本文提供了不表達(dá)內(nèi)源性豬cd47或sirpa但表達(dá)人或人源化cd47和人或人源化sirpa的重組小型豬。在某些實(shí)施方案中，人或人源化cd47和人或人源化sirpa在本文提供的重組小型豬中的表達(dá)受與內(nèi)源性豬cd47和sirpa相同的調(diào)控元件控制。還提供了來源于這種重組小型豬的細(xì)胞、組織和器官。此外，本文提供了在有或沒有來自這種重組小型豬的第二供體的骨髓的情況下移植來自這種重組小型豬的第一供體的移植物的方法。

背景技術(shù)：

1、目前同種異體供體的嚴(yán)重短缺限制了進(jìn)行器官移植的數(shù)量。可通過使用來自其他物種的器官(異種移植物)來糾正這種供需差異。鑒于使用非人靈長類動(dòng)物存在倫理問題和不切實(shí)際性，豬被認(rèn)為是人類最適合的供體物種。除了器官大小和生理學(xué)與人類相似之外，豬能夠快速繁殖和近親繁殖，使得它們特別適合進(jìn)行基因修飾，從而可以提高它們作為人類移植物供體的能力。參見例如，sachs(1994),path.biol.42:217-219和piedrahita等人(2004),am.j.transplant,4suppl.6:43-50。

2、盡管移植聯(lián)合非特異性免疫抑制療法可以使早期移植物接受率較高，但臨床器官移植成功的主要限制是晚期移植物丟失，這主要是由于對移植的慢性排斥造成的。因此免疫耐受是移植的主要目標(biāo)，并且對于成功的臨床異種移植來說甚至更為重要，因?yàn)榉乐巩惙N移植物排斥所需的終生免疫抑制水平可能毒性太大而難以接受。另外，尚未鑒定出任何可以可靠表明患者是否已實(shí)現(xiàn)免疫耐受的標(biāo)志物，導(dǎo)致缺乏可以作為免疫抑制停藥依據(jù)的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)。

3、因此，異種移植的目標(biāo)包括實(shí)現(xiàn)免疫耐受。這可以通過異種胸腺移植或通過優(yōu)化起源于供體動(dòng)物的混合嵌合細(xì)胞在移植到異種受者后的耐久性以及維持供體動(dòng)物的健康和生存力來實(shí)現(xiàn)。

4、混合嵌合可以在受者的t細(xì)胞、b細(xì)胞和自然殺傷(nk)細(xì)胞水平上誘導(dǎo)對供體的耐受。參見例如，griesemer等人(2014),immunol.rev.258:241-258；sachs等人(2014),coldspring?harb.perspect.med.4:a015529。

