本公開的實施方案包括用于檢測生物樣本中的靶蛋白的方法，以及用于檢測同一生物樣本中的靶蛋白和靶核酸的方法。還提供了用于實施所述方法的試劑盒。

背景技術(shù)：

1、原位雜交(ish)是一種廣泛用于檢測和定位細胞或組織切片中的特定序列，同時保存細胞和組織背景的分子生物學技術(shù)。因此，ish能夠?qū)崿F(xiàn)細胞和組織內(nèi)基因表達的時空可視化和量化，這在研究和診斷中具有有用的應(yīng)用。參見hu等人，biomarker?research?2(1):?1-13?(2014)；ratan等人，cureus?9(6):?e1325?(2017)；weier等人，expert?reviewof?molecular?diagnostics?2(2):?109-119?(2002)。

2、免疫組織化學(ihc)和免疫細胞化學(icc)也是用于檢測和定位組織切片和細胞內(nèi)特定蛋白質(zhì)，同時類似地保持空間分辨率和細胞學背景的強大技術(shù)。與ish類似，ihc和icc在研究和診斷方面具有廣泛和互補的應(yīng)用。參見shi等人，journal?of?histochemistry&?cytochemistry?59(11):?13-32?(2011)。例如，這兩種方法都為研究人員提供了關(guān)于細胞身份和狀態(tài)的見解。

3、組織或細胞內(nèi)復雜細胞相互作用的完整表征需要多組學策略。例如，檢測和分析轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學信息在詢問復雜組織和揭示細胞類型特異性基因表達(參見vanlandewijck等人，nature?554(7693):?475-482?(2018)；stempl等人，the?journal?ofmolecular?diagnostics?14(1):?22-29?(2014))、鑒定分泌蛋白的細胞來源(參見liou等人，cell?reports?19(7):?1322-1333?(2017))，以及可視化各種細胞類型的空間組織及其相互作用方面是有用的。為了完全和準確地表征細胞和組織，需要在同一組織樣本中，例如以空間分辨的方式同時檢測核酸和蛋白質(zhì)兩者。

4、盡管雙重檢測的作用至關(guān)重要，但在同一樣本中獲得核酸和蛋白質(zhì)兩者的高質(zhì)量信號一直是個問題。因此，非常需要能夠檢測兩種信號而不彼此干擾的新方法。本公開滿足了這些和其他需要。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、在一方面，本文提供了一種用于檢測生物樣本中的靶蛋白的方法，所述方法包括：(i)使所述樣本與抗體或其片段接觸，其中所述抗體或其片段與寡核苷酸共價附接；(ii)使所述樣本與產(chǎn)生信號的復合物接觸，其中所述產(chǎn)生信號的復合物包含能夠與所述寡核苷酸雜交的核酸組分；和(iii)檢測來自所述產(chǎn)生信號的復合物的信號。

2、在一些實施方案中，所述抗體或其片段選自單克隆抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、三特異性抗體、四價抗體、單域抗體和嵌合抗體。在一些實施方案中，步驟(i)包括使所述樣本與包含多克隆抗體的組合物接觸，其中所述組合物中的多個抗體與所述寡核苷酸共價附接。在一些實施方案中，所述抗體或其片段選自fab、scfv、fv、scfv-fc、fab′、fab′-sh、f(ab′)2、雙抗體、微抗體、三抗體、納米抗體和親和體。

3、在一些實施方案中，所述寡核苷酸的長度為約10至約100個核苷酸。

4、在一些實施方案中，所述寡核苷酸經(jīng)由接頭與所述抗體共價附接。

5、在一些實施方案中，所述接頭包含寡核苷酸序列。

6、在一些實施方案中，步驟(i)包括使所述樣本與所述抗體或其片段接觸約10分鐘至約48小時。在一些實施方案中，步驟(i)包括使所述樣本在約4°c至約75°c下與所述抗體或其片段接觸。在一些實施方案中，步驟(i)包括使所述樣本在室溫下與所述抗體或其片段接觸。

