本發(fā)明屬于生物，具體涉及mthsd5蛋白在生產(chǎn)甾體激素中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、黃體酮等c21甾體物質(zhì)是一類重要的化合物，被證明在動物中具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗炎、抗腫瘤等功能。目前，甾體激素主要有雙烯法和4-ad法兩類工業(yè)合成路線，以合成生物學(xué)為基礎(chǔ)的從頭合成法作為第3條路線的潛力值得期待。然而高效的生物合成途徑是發(fā)現(xiàn)合成生物學(xué)生產(chǎn)的前提?？茖W(xué)家在動物中鑒定了黃體酮等c21化合物的生物合成途徑，但由于酶的活性低，制約整個以葡萄糖等為起始原料從頭合成路線的發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的為提供可將孕烯醇酮催化為黃體酮的△5-3β羥基類固醇脫氫酶/△5-△4異構(gòu)酶。

2、本發(fā)明所要的保護(hù)的△5-3β羥基類固醇脫氫酶/△5-△4異構(gòu)酶具體為mthsd5蛋白。

3、所述mthsd5蛋白，可為c1)-c4)中任一種：

4、c1)氨基酸序列是seq?id?no:18所示的蛋白質(zhì)；

5、c2)在c1)所示的蛋白質(zhì)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

6、c3)將c1)或c2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有△5-3β羥基類固醇脫氫酶/△5-△4異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)；

7、c4)與將c1)或c2)所示的蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性且具有△5-3β羥基類固醇脫氫酶/△5-△4異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。

8、其中，seq?id?no:18由316個氨基酸殘基組成。

9、為了使c1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在seq?id?no:18所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上標(biāo)簽。所述標(biāo)簽可為poly-arg標(biāo)簽(rrrrr)、flag標(biāo)簽(dykddddk)、strep-tag?ii標(biāo)簽(wshpqfek)或c-myc標(biāo)簽(eqkliseedl)。

10、上述c3)中的蛋白質(zhì)，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

11、上述c3)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。

12、上述c3)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將seq?id?no:12所示的dna序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上標(biāo)簽的編碼序列得到。

13、編碼上述任一所述mthsd5蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

14、編碼上述任一所述mthsd5蛋白的核酸分子可為b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：

15、b1)編碼區(qū)為seq?id?no:12所示的dna分子；

16、b2)核苷酸序列為seq?id?no:12所示的dna分子；

17、b3)與b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，來源于通關(guān)藤且編碼上述任一所述mthsd5蛋白的dna分子；

18、b4)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)限定的核苷酸序列雜交，來源于通關(guān)藤且編碼上述任一所述mthsd5蛋白的dna分子。

19、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

20、其中，seq?id?no:12由951個核苷酸組成，seq?id?no:12的核苷酸編碼seq?id?no:18所示的氨基酸序列。

21、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對本發(fā)明的編碼上述任一所述mthsd5蛋白的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的上述任一所述mthsd5蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼上述任一所述mthsd5蛋白，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

22、這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼seq?id?no:18所示的氨基酸序列組成的上述任一所述mthsd5蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機(jī)軟件進(jìn)行評價。使用計算機(jī)軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。

23、本發(fā)明還保護(hù)含有編碼上述任一所述mthsd5蛋白的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組細(xì)胞或重組生物。

24、所述含有上述任一所述mthsd5蛋白的核酸分子的表達(dá)盒具體可為實(shí)施例提及的gal10p-mthsd5-cwp2t表達(dá)盒。gal10p-mthsd5-cwp2t表達(dá)盒的核苷酸序列如seq?id?no:11所示。

25、上述任一所述重組生物可為重組微生物。所述含有上述任一所述mthsd5蛋白的核酸分子的重組微生物具體可為實(shí)施例提及的pg-mt108菌株。

26、本發(fā)明還保護(hù)上述任一所述mthsd5蛋白作為△5-3β羥基類固醇脫氫酶/△5-△4異構(gòu)酶的應(yīng)用。所述△5-3β羥基類固醇脫氫酶/△5-△4異構(gòu)酶可將孕烯醇酮催化為黃體酮。

27、本發(fā)明還保護(hù)上述任一所述mthsd5蛋白、編碼上述任一所述mthsd5蛋白的核酸分子或含有編碼上述任一所述mthsd5蛋白的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組細(xì)胞或重組生物在催化孕烯醇酮中的應(yīng)用。

28、本發(fā)明還保護(hù)上述任一所述mthsd5蛋白、編碼上述任一所述mthsd5蛋白的核酸分子或含有編碼上述任一所述mthsd5蛋白的核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組細(xì)胞或重組生物在生產(chǎn)甾體激素中的應(yīng)用。

29、上述應(yīng)用中，所述生產(chǎn)甾體激素是以孕烯醇酮為底物。

30、本發(fā)明還保護(hù)上述任一所述mthsd5蛋白聯(lián)合mtcyp108蛋白在生產(chǎn)甾體激素中的應(yīng)用。

31、上述任一所述mtcyp108蛋白為a1)-a4)中任一種：

32、a1)氨基酸序列是seq?id?no:19所示的蛋白質(zhì)；

33、a2)在a1)所示的蛋白質(zhì)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；

34、a3)將a1)或a2)所示的蛋白質(zhì)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有將膽固醇催化為孕烯醇酮的活性的蛋白質(zhì)；

35、a4)與將a1)或a2)所示的蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性且具有將膽固醇催化為孕烯醇酮的活性的蛋白質(zhì)。

36、其中，seq?id?no:19由478個氨基酸殘基組成。

37、為了使a1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在seq?id?no:19所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上標(biāo)簽。所述標(biāo)簽可為poly-arg標(biāo)簽(rrrrr)、flag標(biāo)簽(dykddddk)、strep-tag?ii標(biāo)簽(wshpqfek)或c-myc標(biāo)簽(eqkliseedl)。

38、上述a3)中的蛋白質(zhì)，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

39、上述a3)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。

40、上述a3)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將seq?id?no:19所示的dna序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上標(biāo)簽的編碼序列得到。

41、上述應(yīng)用中，所述生產(chǎn)甾體激素是以膽固醇為底物。

42、上述任一所述甾體激素可為黃體酮。

43、本發(fā)明在c21豐富的藥用植物通關(guān)藤(marsdenia?tenacissima)中挖掘了催化孕烯醇酮合成黃體酮的mthsd5蛋白，結(jié)合在通關(guān)藤中催化膽固醇合成孕烯醇酮的mtcyp108蛋白，在微生物中搭建了完整的黃體酮生物合成途徑，獲得了一條黃體酮生物合成途徑，為綠色合成c21甾體類藥物提供了重要基礎(chǔ)。即本發(fā)明所提供的mthsd5蛋白具有△5-3β羥基類固醇脫氫酶/△5-△4異構(gòu)酶活性，可將孕烯醇酮催化為黃體酮；mthsd5蛋白聯(lián)合mtcyp108蛋白可以以膽固醇為底物生產(chǎn)黃體酮。本發(fā)明具有重要應(yīng)用價值。