本發(fā)明屬于發(fā)酵領域，具體涉及無需抗生素的產3’-唾液酸乳糖的工程菌及其構建方法及其應用。

背景技術：

1、人乳寡糖(human?milk?oligosaccharides，hmos)是存在于母乳中的一類重要低聚糖，由五種單體糖加乳糖分子在特異的糖基轉移酶的作用下以各種不同的組合排列構成，目前已確定結構的hmos超過30多種。研究表明，hmos可以作為益生元影響腸道微生物群的內在成分，維持腸道微生物環(huán)境平衡；hmos及其代謝產物(如唾液酸等)在大腦發(fā)育、神經傳遞和突觸形成中起著重要的作用，具有促進嬰幼兒大腦發(fā)育及提高認知等方面的功能；此外，hmos還具有抗病毒、免疫調節(jié)和促進人體康復等作用。

2、目前主要發(fā)現(xiàn)的人乳寡糖的種類包括巖藻糖基化hmos和唾液酸化hmos。在唾液酸化的hmos中，唾液酸乳糖的含量最高，包含3’-唾液酸乳糖(3’-sialyllactose，3’-sl)和6’-唾液酸乳糖(6’-sialyllactose，6’-sl)，3’-sl和6’-sl分別是由唾液酸和乳糖作為前體物質以α-2,3或α-2,6糖苷鍵連接而成，3’-sl和6’-sl的結構式分別如式i和式ii所示：

3、

4、目前關于唾液酸乳糖的生產方法包括化學合成法、酶催化合成法等方式，化學合成法需要昂貴的原料、反應條件嚴苛、成本較高以及產率較低。相比化學合成法，酶催化合成法雖然具有較高的產率，但是酶催化反應需要使用昂貴的酶，故綜合生產成本高，并且在酶催化反應中，酶較容易失活，從而影響到酶催化效率和產物的產率，故該方法也難以實現(xiàn)大規(guī)模生產。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術的3’-唾液酸乳糖在合成時產量較低的問題，提供了無需抗生素且高產3’-唾液酸乳糖的工程菌及其構建方法和應用。

2、本文的大腸桿菌ebsl005菌株(又稱slis109菌株)已經于2023年8月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，保藏號為cgmcc?no.:28244，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；分類命名為大腸埃希氏菌(escherichia?coli)。

3、在一個方面，本發(fā)明提供了一種基因工程菌，其具有產生3’-唾液酸乳糖的能力，并且具有udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸轉移酶基因(st)，其中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸轉移酶基因(st)彼此獨立整合或以任意組合共同整合于所述基因工程菌的基因組中，或者，存在于所述基因工程菌攜帶的重組質粒中。

4、在一個實施方案中，基因工程菌具有引入的外源udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶基因(neuc)、外源唾液酸合酶基因(neub)、外源n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶基因(css)和外源α-2,3-唾液酸轉移酶基因(st)。其中，引入的外源udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶基因(neuc)、引入的外源唾液酸合酶基因(neub)、引入的外源n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶基因(css)和引入的外源α-2,3-唾液酸轉移酶基因(st)彼此獨立整合或以任意組合共同整合于所述基因工程菌的基因組中，或者，存在于所述基因工程菌攜帶的重組質粒中。

5、在一個實施方案中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸轉移酶基因(st)以分別連接了單獨的第一啟動子和/或終止子的方式整合于所述基因工程菌的基因組中，或者存在于所述基因工程菌攜帶的重組質粒中。

6、在一個實施方案中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸轉移酶基因(st)中的任意2種、3種或4種基因以共同連接了第一啟動子和/或終止子的方式整合于所述基因工程菌的基因組中，或者共同存在于所述基因工程菌攜帶的重組質粒中。