7、在一些實施方案中，所述方法還包括在步驟(i)之前使所述樣本與阻斷劑接觸。在一些實施方案中，所述阻斷劑包含rna或dna。在一些實施方案中，所述阻斷劑包含選自鮭魚精子dna、鯡魚dna和小牛胸腺dna的dna。在一些實施方案中，所述阻斷劑包含trna。在一些實施方案中，所述阻斷劑包含蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述阻斷劑選自牛血清白蛋白、酪蛋白、正常山羊血清、正常豬血清、正常雞血清、魚血清和基于植物蛋白的阻斷劑。

8、在一些實施方案中，所述方法還包括在步驟(i)之后且在步驟(ii)之前使所述樣本與交聯(lián)劑接觸。在一些實施方案中，所述交聯(lián)劑是固定劑。在一些實施方案中，所述固定劑是中性緩沖福爾馬林、戊二醛或乙二醛。在一些實施方案中，所述交聯(lián)劑是雙(琥珀酰亞胺基)聚乙二醇。

9、在一些實施方案中，所述方法包括使所述樣本在約4°c至約60°c的溫度下與所述交聯(lián)劑接觸約5分鐘至約24小時。

10、在一些實施方案中，所述方法包括在交聯(lián)步驟之后且在步驟(ii)之前使所述樣本與蛋白酶接觸。

11、在一些實施方案中，所述產(chǎn)生信號的復合物包含：前置前置擴增子、前置擴增子和/或擴增子；和一個或多個標記探針，其中每個標記探針包含可檢測標記。在一些實施方案中，所述產(chǎn)生信號的復合物包含前置擴增子、擴增子和一個或多個標記探針。在一些實施方案中，所述可檢測標記包含熒光部分或發(fā)色部分。在一些實施方案中，所述可檢測標記包括可切割標記。

12、在一些實施方案中，所述生物樣本是組織標本或來源于組織標本。在一些實施方案中，所述生物樣本是血液樣本或來源于血液樣本。在一些實施方案中，所述生物樣本是細胞學樣本或來源于細胞學樣本。在一些實施方案中，所述生物樣本是培養(yǎng)的細胞或含有外泌體的樣本。

13、在一些實施方案中，所述抗體或其片段直接結(jié)合至所述靶蛋白。

14、在一些實施方案中，所述方法包括檢測所述樣本中的兩種或更多種蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述方法包括(i)使所述樣本與多個抗體或其片段接觸，其中抗體或其片段與靶蛋白特異性雜交，并且其中每個抗體或其片段與寡核苷酸共價附接；(ii)使所述樣本與前置擴增子組接觸，其中所述前置擴增子組包含多個前置擴增子，其中所述多個前置擴增子包含對每個寡核苷酸具有特異性的前置擴增子，其中每個前置擴增子包含所述寡核苷酸的結(jié)合位點和擴增子的多個結(jié)合位點；(iii)使所述樣本與擴增子組接觸，其中所述擴增子組包含對每個前置擴增子具有特異性的多個擴增子亞組，其中每個擴增子亞組包含多個擴增子，其中擴增子亞組的所述擴增子包含對寡核苷酸具有特異性的所述前置擴增子中的一者的結(jié)合位點和標記探針的多個結(jié)合位點；(iv)使所述樣本與第一標記探針組接觸，其中所述第一標記探針組包含多個第一標記探針亞組，其中每個標記探針亞組對所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子具有特異性，其中每個標記探針亞組包含多個標記探針，其中所述標記探針亞組中的每一者的所述標記探針包含標記和所述擴增亞組中的一者的所述擴增子的結(jié)合位點，其中每個第一標記探針亞組中的所述標記在所述第一標記探針亞組之間是可區(qū)分的，并且其中所述標記是可切割的，并且其中所述第一標記探針組特異性地標記結(jié)合至多個抗體或其片段的第一靶蛋白亞組；(v)檢測結(jié)合至所述靶蛋白的第一標記探針組的所述標記探針，從而檢測所述第一靶蛋白亞組；(vi)從結(jié)合至所述第一靶蛋白亞組的第一標記探針組切割所述標記；(vii)使所述樣本與第二標記探針組接觸，其中所述第二標記探針組包含多個第二標記探針亞組，其中每個標記探針亞組對所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子具有特異性，其中所述第二標記探針亞組對與所述第一標記探針亞組不同的擴增亞組中的擴增子具有特異性，其中每個標記探針亞組包含多個標記探針，其中所述標記探針亞組中的每一者的所述標記探針包含標記和所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子的結(jié)合位點，其中每個第二標記探針亞組中的所述標記在所述第二標記探針亞組之間是可區(qū)分的并且其中所述標記是可切割的，并且其中所述第二標記探針組特異性地標記與所述第一靶蛋白亞組不同的結(jié)合至所述多個抗體或其片段的第二靶蛋白亞組；和(viii)檢測結(jié)合至所述靶蛋白的所述第二標記探針組的所述標記探針，從而檢測所述第二靶蛋白亞組，其中檢測多個靶蛋白。

