本發(fā)明涉及微生物，尤其涉及提高酵母對(duì)丁二酸耐受性的方法和丁二酸耐受性提高的酵母菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、丁二酸是重要的平臺(tái)化合物，廣泛用于可降解生物基材料的生產(chǎn)，也可以作為食品防腐劑，還可以用于生產(chǎn)涂料、洗滌劑、牙膏，染料、粘合劑以及鎮(zhèn)靜劑、利尿劑、止血藥、抗生素和維生素等醫(yī)藥產(chǎn)品，具有廣泛的用途。解脂耶氏酵母是生產(chǎn)丁二酸的重要宿主酵母菌株。目前已有利用代謝工程改造提升丁二酸產(chǎn)量的研究，但是，高濃度有機(jī)酸是否對(duì)生產(chǎn)菌株存在毒性以及如何緩解有機(jī)酸對(duì)菌株的毒性問題目前卻少有研究。除丁二酸外，丙酸、戊二酸、檸檬酸、蘋果酸、丙二酸等有機(jī)酸也在不同領(lǐng)域具有重要的用途，解脂耶氏酵母也可以用于生產(chǎn)多種有機(jī)酸(fickers?p,cheng?h,sze?ki?lin?c.sugar?alcohols?andorganic?acids?synthesis?in?yarrowia?lipolytica:where?are?we？microorganisms.2020,8(4):574)。因此，提高解脂耶氏酵母等微生物對(duì)丁二酸的耐受性對(duì)于有機(jī)酸或其衍生物的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供具有提高微生物對(duì)丁二酸耐受性的酵母蛋白，以及利用該蛋白提高丁二酸耐受性的方法。

2、本發(fā)明的另一目的是提供丁二酸耐受性提高的酵母菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

3、本發(fā)明在對(duì)酵母菌產(chǎn)丁二酸過程的研究中意外地發(fā)現(xiàn)，雖然酵母菌與細(xì)菌相比，具有更強(qiáng)的低ph耐受性，但是，丁二酸本身仍會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生較大的抑制作用。為解決上述問題，本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)獲得添加丁二酸和不添加丁二酸條件的菌株的轉(zhuǎn)錄組，并針對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一些基因的轉(zhuǎn)錄在丁二酸脅迫條件下出現(xiàn)明顯下調(diào)，在這些基因中初步篩選得到一些候選基因，通過質(zhì)粒過表達(dá)的方式在酵母菌株中進(jìn)行功能驗(yàn)證，檢測(cè)候選基因?qū)湍妇陮?duì)丁二酸的耐受性的影響。經(jīng)篩選，獲得一個(gè)未知功能蛋白，過表達(dá)該蛋白的編碼基因后能夠明顯提高菌株在高濃度丁二酸中的生長(zhǎng)速率，由此獲得的重組菌株可作為良好的出發(fā)菌株，有利于實(shí)現(xiàn)高濃度丁二酸的發(fā)酵生產(chǎn)。

4、具體地，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

5、第一方面，本發(fā)明提供酵母蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料在提高微生物對(duì)丁二酸的耐受性中的應(yīng)用；

6、所述酵母蛋白為以下(1)-(3)中的任意一種蛋白：

7、(1)氨基酸序列如seq?id?no.1所示的蛋白；

8、(2)將(1)所示的蛋白經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與(1)所示的蛋白具有80％以上相似性且具有提高酵母對(duì)丁二酸的耐受性功能的蛋白；

9、(3)在(1)或(2)的蛋白的n末端和/或c末端連接蛋白質(zhì)標(biāo)簽得到的蛋白。

10、上述應(yīng)用中，微生物對(duì)丁二酸的耐受性是指菌株耐受丁二酸的能力，包括：菌株在丁二酸存在條件下的生長(zhǎng)、代謝以及目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)等性能。

11、第二方面，本發(fā)明提供酵母蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料在構(gòu)建用于發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸或其衍生物的微生物中的應(yīng)用；

