本發(fā)明涉及疫苗研制，具體涉及一種表達脊髓灰質炎病毒樣顆粒的載體及其制備方法和用途。

背景技術：

1、脊髓灰質炎病毒屬于微小rna病毒科腸道病毒屬。該病毒在電鏡下呈直徑20～30nm的球形顆粒，立體對稱20面體。病毒顆粒中心為單股正鏈核糖核酸，外圍60個衣殼蛋白，形成外層衣殼，此種病毒核衣殼體裸露無囊膜。核衣殼含4種結構蛋白vp1、vp3和由vp0分裂而成的vp2和vp4。vp1為主要的外露蛋白至少含2個表位(epitope)，可誘導中和抗體的產(chǎn)生，vp1對人體細胞膜上受體(可能位于染色體19上)有特殊親和力，與病毒的致病性和毒性有關。vp0最終分裂為vp2與vp4，為內在蛋白與rna密切結合，vp2與vp3半暴露，具抗原性。

2、脊髓灰質炎病毒根據(jù)血清型被分為ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型。其中ⅰ型脊髓灰質炎在3種類型中最具神經(jīng)侵襲性，多數(shù)脊髓灰質炎流行及地方性流行病例都是由ⅰ型脊髓灰質炎引起的，其次分別為ⅲ型和ⅱ型，且三種血清型之間并無交叉免疫保護作用。

3、目前，脊髓灰質炎的治療沒有特效藥，主要采取的是接種疫苗為主的預防措施。目前國內外普遍使用的用來預防脊髓灰質炎的疫苗有滅活疫苗(inactivated?poliovirusvaccine，ipv)和口服減毒疫苗(oral?poliovirus?vaccine，opv)。opv在1958年研制成功在美國上市，后來推廣至全球。opv的優(yōu)點包括接種簡單(口服)、費用低、可產(chǎn)生穩(wěn)定的腸道粘膜免疫、有效阻斷脊灰病毒傳播等。但隨著全世界消滅脊灰目標的推進，生物安全在遏制脊灰病毒傳播中的作用越來越重要。服用opv后產(chǎn)生的疫苗相關麻痹型脊灰(vaccineassociated?paralytic?poliomyelitis，vapp)病例以及因回復突變產(chǎn)生的疫苗衍生脊髓灰質炎病毒(vaccine-derived?poliovirus，vdpv)越來越受到關注，包括可引起脊髓灰質炎流行的循環(huán)疫苗衍生脊灰病毒(circulating?vaccine-derived?polioviruses，cvdpvs)和免疫缺陷疫苗衍生脊灰病毒(immunodeficient?related?vaccine-derivedpoliovirus，ivdpv)。ipv是由3種類型脊髓灰質炎病毒組成的混合物經(jīng)過細胞培養(yǎng)、收獲上清、純化以及甲醛滅活等而制備的疫苗。ipv的免疫原性和安全性都很理想，能有效預防脊灰爆發(fā)。并且ipv不存在引起vapp、cvdpvs等風險，其群體免疫優(yōu)于opv。ipv疫苗相較opv免疫安全性好，但是接種ipv不能形成明顯的腸道局部免疫，且成本顯著高于opv。

4、隨著現(xiàn)代生物科學技術的發(fā)展，基于病毒樣顆粒(virus-like?particles,vlp)的基因工程技術疫苗備受關注。vlp是由病毒的一個或多個結構蛋白在表達系統(tǒng)內重組表達,并自行組裝形成不含病毒遺傳物質且不能復制、不具有感染能力的病毒樣蛋白顆粒。具有和天然病毒顆粒類似的空間立體結構,可通過和病毒感染一樣的途徑提呈給免疫細胞,有效地誘導機體產(chǎn)生免疫保護反應。

