斯凱爾蛋白胨0.1-1wt％，酵母粉0.01-0.5wt％，硝酸鈉0.5-2wt％，氨基酸0.03-0.3wt％，鉬酸鈉0.04-0.06wt％，碳酸鈣0.1-0.3wt％，硫酸鋅0.01-0.05wt％，磷酸二氫鉀0.01-0.02wt％，硫酸亞鐵0.004-0.006wt％和水；其中，所述氨基酸包括賴氨酸和/或谷氨酸鈉。

23、在一較佳實例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分：葡萄糖0.5wt％，玉米淀粉3.5wt％，玉米粉2.0wt％，豆餅粉1.6wt％，豆粕粉1.6wt％，斯凱爾蛋白胨0.5wt％，酵母粉0.2wt％，硝酸鈉1.2wt％，谷氨酸鈉0.05wt％，鉬酸鈉0.05wt％，碳酸鈣0.2wt％，硫酸鋅0.02wt％，磷酸二氫鉀0.015wt％，硫酸亞鐵0.005wt％和水。

24、在一更佳實例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分：葡萄糖0.5wt％，玉米淀粉3.5wt％，玉米粉2.0wt％，豆餅粉1.6wt％，豆粕粉1.6wt％，斯凱爾蛋白胨0.5wt％，酵母粉0.2wt％，硝酸鈉1.2wt％，賴氨酸0.2wt％，鉬酸鈉0.05wt％，碳酸鈣0.2wt％，硫酸鋅0.02wt％，磷酸二氫鉀0.015wt％，硫酸亞鐵0.005wt％和水。

25、本發(fā)明第二方面提供了一種卡那霉素的制備方法，其包括如下步驟：將卡那霉素鏈霉菌種子液接種于如前所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，制得含卡那霉素的發(fā)酵液，分離即得。

26、其中，所述卡那霉素鏈霉菌可按本領(lǐng)域常規(guī)選擇，較佳地為保藏號為nrrl11379的卡那霉素鏈霉菌(streptomyces?kanamycin)。

27、其中，所述種子液的菌種濃度可按本領(lǐng)域常規(guī)選擇，一般可為20％-25％，例如20％，此處百分比為菌體所占發(fā)酵液的體積百分比。所述接種的量可按本領(lǐng)域常規(guī)選擇，一般可為5％-20％，例如10％，此處百分比為體積百分比。

28、其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件可按本領(lǐng)域常規(guī)。所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度較佳地為26-28℃，例如27.5℃。所述發(fā)酵培養(yǎng)的時間較佳地為5-6天，例如5天。

29、其中，所述卡那霉素鏈霉菌種子液可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法和條件制備而得，具體可包括：將卡那霉素鏈霉菌依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)。

30、所述斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基較佳地包括：氯化鈉0.5wt％，葡萄糖0.5wt％，蛋白胨0.5wt％，牛肉膏0.3wt％，瓊脂粉1.8wt％和去離子水，滅菌前ph為7.0-7.2，例如7.2。所述斜面培養(yǎng)的溫度較佳地為26-28℃，例如27.5℃。所述斜面培養(yǎng)的時間較佳地為6-7天，例如7天。

31、所述種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基較佳地包括：葡萄糖0.5wt％，可溶性淀粉0.5wt％，冷豆粉0.5wt％，硝酸鈉0.15wt％，酵母膏0.13wt％，碳酸鈣0.1wt％和去離子水，滅菌前ph為7.0-7.2，例如7.15。所述種子培養(yǎng)的接種量可為0.5-1.0cm2/100ml，例如1.0cm2/100ml。所述種子培養(yǎng)的溫度較佳地為26-28℃，例如27.5℃。所述種子培養(yǎng)的時間較佳地為40-48h，例如46h。

32、為進(jìn)一步提高效價，所述卡那霉素的制備方法還可包括本領(lǐng)域現(xiàn)有的各類誘變處理，如紫外誘變、γ射線誘變、甲基磺酸乙酯(ems)誘變、亞硝基胍(ntg)誘變和亞硝酸誘變中的一種或多種。

33、在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。

34、本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

35、本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：

36、與現(xiàn)有的發(fā)酵制備卡那霉素的培養(yǎng)基相比，本發(fā)明含特定組分組合的發(fā)酵培養(yǎng)基無需特殊誘變條件，在常規(guī)培養(yǎng)條件下即可獲取優(yōu)異的發(fā)酵效價，最高可達(dá)9500u/ml以上，顯著降低發(fā)酵成本，為卡那霉素的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定良好的基礎(chǔ)。