本發(fā)明屬于多肽合成，具體涉及到磺化純天然植物生長因子的一種新的工藝路線。

背景技術(shù)：

1、1991年，科學(xué)家通過對受傷后茄科植物研究發(fā)現(xiàn)了一類植物多肽生長因子，經(jīng)過近30年的持續(xù)努力，陸續(xù)共發(fā)現(xiàn)了近43種類型的多肽植物生長因子，這其中某些氨基酸側(cè)鏈被修飾過的多肽生長因子被稱為翻譯后修飾多肽生長因子。

2、1996年，日本的科學(xué)家用蘆筍葉肉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)經(jīng)過高密度培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基能夠刺激原本不分裂的低密度培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，而這種作用是已知植物激素?zé)o比替代的。經(jīng)過層析及hplc純化后，提純后的產(chǎn)物經(jīng)過氨基酸序列分析及快速原子轟擊質(zhì)譜法鑒定了其分子結(jié)構(gòu)，其主要為酪氨酸磺化多肽psk系列生長因子，這也是最初被發(fā)現(xiàn)的磺化修飾植物多肽生長因子，其結(jié)構(gòu)分別為：tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh（psk-α，phytosulfokine‐α），tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-oh（psk-β，phytosulfokine‐β）。

3、科學(xué)家經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，植物合成磺化多肽生長因子方式是在磺基轉(zhuǎn)移酶（tpst）的作用下，將paps(3’-磷酸腺苷轉(zhuǎn)移硫酸基5’-磷酸硫酸鹽)上的磺基轉(zhuǎn)移到蛋白的酪氨酸的側(cè)鏈羥基上形成酪氨酸的磺化修飾。自然界中比較引人矚目的植物生長因子還包括rgfs/glvs/psys/cif系列生長因子，這些生長因子的共同特點是多肽序列上的酪氨酸的側(cè)鏈產(chǎn)生了磺化修飾。以rgf1和glv8為例，其結(jié)構(gòu)可以用如下方式表示：

4、rgf1：asp-tyr(so3h)-ser-asn-pro-gly-his-his-pro-pro-arg-his-asn-oh

5、glv8：asp-tyr(so3h)-gln-gly-pro-lys-pro-arg-ser-lys-pro-leu-lys-asn-oh

6、多肽結(jié)構(gòu)上的酪氨酸在側(cè)鏈被磺化后，帶負(fù)電荷的磺酸鹽在生物體的胞外生物分子相互作用中起到非常關(guān)鍵的作用，例如細(xì)胞粘附、白細(xì)胞運輸、激素活動和免疫反應(yīng)等?；腔揎椇蟮倪@些天然多肽生長因子參與控制根和莖頂端分生組織的發(fā)育、生長調(diào)節(jié)和生殖過程，能夠有效的促進(jìn)植物根莖葉果分裂及生長，能夠控制果類的成熟，能夠增加棉花的纖維長度，能夠發(fā)揮協(xié)同作用提高紫杉醇的合成，而且酪氨酸磺化的多肽還能夠激發(fā)植物的免疫系統(tǒng)達(dá)到防止病蟲害的作用?；腔亩嚯闹参锷L因子因為其卓越的性能已經(jīng)引起了行業(yè)內(nèi)人員的廣泛關(guān)注，這類多肽的產(chǎn)業(yè)化的呼聲變得越來越高，到目前為止，主要報道的合成方式都是生物重組發(fā)酵法，該方法不利于大生產(chǎn)，給產(chǎn)品的推廣使用帶來了很大的困難。另外由于磺化多肽在酸性條件下容易分解，如果使用常規(guī)的多肽固相合成方法，在切除保護(hù)基的過程中要使用到的強(qiáng)酸會同時切除磺酸基團(tuán)，因此這種方法就會極大的降低收率且使得后處理就變得非常困難，無法進(jìn)行規(guī)模大生產(chǎn)。

7、本發(fā)明提供了酪氨酸磺化多肽生長因子的合成新方法，該方法成本低、收率高、操作簡單，結(jié)合了固相和液相的優(yōu)點，先合成分子砌塊后再進(jìn)行多肽結(jié)構(gòu)構(gòu)建，能夠規(guī)避磺化多肽遇酸不穩(wěn)定的問題，高效地進(jìn)行磺化生長因子的生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的一個目的是解決現(xiàn)有工藝的局限性，提供一種酪氨酸磺化多肽生長因子產(chǎn)業(yè)化的工藝路線。

2、產(chǎn)品的解決方案主要是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。其特點是：利用生長因子都是具有tyr（so3h）結(jié)構(gòu)的共同點，合成一種通用的分子砌塊p-tyr(so2f)-oh，然后將通用的分子砌塊構(gòu)建到不同的多肽結(jié)構(gòu)中，再在堿性條件下轉(zhuǎn)化為磺化生長因子肽。