5、形成脊髓灰質炎病毒vlp需要vp0、vp1、vp3三個蛋白的參與，因此，需要構建多順反子。例如可以構建含有多個啟動子的表達載體。通過把vp0、vp1、vp3基因連接至不同啟動子的下游，利用啟動子來控制相關基因的表達。例如構建“p1-啟動子2-啟動子1-3cd”，該技術路線模擬天然vlp形成的過程，vp0有肉豆蔻酰化，vlp結構相對穩(wěn)定；但是因為vp0修飾過程，產(chǎn)量較低，且3cd基因對宿主細胞具有毒性，影響產(chǎn)量，同時可能影響產(chǎn)量的穩(wěn)定性。再例如構建“構建vp1-啟動子2-啟動子1-vp2-啟動子3-vp0”，該種方式由于無3cd基因，對細胞毒性較小，產(chǎn)量高；無3cd基因毒性，毒種穩(wěn)定性較好，但是因為vp0修飾過程，產(chǎn)量受到影響；且由于引入了3個啟動子，載體的負擔較大，轉染以及表達效率低，蛋白的表達蛋白表達較為不均衡。

6、目前還可利用剪切多肽連接目的基因序列進行多順反子的構建，例如，連接序列2a、ires、lp4序列、nia蛋白酶等。其中由于2a(具有d-x-e-x-n-p-g-p氨基酸序列)剪切效率更高同時能夠平衡上下游基因的表達，因此較為常用。例如，現(xiàn)有技術構建“vp1-啟動子2-啟動子1-vp2-2a-vp0”，該方式解決了上下游基因表達不平衡的問題，不需要蛋白酶參與該過程并且剪切效率高。同時由于無肉豆蔻酰修飾，產(chǎn)量顯著提升，也無3cd基因毒性，穩(wěn)定性較好；但是2a殘留在某個亞基的末端，vp0無肉豆蔻酰化，vlp的3d結構穩(wěn)定性較差。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的提供一種表達脊髓灰質炎病毒樣顆粒的載體及其制備方法和應用，具體地，

2、本發(fā)明第一方面，提供一種表達脊髓灰質炎病毒樣顆粒(vlps)載體，所述脊髓灰質炎病毒選自i型脊髓灰質炎病毒、ii型脊髓灰質炎病毒和/或iii型脊髓灰質炎病毒，所述的病毒樣顆粒包括vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白；所述載體攜帶編碼vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白的基因，其中，vp0、vp1或vp3中任意兩個基因通過intein-自剪切序列連接。

3、具體地，所述inte?in(下稱int)的氨基酸序列如seq?id?no:4所示；

4、具體地，所述自剪切序列為2a、nia蛋白酶或lp4識別序列；優(yōu)選的，所述2a序列為編碼含d-x-e-x-n-p-g-p氨基酸的2a多肽的核酸序列。

5、優(yōu)選地，所述inte?in-2a氨基酸序列如如seq?id?no:5-7所示。

6、具體地，自剪切2a多肽為東亞細亞病毒2a序列(thoseaasigna?virus?2a,t2a)、e2a序列、f2a序列、fmdv?2a序列(foot-and-mouth?disease?virus?2a，f2a)、豬捷申病毒2a(porcine?teschovirus-12a，p2a)序列。

7、具體地，所述基因vp0、vp1或vp3中兩個基因間存在啟動子，包括啟動子ⅰ和啟動子ⅱ，并且啟動子ⅰ和啟動子ⅱ為反方向表達；優(yōu)選的，啟動子包括pph或p10啟動子。

8、優(yōu)選的，所述連接的兩個基因包括，vp1和vp0組合，vp0和vp3組合，或者vp1和vp3組合。在一個具體的實施方式中，所述連接的兩個基因包括vp0和vp3組合。

9、具體地，vp0、vp1或vp3中一個基因在啟動子ⅰ的下游位置，其余兩個基因在啟動子ⅱ下游位置；優(yōu)選的，所述的vp0、vp3基因在ppolh啟動子下游；所述的vp1基因在p10啟動子下游。

10、優(yōu)選的，所述載體為穿梭質粒，所述穿梭質粒選自psfv、peuk-c1、ptet-splice、ppur、pmamneo、pmam、pbi121、pbi101、pdr2、pcmvebna、psvk3、yacneo、pmsg、psvl、pch110、pkk232-8、p3'ss、psg5、pxt1、pmbac、ppbac、pmclneo、pyes2、pog44、pac360、pbluebachis、pvl1392、pbluebaciii、pcdna1、pcdm8、pcdna3、pzeosv、prep4、pebvhis、pcep4?pfastbac、pfastbac?ht、pfastbac?dual或其衍生物或變體，優(yōu)選的，所述穿梭質粒為pfastbac或pbacpak8-dual。