15、在一些實施方案中，所述方法還包括(ix)從結(jié)合至所述第二靶蛋白組的所述第二標記探針組切割所述標記；(x)使所述樣本與第三標記探針組接觸，其中所述第三標記探針組包含多個第三標記探針亞組，其中每個標記探針亞組對所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子具有特異性，其中所述第三標記探針亞組對與所述第一標記探針亞組和所述第二標記探針亞組不同的擴增子亞組的擴增子具有特異性，其中每個標記探針亞組包含多個標記探針，其中所述標記探針亞組中的每一者的所述標記探針包含標記和所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子的結(jié)合位點，其中每個第三標記探針亞組中的所述標記在所述第三標記探針亞組之間是可區(qū)分的并且其中所述標記是可切割的，并且其中所述第三標記探針組特異性地標記與所述第一靶蛋白亞組和所述第二靶蛋白亞組不同的結(jié)合至所述多個抗體或其片段的第三靶蛋白亞組；和(xi)檢測結(jié)合至所述靶核酸的所述第三標記探針組的所述標記探針，從而檢測所述第三靶核酸組。

16、在另一方面，本文提供了一種用于檢測生物樣本中的靶蛋白和靶核酸的方法，所述方法包括(i)使所述樣本與抗體或其片段接觸，其中所述抗體或其片段與寡核苷酸共價附接；(ii)使所述樣本與第一產(chǎn)生信號的復合物接觸，其中所述第一產(chǎn)生信號的復合物包含能夠與所述寡核苷酸雜交的核酸組分；(iii)檢測來自所述第一產(chǎn)生信號的復合物的信號，從而檢測所述樣本中的所述靶蛋白；和(iv)通過原位雜交來檢測所述靶核酸。

17、在一些實施方案中，在所述樣本中同時檢測所述靶蛋白和所述靶核酸。

18、在一些實施方案中，所述抗體或其片段選自單克隆抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、三特異性抗體、四價抗體、單域抗體和嵌合抗體。在一些實施方案中，步驟(i)包括使所述樣本與包含多克隆抗體的組合物接觸，其中所述組合物中的多個抗體與所述寡核苷酸共價附接。在一些實施方案中，所述抗體或其片段選自fab、scfv、fv、scfv-fc、fab′、fab′-sh、f(ab′)2、雙抗體、微抗體、三抗體、納米抗體和親和體。

19、在一些實施方案中，所述寡核苷酸的長度為約10至約100個核苷酸。在一些實施方案中，所述寡核苷酸經(jīng)由接頭與所述抗體共價附接。在一些實施方案中，所述接頭包含寡核苷酸序列。

20、在一些實施方案中，步驟(i)包括使所述樣本與所述抗體或其片段接觸約10分鐘至約48小時。在一些實施方案中，步驟(i)包括使所述樣本在約4°c至約75°c下與所述抗體或其片段接觸。在一些實施方案中，步驟(i)包括使所述樣本在室溫下與所述抗體或其片段接觸。