12、所述酵母蛋白為以下(1)-(3)中的任意一種蛋白：

13、(1)氨基酸序列如seq?id?no.1所示的蛋白；

14、(2)將(1)所示的蛋白經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與(1)所示的蛋白具有80％以上相似性且具有提高酵母對(duì)丁二酸的耐受性功能的蛋白；

15、(3)在(1)或(2)的蛋白的n末端和/或c末端連接蛋白質(zhì)標(biāo)簽得到的蛋白。

16、上述應(yīng)用中，所述有機(jī)酸包括丁二酸、丙酸、丙二酸、丙酮酸、乳酸、蘋果酸、富馬酸、丁酸、衣康酸、α-酮戊二酸、戊二酸、木糖醛酸、檸檬酸、粘康酸、葡萄糖酸、己二酸等。優(yōu)選為丁二酸。

17、所述有機(jī)酸衍生物包括甲基有機(jī)酸等。其中，丁二酸的衍生物包括甲基丁二酸、二甲基丁二酸等。

18、第三方面，本發(fā)明提供酵母蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料在提高微生物在酸脅迫條件下的生長(zhǎng)和/或發(fā)酵性能中的應(yīng)用；

19、所述酵母蛋白為以下(1)-(3)中的任意一種蛋白：

20、(1)氨基酸序列如seq?id?no.1所示的蛋白；

21、(2)將(1)所示的蛋白經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與(1)所示的蛋白具有80％以上相似性且具有提高酵母對(duì)丁二酸的耐受性功能的蛋白；

22、(3)在(1)或(2)的蛋白的n末端和/或c末端連接蛋白質(zhì)標(biāo)簽得到的蛋白。

23、上述應(yīng)用中，所述酸脅迫包括有機(jī)酸脅迫和/或低ph脅迫。

24、第四方面，本發(fā)明提供酵母蛋白或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料在提高微生物在丁二酸存在條件下的生長(zhǎng)和/或發(fā)酵性能中的應(yīng)用；

25、所述酵母蛋白為以下(1)-(3)中的任意一種蛋白：

26、(1)氨基酸序列如seq?id?no.1所示的蛋白；

27、(2)將(1)所示的蛋白經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與(1)所示的蛋白具有80％以上相似性且具有提高酵母對(duì)丁二酸的耐受性功能的蛋白；

28、(3)在(1)或(2)的蛋白的n末端和/或c末端連接蛋白質(zhì)標(biāo)簽得到的蛋白。

29、上述應(yīng)用中，發(fā)酵性能包括目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率、單位時(shí)間產(chǎn)量等。優(yōu)選地，所述發(fā)酵性能為有機(jī)酸的發(fā)酵性能；更優(yōu)選為丁二酸的發(fā)酵性能。

30、上述應(yīng)用中，丁二酸存在條件中，丁二酸的濃度優(yōu)選為大于0g/l且小于200g/l。更優(yōu)選為大于0g/l且小于100g/l。

31、本發(fā)明中，氨基酸序列如seq?id?no.1所示的蛋白為genbank登錄號(hào)為cag83784.1(yali0_a07997p)的蛋白，來源于解脂耶氏酵母。

32、將(1)所示的蛋白經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與(1)所示的蛋白具有80％以上相似性且具有提高酵母對(duì)丁二酸的耐受性功能的蛋白可為與(1)中所示的蛋白具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％的序列相似性的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的蛋白。

33、本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，在如seq?id?no.1所示序列的n端和/或c端添加蛋白標(biāo)簽通常不會(huì)影響seq?id?no.1的結(jié)構(gòu)和功能。因此上述(3)中的蛋白具有與(1)中蛋白相同或相當(dāng)?shù)墓δ芎突钚?，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