11、優(yōu)選的，所述vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白來源于i型脊髓灰質炎病毒、ii型脊髓灰質炎病毒或iii型脊髓灰質炎病毒的結構蛋白或其突變體。

12、更優(yōu)選的，所述vp0、vp1、vp3結構蛋白來源于i型、ii型和/或iii型脊髓灰質炎病毒(分別簡稱為i型，ii型，iii型)的蛋白的突變體。進一步優(yōu)選的，所述突變體相對于野生型蛋白具有以下突變：

13、1)t2025a、d2057e、l3119m、q3178l、v1196l和r4018g，

14、2)q3178l、t1041i和y1159f，或者

15、3)l2018i、l2215m、d2241e、h3019y、l3085f、f1132l、f3091s和a1054v。

16、在一個具體的實施方式中，所述三種結構蛋白相對于野生型具有如上的突變。

17、更優(yōu)選的，所述vp1蛋白，

18、1)相對于野生型i型sabin1的結構蛋白具有t2025a、d2057e、l3119m、q3178l、v1196l和r4018g的突變；

19、2)相對于野生型ii型mef-1的結構蛋白具有q3178l、t1041?i和y1159的突變；或者，

20、3)相對于野生型ii?i型sabin3的結構蛋白具有l(wèi)2018i、l2215m、d2241e、h3019y、l3085f、f1132l、f3091s和a1054v的突變。

21、本發(fā)明第二方面，提供一種上述任一種載體在制備脊髓灰質炎病毒樣顆粒中的應用。

22、優(yōu)選的，所述脊髓灰質炎病毒樣顆粒包括vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白，更優(yōu)選的，所述vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白來源于i型脊髓灰質炎病毒、ii型脊髓灰質炎病毒或iii型脊髓灰質炎病毒的蛋白或其突變體。

23、更優(yōu)選的，上述結構蛋白來源于i型、ii型和/或iii型脊髓灰質炎病毒的蛋白的突變體。進一步優(yōu)選的，所述突變體相對于野生型蛋白具有以下突變：

24、1)t2025a、d2057e、l3119m、q3178l、v1196l和r4018g，

25、2)q3178l、t1041i和y1159f，或者，

26、3)l2018i、l2215m、d2241e、h3019y、l3085f、f1132l、f3091s和a1054v。

27、在一個具體的實施方式中，所述結構蛋白相對于野生型具有如上的突變。

28、更優(yōu)選的，所述結構蛋白：

29、1)i型：sabin1的結構蛋白具有t2025a、d2057e、l3119m、q3178l、v1196l和r4018g的突變；

30、2)ii型：mef-1的結構蛋白具有q3178l、t1041i和y1159的突變；

31、3)iii型：sabin3的結構蛋白具有l(wèi)2018i、l2215m、d2241e、h3019y、l3085f、f1132l、f3091s和a1054v的突變。

32、本發(fā)明第三方面，提供一種脊髓灰質炎病毒樣顆粒的制備方法，所述制備方法包括利用上述任一種載體表達脊髓灰質炎病毒樣顆粒。

33、優(yōu)選的，將合成的vp1基因插入到載體中；將vp0和vp3基因通過intein-自剪切序列進行連接，插入載體，獲得插入了外源基因的載體；更優(yōu)選的，所述vp1基因在啟動子1的下游，所述vp0和vp3基因在啟動子2下游，進一步優(yōu)選的，所述載體為質粒，更為優(yōu)選的，所述質粒為表達i型、ii型或ii?i型脊髓灰質炎病毒樣顆粒的穿梭質粒。

34、具體地，將所述載體轉染宿主細胞，表達脊髓灰質炎病毒樣顆粒，優(yōu)選的，所述的宿主細胞為hek293、酵母細胞或spodoptera?frugiperda草地夜蛾細胞sf9；更優(yōu)選的，所述的宿主細胞為spodoptera?frugiperda草地夜蛾細胞sf9。

35、具體地，所述穿梭質粒選自psfv、peuk-c1、ptet-splice、ppur、pmamneo、pmam、pbi121、pbi101、pdr2、pcmvebna、psvk3、yacneo、pmsg、psvl、pch110、pkk232-8、p3'ss、psg5、pxt1、pmbac、ppbac、pmclneo、pyes2、pog44、pac360、pbluebachis、pvl1392、pbluebaciii、pcdna1、pcdm8、pcdna3、pzeosv、prep4、pebvhis、pcep4?pfastbac、pfastbacht、pfastbac?dual或衍生物或變體，優(yōu)選的，所訴穿梭質粒為pfastbac或pbacpak8-dual。