7、在一個實施方案中，所述第一啟動子為t2啟動子。在一個實施方案中，所述終止子為t7終止子。

8、在一個實施方案中，所述重組質粒以ptu2作為骨架質粒。

9、在一個實施方案中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸轉移酶基因(st)以各自分別連接了單獨的第一啟動子和/或終止子的方式作為一個基因組合，或者以共同連接了第一啟動子和/或終止子的方式作為一個基因組合插入到基因工程菌的基因組的一個或多個插入序列1(is1)處。

10、在一個實施方案中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸轉移酶基因(st)作為一個基因組合在所述插入序列1(is1)處的拷貝數為10-28、12-26或14-22，例如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。

11、在一個實施方案中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶包含：如seq?id?no:82所示的氨基酸序列，或與seq?id?no:82所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

12、在一個實施方案中，唾液酸合酶包含：如seq?id?no:83所示的氨基酸序列，或與seq?id?no:83所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

13、在一個實施方案中，n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶包含：如seq?id?no:84所示的氨基酸序列，或與seq?id?no:84所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

14、在一個實施方案中，α-2,3-唾液酸轉移酶包含：如seq?id?no:85所示的氨基酸序列，或與seq?id?no:85所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

15、在一個實施方案中，基因工程菌以一種或多種如下的方式進行了修飾：

16、(1)基因工程菌修飾為增加葡萄糖胺-6-磷酸的生成量；

17、(2)基因工程菌修飾為使胞苷-5’-三磷酸持續(xù)循環(huán)再生；

18、(3)基因工程菌修飾為失活或阻斷n-乙酰甘露糖胺(mannac)的旁路分解途徑；

19、(4)基因工程菌修飾為失活或阻斷磷酸烯醇式丙酮酸的旁路分解途徑；和

20、(5)基因工程菌修飾為增加參與寡糖轉運途徑的蛋白的表達或活性。

21、(6)基因工程菌修飾為降低或消除內源β-半乳糖苷酶的表達或活性。

22、(7)基因工程菌修飾為降低或消除n-乙酰神經氨酸的旁路分解途徑。

23、在一個實施方案中，基因工程菌為埃希氏菌屬的細菌，優(yōu)選為大腸桿菌，更優(yōu)選為大腸桿菌bl21(de3)菌株。

24、在一個實施方案中，基因工程菌以一種或多種如下的方式進行了修飾：

25、(8)基因工程菌修飾為降低或消除6-磷酸果糖激酶(pfka)的表達或活性；

26、(9)基因工程菌修飾為增加葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)的表達或活性；

27、(10)基因工程菌修飾為降低或消除n-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙?；?naga)和/或葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶(nagb)的表達或活性；

28、(11)基因工程菌修飾為增加胞苷單磷酸激酶(cmk)和多磷酸激酶(ppk)的表達或活性；

29、(12)基因工程菌修飾為降低或消除丙酮酸激酶(pyka)的表達或活性；

30、(13)基因工程菌修飾為增加寡糖轉運蛋白的表達或活性；

31、(14)基因工程菌修飾為降低或消除n-乙酰神經氨酸醛縮酶(nana)的表達或活性；

32、(15)基因工程菌修飾為降低或消除n-乙酰甘露糖胺激酶(nank)的表達或活性；

33、(16)基因工程菌修飾為降低或消除n-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向異構酶(nane)的表達或活性；

34、(17)基因工程菌修飾為降低或消除β-半乳糖苷酶(lacz)的表達或活性。

35、在一個實施方案中，基因工程菌缺失了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因。

36、在一個實施方案中，基因工程菌過表達了葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因。

37、在一個實施方案中，基因工程菌缺失了葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶(nagb)基因。

38、在一個實施方案中，基因工程菌缺失了n-乙酰甘露糖胺激酶(nank)基因。

39、在一個實施方案中，基因工程菌缺失了n-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向異構酶(nane)基因。

40、在一個實施方案中，基因工程菌缺失了n-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙?；?naga)基因。