34、上述蛋白標(biāo)簽包括但不限于his-tag、gst、trx、sumo、mbp、strep、flag等標(biāo)簽。

35、本發(fā)明中，氨基酸序列如seq?id?no.1所示的蛋白的編碼基因序列如seq?id?no.2所示。根據(jù)以上所述的酵母蛋白的氨基酸序列和密碼子規(guī)則，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠獲得其編碼基因的核苷酸序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，編碼基因的核苷酸序列并不唯一，所有能夠編碼上述酵母蛋白的基因均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

36、本發(fā)明中，所述生物材料為表達(dá)盒、載體或宿主細(xì)胞。

37、以上所述的編碼基因與啟動(dòng)子和/或終止子可操作性地連接可得到表達(dá)盒。

38、以上所述的載體包括但不限于質(zhì)粒載體、病毒載體等。

39、以上所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選為微生物細(xì)胞，包括但不限于酵母、埃希氏菌屬細(xì)菌、棒桿菌屬細(xì)菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌。

40、以上所述的應(yīng)用中，所述微生物為選自酵母、埃希氏菌屬細(xì)菌、棒桿菌屬細(xì)菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌中的任一種。

41、優(yōu)選地，所述微生物為解脂耶氏酵母、大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌。

42、以上所述的應(yīng)用通過增強(qiáng)所述酵母蛋白的表達(dá)和/或酶活性實(shí)現(xiàn)。

43、其中，所述表達(dá)和/或酶活性增強(qiáng)通過以下(1)-(7)中的任意一種或多種方式的組合實(shí)現(xiàn)：

44、(1)通過導(dǎo)入含有所述酵母蛋白的編碼基因的質(zhì)粒而增強(qiáng)；

45、(2)通過增加染色體上所述酵母蛋白的編碼基因的拷貝數(shù)而增強(qiáng)；

46、(3)通過改變?nèi)旧w上所述酵母蛋白的編碼基因的啟動(dòng)子序列而增強(qiáng)；

47、(4)通過將強(qiáng)啟動(dòng)子與染色體上所述酵母蛋白的編碼基因可操作地連接而增強(qiáng)；

48、(5)通過改變?nèi)旧w上所述酵母蛋白的編碼基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列而增強(qiáng)；

49、(6)通過改變菌株表達(dá)所述酵母蛋白的氨基酸序列而增強(qiáng)；

50、(7)通過改變?nèi)旧w上所述酵母蛋白的編碼基因的核苷酸序列而增強(qiáng)。

51、第五方面，本發(fā)明提供一種重組解脂耶氏酵母，所述重組解脂耶氏酵母被修飾以使得其中酵母蛋白的表達(dá)和/或酶活性增強(qiáng)

52、所述酵母蛋白為以下(1)-(3)中的任意一種蛋白：

53、(1)氨基酸序列如seq?id?no.1所示的蛋白；

54、(2)將(1)所示的蛋白經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與(1)所示的蛋白具有80％以上相似性且具有提高酵母對(duì)丁二酸的耐受性功能的蛋白；

55、(3)在(1)或(2)的蛋白的n末端和/或c末端連接蛋白質(zhì)標(biāo)簽得到的蛋白。

56、優(yōu)選地，所述表達(dá)和/或酶活性增強(qiáng)通過以下(1)-(7)中的任意一種或多種方式的組合實(shí)現(xiàn)：

57、(1)通過導(dǎo)入含有所述酵母蛋白的編碼基因的質(zhì)粒而增強(qiáng)；

58、(2)通過增加染色體上所述酵母蛋白的編碼基因的拷貝數(shù)而增強(qiáng)；

59、(3)通過改變?nèi)旧w上所述酵母蛋白的編碼基因的啟動(dòng)子序列而增強(qiáng)；

60、(4)通過將強(qiáng)啟動(dòng)子與染色體上所述酵母蛋白的編碼基因可操作地連接而增強(qiáng)；

61、(5)通過改變?nèi)旧w上所述酵母蛋白的編碼基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列而增強(qiáng)；