36、具體地，將所述表達不同血清型脊髓灰質炎病毒樣顆粒的穿梭質粒，分別通過flashbac系統(tǒng)共轉染細胞，獲得第一代可表達不同血清型脊髓灰質炎病毒樣顆粒的桿狀病毒。

37、具體地，所述表達脊髓灰質炎病毒樣顆粒的穿梭質粒分別通過flashbac系統(tǒng)共轉染sf9昆蟲細胞，分別獲得第一代可表達i、ii或iii型脊髓灰質炎病毒樣顆粒的桿狀病毒。

38、具體地，用所述sf9昆蟲細胞對第一代桿狀病毒進行連續(xù)擴增，獲得第三代病毒；優(yōu)選的，將獲得的第三代桿狀病毒感染懸浮細胞，培養(yǎng)1～10天，待細胞全部裂解后離心收獲上清，將收獲的上清膜包超濾濃縮，蔗糖梯度超速離心，得到脊髓灰質炎病毒樣顆粒。

39、本發(fā)明第四方面，提供一種上述制備方法制備的脊髓灰質炎病毒樣顆粒。

40、優(yōu)選的，所述脊髓灰質炎病毒樣顆粒包括vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白，更優(yōu)選的，所述vp0蛋白、vp1蛋白和vp3蛋白來源于i型脊髓灰質炎病毒、ii型脊髓灰質炎病毒或iii型脊髓灰質炎病毒的蛋白或其突變體。

41、更優(yōu)選的，所述三種結構蛋白來源于i型、ii型和/或iii型脊髓灰質炎病毒的蛋白的突變體。

42、進一步優(yōu)選的，所述突變體相對于野生型蛋白具有以下突變：

43、1)t2025a、d2057e、l3119m、q3178l、v1196l和r4018g，

44、2)q3178l、t1041i和y1159f，或者，

45、3)l2018i、l2215m、d2241e、h3019y、l3085f、f1132l、f3091s和a1054v。

46、在一個具體的實施方式中，所述結構蛋白相對于野生型具有如上的突變。

47、更優(yōu)選的，所述結構蛋白：

48、1)i型：sabin1的結構蛋白具有t2025a、d2057e、l3119m、q3178l、v1196l和r4018g的突變；

49、2)ii型：mef-1的結構蛋白具有q3178l、t1041i和y1159的突變；

50、3)iii型：sabin3的結構蛋白具有l(wèi)2018i、l2215m、d2241e、h3019y、l3085f、f1132l、f3091s和a1054v的突變。

51、本發(fā)明第五方面，提供一種上述脊髓灰質炎病毒樣顆粒在制備抗脊髓灰質炎i型、ii型和/或iii型病毒預防性藥物中的應用；優(yōu)選的，所述藥物為疫苗。

52、本發(fā)明第六方面，提供一種藥物，所述藥物包括上述的脊髓灰質炎病毒樣顆粒，優(yōu)選的，所述藥物為疫苗。

53、具體地，所述疫苗還包括藥學上可接受的輔料；優(yōu)選的，所述疫苗為注射劑或吸入制劑，更優(yōu)選的，為肌肉注射劑、皮下注射劑或霧化吸入劑，更為優(yōu)選的，所述疫苗為肌肉注射劑、皮下注射劑或霧化吸入劑。

54、有益的技術效果

55、本發(fā)明通過構建“vp1-啟動子2-啟動子1-vp3-int2a-vp0”三基因共表達載體的方法，獲得可表達由三種蛋白組成的復合物或者病毒樣顆粒的表達載體，該表達載體產(chǎn)量顯著提升，載體遺傳穩(wěn)定性較好，且無linker序列殘留，獲得的脊髓灰質炎病毒樣顆粒接近天然構象。利用該技術路線制備的脊髓灰質炎ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型病毒樣顆粒可用于制備基于病毒樣顆粒的脊髓灰質炎疫苗，該疫苗針對脊髓灰質炎病毒感染能激發(fā)更高水平的中和抗體。