41、在一個實施方案中，基因工程菌過表達了胞苷單磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因。

42、在一個實施方案中，基因工程菌缺失了n-乙酰神經氨酸醛縮酶(nana)基因。

43、在一個實施方案中，基因工程菌缺失了丙酮酸激酶(pyka)基因。

44、在一個實施方案中，基因工程菌過表達了寡糖轉運蛋白setb基因。

45、在一個實施方案中，基因工程菌缺失了β-半乳糖苷酶(lacz)基因。

46、在一個實施方案中，所述缺失了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因為：對6-磷酸果糖激酶(pfka)基因進行部分核苷酸序列的敲除，所述部分核苷酸序列的敲除包括：在5’端保留的核苷酸序列長度占6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的全部核苷酸序列長度的0％-7％，在3’端保留的核苷酸序列長度占6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的全部核苷酸序列長度的70％-80％。

47、在一個實施方案中，葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)包含：seq?id?no:89所示的氨基酸序列或與seq?id?no:89具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

48、在一個實施方案中，所述過表達了葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因為：將所述葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因整合到基因工程菌的基因組中。

49、在一個實施方案中，所述缺失了丙酮酸激酶(pyka)基因為：對丙酮酸激酶(pyka)基因進行部分核苷酸序列的敲除，所述部分核苷酸序列的敲除包括：在5’端保留的核苷酸序列長度占丙酮酸激酶(pyka)基因的全部核苷酸序列長度的4％-5.5％，在3’端保留的核苷酸序列長度占丙酮酸激酶(pyka)基因的全部核苷酸序列長度的10％-20％。

50、在一個實施方案中，胞苷單磷酸激酶(cmk)包含：seq?id?no:91所示的氨基酸序列或與seq?id?no:91具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；多磷酸激酶(ppk)包含：seq?id?no:90所示的氨基酸序列或與seq?id?no:90具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

51、在一個實施方案中，過表達了胞苷單磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因為：將所述胞苷單磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因整合到基因工程菌的基因組中。

52、在一個實施方案中，所述寡糖轉運蛋白setb包含：seq?id?no:93所示的氨基酸序列或與seq?id?no:93具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

53、在一個實施方案中，過表達了寡糖轉運蛋白setb基因包括：將所述寡糖轉運蛋白setb基因整合到基因工程菌的基因組中。

54、在一個實施方案中，在敲除了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的部分核苷酸序列的條件下，所述葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因插入所述6-磷酸果糖激酶(pfka)基因被敲除的位置。

55、在一個實施方案中，基因工程菌缺失了蜜二糖通透酶(melb)基因，所述胞苷單磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因插入所述蜜二糖通透酶(melb)基因被敲除的位置。

56、在一個實施方案中，在敲除了丙酮酸激酶基因(pyka)基因的部分核苷酸序列的條件下，所述寡糖轉運蛋白setb基因插入所述丙酮酸激酶基因(pyka)基因中被敲除的位置。

57、在一個實施方案中，胞苷單磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因以各自連接了單獨的第二啟動子的方式或者以共同連接了第二啟動子的方式插入所述蜜二糖通透酶(melb)基因被敲除的位置。

58、在一個實施方案中，胞苷單磷酸激酶(cmk)基因位于多磷酸激酶(ppk)基因的上游。在一個實施方案中，所述第二啟動子為t5啟動子或四環(huán)素啟動子tet。

59、在另一個方面，提供了一種大腸桿菌菌株，其保藏號為cgmcc?no.:28244。

60、在另一個方面，提供了一種如本文所述的基因工程菌或如本文所述的大腸桿菌菌株在以葡萄糖或甘油為碳源生產3’-唾液酸乳糖中的應用。

61、在另一個方面，提供了構建具有產生3’-唾液酸乳糖的能力的基因工程菌的方法，其包括：將udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸轉移酶基因(st)彼此獨立整合到或以任意組合共同整合到宿主菌體的基因組中，得到基因工程菌；或者，

