本發(fā)明涉及基因工程，具體地說(shuō)，涉及熱葡糖苷酶地芽孢桿菌crisprtype?i-b基因編輯及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、熱葡糖苷酶地芽孢桿菌11955作為下一代工業(yè)生物技術(shù)底盤(pán)細(xì)胞在節(jié)能降耗方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。例如使用此菌株來(lái)進(jìn)行高溫發(fā)酵能避免常溫菌的污染；無(wú)需大量的冷缺水對(duì)來(lái)對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行降溫；高溫條件下發(fā)酵還能加快反應(yīng)速度，從而減少發(fā)酵周期；高溫條件下還能增加底物的擴(kuò)散，電離和溶解度。此菌株已經(jīng)被用于開(kāi)發(fā)生產(chǎn)多種化學(xué)品，如乙醇，異丙醇，核黃素等。但是高效遺傳工具的匱乏嚴(yán)重制約熱葡糖苷酶地芽孢桿菌11955工程菌株的開(kāi)發(fā)。盡管已有研究者開(kāi)發(fā)了基于同源重組或者crispr/cas9的編輯方法，但是依然面臨著編輯效率低或者異源蛋白有潛在毒性，pam序列過(guò)長(zhǎng)等問(wèn)題。

2、目前熱葡糖苷酶地芽孢桿菌11955的基因編輯工具包括基于熒光蛋白標(biāo)記或者pyrf營(yíng)養(yǎng)缺陷的反向篩選的同源重組的方法。但由于此方法沒(méi)有對(duì)基因組造成破壞，因此發(fā)生同源重組的概率低，需要費(fèi)時(shí)費(fèi)力才能拿到編輯菌株。也有研究者開(kāi)發(fā)了基于異源高溫cas9的crispr-cas9系統(tǒng)(包括stcas91和stcas93蛋白)，兩個(gè)cas9蛋白的pam序列分別為5’-nnagaaw-3’和5’-nggng-3’。都面臨著pam序列過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致某些基因靶標(biāo)沒(méi)有pam位點(diǎn)而無(wú)法編輯的問(wèn)題，而且異源cas9蛋白還有潛在的毒性。更重要的是，目前熱葡糖苷酶地芽孢桿菌11955尚未有基因調(diào)控工具被發(fā)開(kāi)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供熱葡糖苷酶地芽孢桿菌crispr?type?i-b基因編輯及其應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，第一方面，本發(fā)明提供一種熱葡糖苷酶地芽孢桿菌crisprtype?i-b基因編輯載體，所述基因編輯載體的sgrna作用位點(diǎn)的dna序列為5’-tta-nx-3’；其中tta為pam序列；n表示堿基a、t、g或c，x為27～40之間的整數(shù)。

3、本發(fā)明所述的熱葡糖苷酶地芽孢桿菌為ncimb?11955。

4、進(jìn)一步地，所述基因編輯載體包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為pxyla。也可以使用纖維二糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子cellobiose-inducible?promoter(pβglu)，參考文獻(xiàn)(modular?system?for?assessment?of?glycosyl?hydrolase?secretion?ingeobacillus?thermoglucosidasius)。所述纖維二糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子的序列如下：

5、

6、第二方面，本發(fā)明提供一種熱葡糖苷酶地芽孢桿菌crispr?type?i-b基因編輯系統(tǒng)，所述基因編輯系統(tǒng)包括所述基因編輯載體和含有熱葡糖苷酶地芽孢桿菌cas1～cas8蛋白(ncbi編號(hào)分別為cas8：bcv53_05155，cas7：bcv53_05160，cas5：bcv53_05165，cas3：bcv53_05170，cas4：bcv53_05175，cas1：bcv53_05180，cas2：bcv53_05185，cas6：bcv53_05190)的表達(dá)體系(在熱葡糖苷酶地芽孢桿菌的染色體上)或表達(dá)載體；任選包括供體載體。

7、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述基因編輯載體的構(gòu)建方法如下：

8、a、質(zhì)粒pzh01的構(gòu)建

9、a1、使用引物repb-f(ccctttcgtccacagcttgtctgtaagcgg)和repb-r(aaggaacttgcgaattcactggccgtcgttttac)以及引物amp-f(caggtgtcctaagcttggcgtaatcatgg)和amp-r(acaagctgtggacgaaagggcctcgtgatac)，以pub-sfgfp質(zhì)粒為模板分別pcr擴(kuò)增得到repb片段和amp片段；