21、在一些實施方案中，所述方法還包括在步驟(i)之前使所述樣本與阻斷劑接觸。在一些實施方案中，所述阻斷劑包含rna或dna。在一些實施方案中，所述阻斷劑包含選自鮭魚精子dna、鯡魚dna或小牛胸腺dna的dna。在一些實施方案中，所述阻斷劑包含trna。在一些實施方案中，所述阻斷劑包含蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述阻斷劑選自牛血清白蛋白、酪蛋白、正常山羊血清、正常豬血清、正常雞血清、魚血清和基于植物蛋白的阻斷劑。

22、在一些實施方案中，所述方法還包括在步驟(i)之后且在步驟(ii)之前使所述樣本與交聯(lián)劑接觸。在一些實施方案中，所述交聯(lián)劑是固定劑。在一些實施方案中，所述固定劑是中性緩沖福爾馬林。在一些實施方案中，所述交聯(lián)劑是雙(琥珀酰亞胺基)聚乙二醇。

23、在一些實施方案中，所述方法包括使所述樣本在約4°c至約60°c的溫度下與所述交聯(lián)劑接觸約5分鐘至約24小時。在一些實施方案中，所述方法包括在交聯(lián)步驟之后且在步驟(ii)之前使所述樣本與蛋白酶接觸。

24、在一些實施方案中，所述第一產(chǎn)生信號的復合物包含前置前置擴增子、前置擴增子和/或擴增子；和一個或多個標記探針，其中每個標記探針包含可檢測標記。

25、在一些實施方案中，所述第一產(chǎn)生信號的復合物包含前置擴增子、擴增子和一個或多個標記探針。在一些實施方案中，所述可檢測標記包含熒光部分或發(fā)色部分。在一些實施方案中，所述可檢測標記包括可切割標記。

26、在一些實施方案中，所述抗體或其片段直接結(jié)合至所述靶蛋白。

27、在一些實施方案中，所述方法包括檢測所述樣本中的兩種或更多種蛋白質(zhì)。

28、在一些實施方案中，所述方法包括(i)使所述樣本與多個抗體或其片段接觸，其中抗體或其片段與靶蛋白特異性雜交，并且其中每個抗體或其片段與寡核苷酸共價附接；(ii)使所述樣本與前置擴增子組接觸，其中所述前置擴增子組包含多個前置擴增子，其中所述多個前置擴增子包含對每個寡核苷酸具有特異性的前置擴增子，其中每個前置擴增子包含所述寡核苷酸的結(jié)合位點和擴增子的多個結(jié)合位點；(iii)使所述樣本與擴增子組接觸，其中所述擴增子組包含對每個前置擴增子具有特異性的多個擴增子亞組，其中每個擴增子亞組包含多個擴增子，其中擴增子亞組的所述擴增子包含對寡核苷酸具有特異性的所述前置擴增子中的一者的結(jié)合位點和標記探針的多個結(jié)合位點；(iv)使所述樣本與第一標記探針組接觸，其中所述第一標記探針組包含多個第一標記探針亞組，其中每個標記探針亞組對所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子具有特異性，其中每個標記探針亞組包含多個標記探針，其中所述標記探針亞組中的每一者的所述標記探針包含標記和所述擴增亞組中的一者的所述擴增子的結(jié)合位點，其中每個第一標記探針亞組中的所述標記在所述第一標記探針亞組之間是可區(qū)分的，并且其中所述標記是可切割的，并且其中所述第一標記探針組特異性地標記結(jié)合至多個抗體或其片段的第一靶蛋白亞組；(v)檢測結(jié)合至所述靶蛋白的第一標記探針組的所述標記探針，從而檢測所述第一靶蛋白亞組；(vi)從結(jié)合至所述第一靶蛋白亞組的第一標記探針組切割所述標記；(vii)使所述樣本與第二標記探針組接觸，其中所述第二標記探針組包含多個第二標記探針亞組，其中每個標記探針亞組對所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子具有特異性，其中所述第二標記探針亞組對與所述第一標記探針亞組不同的擴增亞組中的擴增子具有特異性，其中每個標記探針亞組包含多個標記探針，其中所述標記探針亞組中的每一者的所述標記探針包含標記和所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子的結(jié)合位點，其中每個第二標記探針亞組中的所述標記在所述第二標記探針亞組之間是可區(qū)分的并且其中所述標記是可切割的，并且其中所述第二標記探針組特異性地標記與所述第一靶蛋白亞組不同的結(jié)合至所述多個抗體或其片段的第二靶蛋白亞組；和(viii)檢測結(jié)合至所述靶蛋白的所述第二標記探針組的所述標記探針，從而檢測所述第二靶蛋白亞組，其中檢測多個靶蛋白。