62、將udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸轉移酶基因(st)共同導入骨架質粒中，得到重組質粒；將所述重組質粒導入到宿主菌體中，得到基因工程菌。

63、在一個實施方案中，構建具有產生3’-唾液酸乳糖的能力的基因工程菌的方法包括：將引入的外源udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶基因(neuc)、引入的外源唾液酸合酶基因(neub)、引入的外源n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶基因(css)和引入的外源α-2,3-唾液酸轉移酶基因(st)彼此獨立整合到或以任意組合共同整合到宿主菌體的基因組中，得到基因工程菌；或者，

64、將引入的外源udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶基因(neuc)、引入的外源唾液酸合酶基因(neub)、引入的外源n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶基因(css)和引入的外源α-2,3-唾液酸轉移酶基因(st)共同導入骨架質粒中，得到重組質粒；將所述重組質粒導入到宿主菌體中，得到基因工程菌。

65、在一個實施方案中，所述宿主菌體為埃希氏菌屬的細菌，優(yōu)選為大腸桿菌，更優(yōu)選為大腸桿菌bl21(de3)菌株。

66、在一個實施方案中，構建具有產生3’-唾液酸乳糖的能力的基因工程菌的方法還包括：將宿主菌體以一種或多種如下的方式進行修飾：

67、(1)宿主菌體修飾為增加葡萄糖胺-6-磷酸的生成量；

68、(2)宿主菌體修飾為使胞苷-5’-三磷酸持續(xù)循環(huán)再生；

69、(3)宿主菌體修飾為失活或阻斷n-乙酰甘露糖胺(mannac)的旁路分解途徑；

70、(4)宿主菌體修飾為失活或阻斷磷酸烯醇式丙酮酸的旁路分解途徑；

71、(5)宿主菌體修飾為增加參與寡糖轉運途徑的蛋白的表達或活性；

72、(6)宿主菌體修飾為降低或消除β-半乳糖苷酶的表達或活性；和

73、(7)宿主菌體修飾為降低或消除n-乙酰神經氨酸的旁路分解途徑。

74、在一個實施方案中，基因工程菌以一種或多種如下的方式進行修飾：

75、(8)宿主菌體修飾為降低或消除6-磷酸果糖激酶(pfka)的表達或活性；

76、(9)宿主菌體修飾為增加葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)的表達或活性；

77、(10)宿主菌體修飾為降低或消除n-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙酰基酶(naga)和/或葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶(nagb)的表達或活性；

78、(11)宿主菌體修飾為增加胞苷單磷酸激酶(cmk)和多磷酸激酶(ppk)的表達或活性；

79、(12)宿主菌體修飾為降低或消除丙酮酸激酶(pyka)的表達或活性；

80、(13)宿主菌體修飾為增加寡糖轉運蛋白的表達或活性；

81、(14)宿主菌體修飾為降低或消除n-乙酰神經氨酸醛縮酶(nana)的表達或活性；

82、(15)宿主菌體修飾為降低或消除n-乙酰甘露糖胺激酶(nank)的表達或活性；

83、(16)宿主菌體修飾為降低或消除n-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向異構酶(nane)的表達或活性；和

84、(17)宿主菌體修飾為降低或消除β-半乳糖苷酶(lacz)的表達或活性。

85、在一個實施方案中，使宿主菌體缺失了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因。

86、在一個實施方案中，使宿主菌體過表達了葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因。

87、在一個實施方案中，使宿主菌體缺失了葡萄糖胺-6-磷酸脫氨酶(nagb)基因。

88、在一個實施方案中，使宿主菌體缺失了n-乙酰甘露糖胺激酶(nank)基因。

89、在一個實施方案中，使宿主菌體缺失了n-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向異構酶(nane)基因。