5、cd47也稱為整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(iap)，是一種廣泛表達(dá)的50-kda細(xì)胞表面糖蛋白并且充當(dāng)信號調(diào)節(jié)蛋白sirpα(也稱為cd172a和shps-1，其基因是sirpa)的配體。參見例如，brown(2002),curr.opin.cell.biol.,14:603-7；和brown和frazier(2001),trends?cellbiol.,111130-5。cd47和sirpα構(gòu)成細(xì)胞-細(xì)胞通訊系統(tǒng)，在包括細(xì)胞遷移、b細(xì)胞粘附和t細(xì)胞激活在內(nèi)的多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。參見例如，liu等人(2002),j.biol.chem.277:10028；motegi等人(2003),embo?122:2634；yoshida等人(2002),j.lmmunol.168:3213；以及l(fā)atour等人(2001),j.lmmunol.167:2547。另外，cd47-sirpα系統(tǒng)與巨噬細(xì)胞的吞噬作用的負(fù)調(diào)節(jié)有關(guān)。一些細(xì)胞類型(即，紅細(xì)胞、血小板或白細(xì)胞)的表面上的cd47會抑制巨噬細(xì)胞的吞噬作用。cd47-sirpα相互作用在抑制吞噬作用中的作用已經(jīng)通過以下觀察結(jié)果得到證實(shí)：原代野生型小鼠巨噬細(xì)胞快速吞噬從cd47缺陷型小鼠獲得的未經(jīng)調(diào)理的紅細(xì)胞(rbc)，但不吞噬來自野生型小鼠的未經(jīng)調(diào)理的紅細(xì)胞。參見例如，oldenborg等人(2000),science?288:2051。還報(bào)道了cd47通過其受體sirpα抑制fcγ和補(bǔ)體受體介導(dǎo)的吞噬作用。參見例如，oldenborg等人(2001),j.exp.med.193:855。cd47ko細(xì)胞在輸注到同基因野生型(wt)小鼠中后被巨噬細(xì)胞強(qiáng)烈排斥，證明cd47向巨噬細(xì)胞提供“別吃我”信號。參見例如，oldenborg?pa等人(2000),science,288:2051-4；以及wang等人(2007),proc?natl?acad?sci?u?s?a.104:13744。使用豬作為移植來源的異種移植具有解決人類器官供體(臨床移植中的主要限制因素)嚴(yán)重短缺的潛力。參見例如，yang等人(2007),nature?reviews?immunology.7:519-31。巨噬細(xì)胞對異種細(xì)胞的強(qiáng)烈排斥(參見例如，abe(2002),the?journal?of?immunology?168:621)主要由供體cd47與受者sirpα之間缺乏功能相互作用引起(參見例如，wang等人(2007),blood；109:836-42；ide等人(2007),proc?natl?acad?sci?usa?104:5062-6；以及navarro-alvarez(2014),celltransplantation,23:345-54)，從而導(dǎo)致人cd47轉(zhuǎn)基因豬的出現(xiàn)(參見例如，tena等人(2017),transplantation?101:316-21；以及nomura等人(2020),xenotransplantation2020；27:e12549)。除了巨噬細(xì)胞之外，dc的亞群也表達(dá)sirpα(參見例如，wang等人(2007),proc?natl?acad?sci?u?s?a.104:13744-9；以及guilliams等人(2016),immunity.45:669-84)。cd47-sirpα信號傳導(dǎo)還會抑制dc激活及其引發(fā)t細(xì)胞的能力，并且在通過供體特異性輸注(dst)或肝細(xì)胞移植誘導(dǎo)t細(xì)胞耐受中發(fā)揮重要作用。參見例如，wang等人(2007),procnatl?acad?sci?u?s?a.104:13744-9；wang等人(2014),cell?transplantation?23:355-63；以及zhang等人(2016),sci?rep.6:26839。因此，對于產(chǎn)生安全且耐受良好的用于異種移植的供體材料(例如，器官、組織、細(xì)胞等)存在尚未滿足的需求，這些供體材料不會經(jīng)由cd47-sirpα信號傳導(dǎo)發(fā)生排斥。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在一個(gè)方面，本文提供了一種重組小型豬，其中該重組小型豬包含：(a)(i)缺失或功能失活的編碼豬cd47的內(nèi)源性基因，其中編碼豬cd47的內(nèi)源性基因的表達(dá)受豬cd47調(diào)控元件調(diào)控；以及(ii)插入在豬基因組內(nèi)的編碼人cd47的轉(zhuǎn)基因，其中編碼人cd47的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)受豬cd47調(diào)控元件調(diào)控；以及(b)(i)缺失或功能失活的編碼豬sirpα的內(nèi)源性基因，其中編碼豬sirpα的內(nèi)源性基因的表達(dá)受豬sirpa調(diào)控元件調(diào)控；以及(ii)插入在豬基因組內(nèi)的編碼人sirpα的轉(zhuǎn)基因，其中編碼人sirpα的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)受豬sirpa調(diào)控元件調(diào)控。

2、在一些實(shí)施方案中，小型豬是α-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶缺陷型小型豬。

3、在一些實(shí)施方案中，α-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶缺陷型小型豬是主要組織相容性復(fù)合物(mhc)-近親繁殖小型豬。