10、a2、使用引物xylr-f(agtgaattcgcaagttcctttcgccgcaaaaatg)和xylr-r(cgccaagcttaggacacctgattagactgc)，以熱葡糖苷酶地芽孢桿菌ncimb?11955基因組為模板pcr擴(kuò)增得到xylr片段；

11、a3、將三個(gè)片段進(jìn)行g(shù)ibson組裝得到中間質(zhì)粒pxylr；

12、a4、使用引物dbt-f(tctcgtttgtatcttacctatgaggaattgaaaccaggcatcaaataaaacgaaag)和dbt-r(gcatgcgagtcactaagggctaactaac)，以pub-sfgfp質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到終止子片段；使用引物lacz-f和lacz-r，以pcas質(zhì)粒為模板pcr擴(kuò)增得到lacz片段；使用引物pxyla-f(gagctccataaactttgtttgtacactagacaaacaaatttaaccgcattataatttag)和pxyla-r(cgtctcgtttcaattcctcataggtaagatacaaaccaactaaattataatgcggttaa)直接退火得到pxyla片段；使用引物pzh01v-f(gcccttagtgactcgcatgccacagcttgtctgtaagcgg)和pzh01v-r(aaacaaagtttatggagctcgacgaaagggcctcgtgatac)，以中間質(zhì)粒pxylr為模板擴(kuò)增得到載體片段；然后將終止子片段，lacz片段，pxyla片段和載體片段使用gibson組裝的方法得到質(zhì)粒pzh01；

13、b、設(shè)計(jì)并合成針對(duì)所述sgrna作用位點(diǎn)的正向單體5’-nx-3’和反向單體5’--n’x-3’；其中n’x為nx的反向互補(bǔ)序列，n和n’表示堿基a、t、g或c；

14、將上述兩個(gè)單體退火形成具有粘性末端的雙鏈dna；

15、c、使用esp3i酶切質(zhì)粒pzh01得到骨架載體，然后使用t4連接酶將骨架載體與具有粘性末端的雙鏈dna進(jìn)行連接得到基因編輯載體；

16、所述含有熱葡糖苷酶地芽孢桿菌cas1～cas8蛋白的表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下：使用引物ib-f(tacggggtctgacgcaaccccaactaagggcagtc)和ib-r(cctttgggaagtttgtgcgctattagggatcgacg)，以熱葡糖苷酶地芽孢桿菌ncimb?11955的基因組為模板，pcr擴(kuò)增得到插入片段；使用引物pnw33-f(atccctaatagcgcacaaacttcccaaaggcgagc)和pnw33-r(cccttagttggggttgcgtcagaccccgtagaaaa)，以pthermocas9_ctrl質(zhì)粒為模板，pcr擴(kuò)增得到骨架質(zhì)粒，然后將插入片段與骨架質(zhì)粒連接即得(質(zhì)粒pcasib)。

17、第三方面，本發(fā)明提供一種熱葡糖苷酶地芽孢桿菌crispr?type?i-b基因沉默載體，所述基因沉默載體的sgrna作用位點(diǎn)的dna序列為5’-tta-nx-3’；其中tta為pam序列；n表示堿基a、t、g或c，x為11～26之間的整數(shù)。

18、進(jìn)一步地，所述基因沉默載體包含組成型啟動(dòng)子。例如，所述組成型啟動(dòng)子為pldh或prplswt。

19、第四方面，本發(fā)明提供一種熱葡糖苷酶地芽孢桿菌crispr?type?i-b基因沉默系統(tǒng)，所述基因沉默系統(tǒng)包括所述基因沉默載體和含有熱葡糖苷酶地芽孢桿菌cas1～cas8蛋白的表達(dá)載體。

20、在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述基因沉默載體的構(gòu)建方法如下：

21、a、質(zhì)粒pzh04的構(gòu)建

22、a1、使用引物repeat1f(aagcattgtcgtttgtatcttacctatgaggaattgaaacgaga)和repeat1r(ggcgatgcggccgccgatggtctcgtttcaattcctcata)以及引物repeat2f(ccatcggcggccgcatcgccatggactgggtctccgtttgtatcttacct)和repeat?2r(gatgcctggcgtttcaattcctcataggtaagatacaaacggaga)，直接退火得到片段repat?1和片段repeat?2；