90、在一個實施方案中，使宿主菌體缺失了n-乙酰葡糖胺-6-磷酸脫乙?；?naga)基因。

91、在一個實施方案中，使宿主菌體過表達了胞苷單磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因。

92、在一個實施方案中，使宿主菌體缺失了n-乙酰神經氨酸醛縮酶(nana)基因。

93、在一個實施方案中，使宿主菌體缺失了丙酮酸激酶(pyka)基因。

94、在一個實施方案中，使宿主菌體過表達了寡糖轉運蛋白setb基因。

95、在一個實施方案中，使宿主菌體缺失了β-半乳糖苷酶(lacz)基因。

96、在一個實施方案中，所述使宿主菌體缺失了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因為：對6-磷酸果糖激酶(pfka)基因進行部分核苷酸序列的敲除，所述部分核苷酸序列的敲除包括：在5’端保留的核苷酸序列長度占6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的全部核苷酸序列長度的0％-7％，在3’端保留的核苷酸序列長度占6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的全部核苷酸序列長度的70％-80％。

97、在一個實施方案中，葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)包含：seq?id?no:89所示的氨基酸序列或與seq?id?no:89具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

98、在一個實施方案中，所述使宿主菌體過表達了葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因為：將所述葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因整合到宿主菌體的基因組中。

99、在一個實施方案中，所述使宿主菌體缺失了丙酮酸激酶(pyka)基因為：對丙酮酸激酶(pyka)基因進行部分核苷酸序列的敲除，所述部分核苷酸序列的敲除包括：在5’端保留的核苷酸序列長度占丙酮酸激酶(pyka)基因的全部核苷酸序列長度的4％-5.5％，在3’端保留的核苷酸序列長度占丙酮酸激酶(pyka)基因的全部核苷酸序列長度的10％-20％。

100、在一個實施方案中，胞苷單磷酸激酶(cmk)包含：seq?id?no:91所示的氨基酸序列或與seq?id?no:91具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；多磷酸激酶(ppk)包含：seq?id?no:90所示的氨基酸序列或與seq?id?no:90具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

101、在一個實施方案中，所述使宿主菌體過表達了胞苷單磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因為：將所述胞苷單磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因整合到宿主菌體的基因組中。

102、在一個實施方案中，所述寡糖轉運蛋白setb包含：seq?id?no:93所示的氨基酸序列或與seq?id?no:93具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

103、在一個實施方案中，所述使宿主菌體過表達了寡糖轉運蛋白setb基因包括：將所述寡糖轉運蛋白setb基因整合到宿主菌體的基因組中。

104、在一個實施方案中，在敲除了6-磷酸果糖激酶(pfka)基因的部分核苷酸序列的條件下，還將所述葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(glms)基因插入所述6-磷酸果糖激酶(pfka)基因被敲除的位置。

105、在一個實施方案中，缺失了宿主菌體的蜜二糖通透酶(melb)基因，所述胞苷單磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因插入所述蜜二糖通透酶(melb)基因被敲除的位置。

106、在一個實施方案中，在敲除了丙酮酸激酶基因(pyka)基因的部分核苷酸序列的條件下，將所述寡糖轉運蛋白setb基因插入所述丙酮酸激酶基因(pyka)基因中被敲除的位置。

107、在一個實施方案中，所述胞苷單磷酸激酶(cmk)基因和多磷酸激酶(ppk)基因以各自連接了單獨的第二啟動子的方式或者以共同連接了第二啟動子的方式插入所述蜜二糖通透酶(melb)基因被敲除的位置。

108、在一個實施方案中，胞苷單磷酸激酶(cmk)基因位于多磷酸激酶(ppk)基因的上游。在一個實施方案中，所述第二啟動子為t5啟動子或四環(huán)素啟動子tet。

109、在一個實施方案中，udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸轉移酶基因(st)以各自分別連接了單獨的第一啟動子和/或終止子的方式作為一個基因組合，或者以共同連接了第一啟動子和/或終止子的方式作為一個基因組合插入宿主菌體基因組的一個或多個插入序列1(is1)位點處。