29、在一些實施方案中，所述方法還包括(ix)從結(jié)合至所述第二靶蛋白組的所述第二標記探針組切割所述標記；(x)使所述樣本與第三標記探針組接觸，其中所述第三標記探針組包含多個第三標記探針亞組，其中每個標記探針亞組對所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子具有特異性，其中所述第三標記探針亞組對與所述第一標記探針亞組和所述第二標記探針亞組不同的擴增子亞組的擴增子具有特異性，其中每個標記探針亞組包含多個標記探針，其中所述標記探針亞組中的每一者的所述標記探針包含標記和所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子的結(jié)合位點，其中每個第三標記探針亞組中的所述標記在所述第三標記探針亞組之間是可區(qū)分的并且其中所述標記是可切割的，并且其中所述第三標記探針組特異性地標記與所述第一靶蛋白亞組和所述第二靶蛋白亞組不同的結(jié)合至所述多個抗體或其片段的第三靶蛋白亞組；和(xi)檢測結(jié)合至所述靶核酸的所述第三標記探針組的所述標記探針，從而檢測所述第三靶核酸組。

30、在一些實施方案中，所述靶核酸是rna。在一些實施方案中，所述rna選自信使rna(mrna)、微小rna?(mirna)、前體mirna、核糖體rna?(rrna)、線粒體rna、非編碼rna、環(huán)狀rna、小干擾rna?(sirna)、指導rna或反義寡核苷酸。在一些實施方案中，所述靶核酸是dna。

31、在一些實施方案中，通過原位雜交來檢測所述靶核酸的步驟包括(i)提供能夠與所述靶核酸雜交的一種或多種靶探針；(ii)提供能夠與所述一種或多種靶探針雜交的第二產(chǎn)生信號的復合物，其中所述第二產(chǎn)生信號的復合物包含能夠與所述一種或多種靶探針雜交的核酸組分；(iii)使所述靶核酸與所述一種或多種靶探針雜交；和(iv)將所述第二產(chǎn)生信號的復合物捕獲到所述一種或多種靶探針，從而將所述第二產(chǎn)生信號的復合物捕獲到所述靶核酸。

32、在一些實施方案中，所述一種或多種靶探針中的每一者包含靶(t)區(qū)段和標記(l)區(qū)段，其中所述t區(qū)段是與所述靶核酸上的區(qū)段互補的核酸序列，并且所述l區(qū)段是與所述第二產(chǎn)生信號的復合物的所述核酸組分上的區(qū)段互補的核酸序列，并且其中所述一種或多種靶探針的所述t區(qū)段與所述靶核酸的非重疊區(qū)互補，并且所述一種或多種靶探針的所述l區(qū)段與所述第二產(chǎn)生信號的復合物的所述核酸組分的非重疊區(qū)互補。

33、在一些實施方案中，所述第二產(chǎn)生信號的復合物包含：前置前置擴增子、前置擴增子和/或擴增子；和一個或多個標記探針，其中所述第二產(chǎn)生信號的復合物的每個標記探針包含與所述第一產(chǎn)生信號的復合物的所述可檢測標記不同的可檢測標記。在一些實施方案中，所述第二產(chǎn)生信號的復合物包含前置擴增子、擴增子和一個或多個標記探針。在一些實施方案中，所述可檢測標記包含熒光部分或發(fā)色部分。在一些實施方案中，所述可檢測標記包括可切割標記。