4、在一些實(shí)施方案中，人cd47包含seq?id?no.1、2或3。在一些實(shí)施方案中，人sirpa包含seq?id?no.4或5。

5、在一些實(shí)施方案中，編碼人sirpα和人cd47的轉(zhuǎn)基因通過同源重組插入在小型豬的基因組中。在一些實(shí)施方案中，編碼人sirpα和人cd47的轉(zhuǎn)基因通過非同源定向末端連接插入在豬基因組中。在一些實(shí)施方案中，編碼人sirpα和人cd47的轉(zhuǎn)基因通過重組酶介導(dǎo)的盒交換插入在豬基因組中。在一些實(shí)施方案中，編碼人sirpα和人cd47的轉(zhuǎn)基因通過位點(diǎn)特異性核酸酶插入在豬基因組中。在一些實(shí)施方案中，位點(diǎn)特異性核酸酶選自由鋅指、zfn二聚體、zfnickase、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)和crispr/cas9組成的組。

6、在一些實(shí)施方案中，編碼人cd47的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)受ncbi基因id:397042的豬cd47調(diào)控元件調(diào)控。根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組小型豬，其中編碼人sirpα的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)受ncbi基因id:494566的豬sirpa調(diào)控元件調(diào)控。

7、在一些實(shí)施方案中，人cd47蛋白表達(dá)基本上類似于內(nèi)源性豬cd47的表達(dá)模式，如通過免疫組織化學(xué)所測定的。在一些實(shí)施方案中，人sirpα蛋白表達(dá)基本上類似于內(nèi)源性豬sirpα的表達(dá)模式，如通過免疫組織化學(xué)所測定的。

8、在另一方面，本文提供了一種重組小型豬，該重組小型豬包含人源化cd47基因；和/或(b)人源化sirpa基因。在一些實(shí)施方案中，重組小型豬包含人源化cd47基因。在一些實(shí)施方案中，重組小型豬包含人源化sirpa基因。在一些實(shí)施方案中，重組小型豬包含人源化cd47基因和人源化sirpa基因。在一些實(shí)施方案中，人源化cd47基因包括包含人cd47的外顯子2的豬cd47基因。

9、在另一方面，本文提供了一種細(xì)胞，該細(xì)胞來源于本文提供的重組小型豬。

10、在另一方面，本文提供了一種卵母細(xì)胞，該卵母細(xì)胞來源于本文提供的重組小型豬。

11、在另一方面，本文提供了一種精子，該精子來源于本文提供的重組小型豬。

12、在另一方面，本文提供了一種組織，該組織來源于本文提供的重組小型豬。

13、在另一方面，本文提供了一種器官，該器官來源于本文提供的重組小型豬。

14、在另一方面，本文提供了一種將來自第一重組小型豬的移植物移植到靈長類動(dòng)物中的方法，其中該方法包括：(a)獲得來自本文提供的第一重組小型豬的移植物；以及(b)將該移植物移植到靈長類動(dòng)物中。在一些實(shí)施方案中，靈長類動(dòng)物是人。在一些實(shí)施方案中，移植物包括細(xì)胞、組織或器官。在一些實(shí)施方案中，器官選自由心臟、腎、胰島、肝臟、胰腺、肺、腸、皮膚、氣管和角膜或它們的組合組成的組。

15、在一些實(shí)施方案中，該方法還包括獲得來自本文提供的第二重組小型豬的骨髓，以及將該骨髓移植到同一靈長類動(dòng)物中。在一些實(shí)施方案中，在移植來自第一重組豬的移植物之前至少28天移植骨髓。

16、在一些實(shí)施方案中，第一重組小型豬和第二重組小型豬是同一重組豬。在一些實(shí)施方案中，第一重組小型豬和第二重組小型豬來自小型豬的高度近親繁殖畜群。在一些實(shí)施方案中，第一重組小型豬和第二重組小型豬是基因匹配的小型豬。在一些實(shí)施方案中，第一重組小型豬和第二重組小型豬是mhc匹配的。

17、在一些實(shí)施方案中，來自第一重組小型豬的移植物在受者中存活至少6個(gè)月、1年、5年、10年、15年或20年。在一些實(shí)施方案中，來自第一重組小型豬的移植物在受者中作用至少6個(gè)月、1年、5年、10年、15年或20年。

18、在一些實(shí)施方案中，受者所需的免疫抑制療法減少90％、80％、70％、60％或50％。