110、在一個實施方案中，引入的外源udp-n-乙酰葡糖胺-2-差向異構酶基因(neuc)、唾液酸合酶基因(neub)、n-乙酰神經氨酸胞苷酰轉移酶基因(css)和α-2,3-唾液酸轉移酶基因(st)作為一個基因組合插入在所述插入序列1(is1)處的拷貝數為10-28、12-26或14-22。

111、在一個實施方案中，使用包含同源臂1和同源臂2的ptargetf-nagab敲除naga和nagb基因,同源臂1使用seq?id?no:3和seq?id?no:4的引物以宿主菌體基因組為模板擴增得到，同源臂2使用seq?id?no:5和seq?id?no:6的引物以宿主菌體基因組為模板擴增得到。

112、在一個實施方案中，使用包含同源臂3和同源臂4的glms敲入donor-dna片段和ptargetf-pfka-nt1重組質粒敲除pfka基因并將glms基因敲入宿主菌體基因組中pfka基因被敲除的位置，同源臂3使用seq?id?no:11和seq?id?no:12的引物以宿主菌體基因組為模板擴增得到，同源臂4使用seq?id?no:19和seq?id?no:20的引物以宿主菌體基因組為模板擴增得到。

113、在一個實施方案中，使用包含同源臂5和同源臂6的ppk敲入donor-dna和ptargetf-melb-nt1重組質粒將ppk基因敲入宿主菌體基因組中，同源臂5使用seq?id?no:35和seq?id?no:36的引物以宿主菌體基因組為模板擴增得到，同源臂6使用seq?id?no:41和seq?id?no:42的引物以宿主菌體基因組為模板擴增得到。

114、在一個實施方案中，使用包含同源臂7和同源臂8的cmk敲入donor-dna和ptargetf-melb-nt2重組質粒將cmk基因敲入宿主菌體基因組中，同源臂7使用seq?id?no:43和seq?id?no:44的引物以宿主菌體基因組為模板擴增得到，同源臂8使用seq?id?no:49和seq?id?no:50的引物以宿主菌體基因組為模板擴增得到。

115、在一個實施方案中，使用包含同源臂9和同源臂10的setb敲入pyka位點donor-dna和ptargetf-pyka-nt2重組質粒敲除pyka基因并將setb基因敲入宿主菌體基因組中pyka基因被敲除的位置，同源臂9使用seq?id?no:58和seq?id?no:59的引物以宿主菌體基因組為模板擴增得到，同源臂10使用seq?id?no:64和seq?id?no:65的引物以宿主菌體基因組為模板擴增得到。宿主菌體優(yōu)選大腸桿菌。

116、在另一個方面，提供了發(fā)酵生產3’-唾液酸乳糖的方法，該方法包括如下步驟：

117、在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)本文所述的基因工程菌或者本文所述的大腸桿菌菌株，得到種子；

118、將所述種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)，待發(fā)酵結束后獲取含有3’-唾液酸乳糖的發(fā)酵液。

119、在一個實施方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中不含抗生素。

120、在一個實施方案中，所述種子培養(yǎng)基為lb培養(yǎng)基。

121、在一個實施方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含tb培養(yǎng)基和碳源，所述碳源包括葡萄糖和/或甘油。

122、本發(fā)明的優(yōu)點包括：

123、1.提供了一種高產3’-唾液酸乳糖的整合型工程菌，與現(xiàn)有技術的生產菌株(例如slis026菌株)相比具有更高的3’-唾液酸乳糖產量；

124、2.本文的基因工程菌為整合型菌株，不存在質粒丟失問題，遺傳穩(wěn)定性更高；

125、3.本發(fā)明的方法在敲除基因(例如pfka基因)時，在原基因的位置處整合靶基因(例如glms基因、setb基因)，從而實現(xiàn)靶基因在菌體細胞基因組中的過表達，減少基因操作的步驟，降低對菌體細胞生長和發(fā)酵的影響。