23、a2、使用引物prplswt-f(cagtgaattcaacaatcgttaaagcggacg)和prplswt-r(agatacaaacgacaatgctttttcatcattg)，以熱葡糖苷酶地芽孢桿菌ncimb?11955基因組為模板擴(kuò)增得到啟動(dòng)子片段prpls；

24、a3、使用引物t-f(gaattgaaacgccaggcatcaaataaaacg)和t-r(tagaggatccgagtcactaagggctaactaac)，以pub-sfgfp質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到終止子片段；

25、a4、使用引物pzh04v-f(ttagtgactcggatcctctagagtcgacctg)和pzh04v-r(aacgattgttgaattcactggccgtcgttttac)，以pucg3.8質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到載體片段；

26、a5、將片段repat?1，片段repeat?2，啟動(dòng)子片段prplswt，終止子片段和載體片段使用gibson組裝得到質(zhì)粒pzh04；

27、b、設(shè)計(jì)并合成針對(duì)所述sgrna作用位點(diǎn)的正向單體5’-nx-3’和反向單體5’--n’x-3’；其中n’x為nx的反向互補(bǔ)序列，n和n’表示堿基a、t、g或c；

28、將上述兩個(gè)單體退火形成具有粘性末端的雙鏈dna；

29、c、使用bsai酶切質(zhì)粒pzh04得到骨架載體，然后使用t4連接酶將骨架載體與具有粘性末端的雙鏈dna進(jìn)行連接得到基因沉默載體。

30、第五方面，本發(fā)明提供所述基因編輯載體或所述基因編輯系統(tǒng)在宿主基因編輯中的應(yīng)用。

31、第六方面，本發(fā)明提供所述基因沉默載體或所述基因沉默系統(tǒng)在宿主基因沉默中的應(yīng)用。

32、所述宿主包括但不限于嗜熱菌、真核宿主細(xì)胞、原核宿主細(xì)胞(如大腸桿菌)。

33、本發(fā)明提供的基因編輯系統(tǒng)或基因沉默系統(tǒng)在37℃-70℃有活性。

34、借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

35、(一)本發(fā)明首次在熱葡糖苷酶地芽孢桿菌11955中發(fā)現(xiàn)了可以用來(lái)調(diào)控基因表達(dá)的工具，本發(fā)明聚焦于沒(méi)有毒性的內(nèi)源crispr?type?i-b系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)基于內(nèi)源crispr?typei-b系統(tǒng)的基因編輯和基因調(diào)控工具。

36、(二)本發(fā)明通過(guò)建立內(nèi)源crispr?type?i-b系統(tǒng)的基因編輯方法，有效解決了基于反向篩選的同源重組基因編輯方法面臨的編輯效率低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力的問(wèn)題，解決了異源crispr-cas9系統(tǒng)面臨潛在蛋白毒性和pam序列過(guò)長(zhǎng)的問(wèn)題。使用內(nèi)源type?i-b系統(tǒng)僅需3個(gè)堿基的pam序列長(zhǎng)度(5’-tta-3’)，而且此系統(tǒng)的基因敲除和基因敲入效率均超過(guò)95％，遠(yuǎn)高于基因同源重組理論最大的50％的編輯效率。

37、(三)本發(fā)明首次在菌株11955中開(kāi)發(fā)了基于內(nèi)源crispr?type?i-b系統(tǒng)的基因調(diào)控工具。此調(diào)控工具相比于在其他菌株中開(kāi)發(fā)的內(nèi)源type?i-b系統(tǒng)需要敲除cas3核酸酶才能進(jìn)行基因調(diào)控的方法，只需要改變guide?rna中spacer的長(zhǎng)度即可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的調(diào)控而不是切割，極大簡(jiǎn)化了內(nèi)源type?i系統(tǒng)用于基因調(diào)控的操作。

38、(四)本發(fā)明基于內(nèi)源crispr?type?i-b系統(tǒng)的基因編輯和基因調(diào)控工具的開(kāi)發(fā)，將極大地促進(jìn)對(duì)此菌株基因功能和遺傳特性的基礎(chǔ)研究和此菌株作為工程菌株開(kāi)發(fā)的工業(yè)化研究。