62、(6)通過改變菌株表達(dá)所述酵母蛋白的氨基酸序列而增強(qiáng)；

63、(7)通過改變?nèi)旧w上所述酵母蛋白的編碼基因的核苷酸序列而增強(qiáng)。

64、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在解脂耶氏酵母中導(dǎo)入含有氨基酸如seq?id?no.1所示酵母蛋白的編碼基因的質(zhì)粒，得到重組解脂耶氏酵母。

65、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在解脂耶氏酵母的染色體上插入一個(gè)或多個(gè)拷貝的氨基酸如seq?id?no.1所示酵母蛋白的編碼基因，得到重組解脂耶氏酵母。

66、上述重組解脂耶氏酵母構(gòu)建的出發(fā)菌株可為包括解脂耶氏酵母野生型菌株、能夠積累有機(jī)酸(例如丁二酸)的解脂耶氏酵母工程菌或解脂耶氏酵母誘變菌株等任意解脂耶氏酵母。

67、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述出發(fā)菌株為解脂耶氏酵母polf菌株，該菌株為解脂耶氏酵母標(biāo)準(zhǔn)菌株(atcc編號(hào)may-2613，基因型mata?ura3-302?leu2-270?xpr-322axp2-deltanu49?xpr2::suc2，購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心atcc)。

68、第六方面，本發(fā)明提供以上所述的重組解脂耶氏酵母的構(gòu)建方法，所述方法包括：對(duì)解脂耶氏酵母進(jìn)行修飾以使得其中的所述酵母蛋白的表達(dá)和/或酶活性增強(qiáng)。

69、上述菌株的構(gòu)建方法可采用常規(guī)的基因工程技術(shù)手段進(jìn)行。

70、第七方面，本發(fā)明提供以上所述的重組解脂耶氏酵母在發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸或其衍生物中的應(yīng)用。

71、上述發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸或其衍生物的方法包括：培養(yǎng)所述重組解脂耶氏酵母獲得培養(yǎng)液，從培養(yǎng)液中收集有機(jī)酸或其衍生物。

72、所述有機(jī)酸包括丁二酸、丙酸、丙二酸、丙酮酸、乳酸、蘋果酸、富馬酸、丁酸、衣康酸、α-酮戊二酸、戊二酸、木糖醛酸、檸檬酸、粘康酸、葡萄糖酸、己二酸等。優(yōu)選為丁二酸。

73、所述有機(jī)酸衍生物包括甲基有機(jī)酸等。其中，丁二酸的衍生物包括甲基丁二酸、二甲基丁二酸等。

74、第八方面，本發(fā)明提供一種提高微生物對(duì)丁二酸的耐受性的方法，所述方法包括：對(duì)微生物進(jìn)行修飾以使得其中酵母蛋白的表達(dá)和/或酶活性增強(qiáng)；

75、所述酵母蛋白為以下(1)-(3)中的任意一種蛋白：

76、(1)氨基酸序列如seq?id?no.1所示的蛋白；

77、(2)將(1)所示的蛋白經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與(1)所示的蛋白具有80％以上相似性且具有提高酵母對(duì)丁二酸的耐受性功能的蛋白；

78、(3)在(1)或(2)的蛋白的n末端和/或c末端連接蛋白質(zhì)標(biāo)簽得到的蛋白。

79、本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了能夠有效提升微生物對(duì)丁二酸耐受性的蛋白及其編碼基因，通過在菌株中過表達(dá)該蛋白的編碼基因，菌株的丁二酸耐受性顯著提高，能夠耐受高濃度丁二酸較好地生長(zhǎng)。

80、本發(fā)明構(gòu)建的重組酵母菌對(duì)丁二酸的耐受性顯著提高，適于作為丁二酸等有機(jī)酸的生產(chǎn)菌株的出發(fā)菌株，用于構(gòu)建高產(chǎn)丁二酸等有機(jī)酸的菌株，提高菌株在高濃度丁二酸存在條件下的生長(zhǎng)和丁二酸等有機(jī)酸的生產(chǎn)性能。