3、步驟1，合成p-tyr(so2f)-oh作為分子砌塊。

4、步驟2，將步驟1所得的分子砌塊構(gòu)建到不同的多肽結(jié)構(gòu)形成關(guān)鍵的中間體。

5、步驟3，將步驟2得到的tyr(so2f)多肽在堿性條件水解為磺化多肽。

6、以上的步驟完成后，產(chǎn)品經(jīng)過純化和凍干可以得到最終產(chǎn)品，所得的粗產(chǎn)品采用高效液相制備色譜純化，色譜柱選用c4、c8或者c18作為柱填料，流動相選用醋酸體系、醋酸銨體系、teap體系、氨水體系中的一種或者幾種進(jìn)行組合。

7、在步驟1中合成分子砌塊的過程中，p為boc或者fmoc，以boc-tyr-oh或者fmoc-tyr-oh作為原料，得到的分子砌塊分別為boc-tyr(so2f)-oh或者fmoc-tyr(so2f)-oh，以so2f2氣體作為酰氟化反應(yīng)試劑，以硼酸、pbs、碳酸氫鈉、碳酸鈉作為堿，以二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、四氫呋喃、環(huán)己烷、二氧六環(huán)作為溶劑，反應(yīng)溫度為15-40℃。

8、在步驟2中，構(gòu)建多肽序列選擇以wang樹脂或者ctc樹脂作為載體，樹脂取代度為0.4-1.5mmol/g。主要包括脫fmoc保護(hù)和偶聯(lián)反應(yīng)，脫fmoc保護(hù)選用哌啶、dbu或者甲基哌啶，縮合反應(yīng)選擇的縮合試劑包括dic、dcc、hbtu、hatu、pybop、pyaop、tbtu，選擇nmm、diea、tea作為堿，縮合試劑和堿進(jìn)行搭配組合進(jìn)行使用。

9、在構(gòu)建多肽序列的過程中，除tyr選用分子砌塊外，其他保護(hù)氨基酸選用fmoc-gly-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-his(trt)-oh，fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-asn(trt)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，boc-asp(otbu)-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-val-oh。

10、步驟2中，多肽在樹脂上構(gòu)建完成后，裂解試劑為濃tfa的混合組分，tfa的含量為85-95%，其他的包含tis、水、edt、苯酚、tes、dodt中的一種或者幾種混合物。

11、步驟2所得到的產(chǎn)物為：

12、psk-α(so2f)：tyr(so2f)-ile-tyr(so2f)-thr-gln-oh

13、cif1(so2f)：

14、asp-tyr(so2f)-gly-asn-asn-ser-pro-ser-pro-arg-leu-glu-arg-pro-pro-phe-lys-leu-ile-pro-asn-oh

15、rgf1(so2f)：asp-tyr(so2f)-ser-asn-pro-gly-his-his-pro-pro-arg-his-asn-oh

16、glv8(so2f)：asp-tyr(so2f)-gln-gly-pro-lys-pro-arg-ser-lys-pro-leu-lys-asn-oh

17、psy1(so2f)：

18、asp-tyr(so2f)-gly-asp-pro-ser-ala-asn-pro-lys-his-asp-pro-gly-val-pro-pro-ser-oh

19、步驟3中，優(yōu)選地，溶劑為乙二醇、甲醇、乙醇、乙腈、四氫呋喃、二氧六環(huán)、水、二氯甲烷、乙酸乙酯、dmf中的一種或者幾種混合。

20、步驟3中，優(yōu)選地，采用吡啶、碳酸銫、dbu、dmap、哌啶、碳酸鉀、碳酸鋰、碳酸鈉作為堿，堿的用量是多肽的2-20倍。

21、步驟3中，得到產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)式為：

22、psk-α：tyr(so3h)-ile-tyr(so3h)-thr-gln-oh

23、cif1：

24、asp-tyr(so3h)-gly-asn-asn-ser-pro-ser-pro-arg-leu-glu-arg-pro-pro-phe-lys-leu-ile-pro-asn-oh

25、rgf1：asp-tyr(so3h)-ser-asn-pro-gly-his-his-pro-pro-arg-his-asn-oh

26、glv8：asp-tyr(so3h)-gln-gly-pro-lys-pro-arg-ser-lys-pro-leu-lys-asn-oh

27、psy1：

28、asp-tyr(so3h)-gly-asp-pro-ser-ala-asn-pro-lys-his-asp-pro-gly-val-pro-pro-ser-oh

29、本工藝帶來的優(yōu)點如下：1、利用這類生長因子結(jié)構(gòu)上都具有tyr(so3h)這一特點，采用液相方法先合成分子砌塊，采取固相方法進(jìn)行組裝構(gòu)建成不同的生長因子前體，再在溶液中將前體轉(zhuǎn)化為生長因子，結(jié)合固相和液相的優(yōu)點，提高生產(chǎn)規(guī)模，縮短生產(chǎn)周期。2、水解過程及其后的處理條件均是非常溫的堿性條件，轉(zhuǎn)化率高，能夠有效的避免磺化多肽生長因子系列產(chǎn)物在酸性條件下不穩(wěn)定的問題。