34、在一些實施方案中，所述生物樣本是組織標本或來源于組織標本。在一些實施方案中，所述生物樣本是血液樣本或來源于血液樣本。在一些實施方案中，所述生物樣本是細胞學樣本或來源于細胞學樣本。在一些實施方案中，所述生物樣本是培養(yǎng)的細胞或含有外泌體的樣本。

35、在一些實施方案中，所述方法包括檢測所述樣本中的兩種或更多種核酸。

36、在一些實施方案中，所述方法包括(i)使所述樣本與多個靶探針組接觸，其中每個靶探針組包含與靶核酸特異性雜交的靶探針對；(ii)使所述樣本與前置擴增子組接觸，其中所述前置擴增子組包含多個前置擴增子，其中所述多個前置擴增子包含對每個靶探針組具有特異性的前置擴增子，其中每個前置擴增子包含所述靶探針組中的一個的所述靶探針對的結(jié)合位點和擴增子的多個結(jié)合位點；(iii)使所述樣本與擴增子組接觸，其中所述擴增子組包含對每個前置擴增子具有特異性的多個擴增子亞組，其中每個擴增子亞組包含多個擴增子，其中擴增子亞組的所述擴增子包含對靶探針組具有特異性的所述前置擴增子中的一者的結(jié)合位點和標記探針的多個結(jié)合位點；(iv)使所述樣本與第一標記探針組接觸，其中所述第一標記探針組包含多個第一標記探針亞組，其中每個標記探針亞組對所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子具有特異性，其中每個標記探針亞組包含多個標記探針，其中所述標記探針亞組中的每一者的所述標記探針包含標記和所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子的結(jié)合位點，其中每個第一標記探針亞組中的所述標記在所述第一標記探針亞組之間是可區(qū)分的并且其中所述標記是可切割的，并且其中所述第一標記探針組特異性地標記與所述多個靶探針組雜交的第一靶核酸亞組；(v)檢測結(jié)合至所述靶核酸的所述第一標記探針組的所述標記探針，從而檢測所述第一靶核酸亞組；(vi)從結(jié)合至所述第一靶核酸亞組的所述第一標記探針組切割所述標記；(vii)使所述樣本與第二標記探針組接觸，其中所述第二標記探針組包含多個第二標記探針亞組，其中每個標記探針亞組對所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子具有特異性，其中所述第二標記探針亞組對與所述第一標記探針亞組不同的擴增子亞組的擴增子具有特異性，其中每個標記探針亞組包含多個標記探針，其中所述標記探針亞組中的每一者的所述標記探針包含標記和所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子的結(jié)合位點，其中每個第二標記探針亞組中的所述標記在所述第二標記探針亞組之間是可區(qū)分的并且其中所述標記是可切割的，并且其中所述第二標記探針組特異性地標記與所述第一靶核酸亞組不同的與所述多個靶探針組雜交的第二靶核酸亞組；和(viii)檢測結(jié)合至所述靶核酸的所述第二標記探針組的所述標記探針，從而檢測所述第二靶核酸亞組，其中檢測多個靶核酸。

37、在一些實施方案中，所述方法還包括(ix)從結(jié)合至所述第二靶核酸組的所述第二標記探針組切割所述標記；(x)使所述樣本與第三標記探針組接觸，其中所述第三標記探針組包含多個第三標記探針亞組，其中每個標記探針亞組對所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子具有特異性，其中所述第三標記探針亞組對與所述第一標記探針亞組和所述第二標記探針亞組不同的擴增子亞組的擴增子具有特異性，其中每個標記探針亞組包含多個標記探針，其中所述標記探針亞組中的每一者的所述標記探針包含標記和所述擴增子亞組中的一者的所述擴增子的結(jié)合位點，其中每個第三標記探針亞組中的所述標記在所述第三標記探針亞組之間是可區(qū)分的并且其中所述標記是可切割的，并且其中所述第三標記探針組特異性地標記與所述第一靶核酸亞組和所述第二靶核酸亞組不同的與所述多個靶探針組雜交的第三靶核酸亞組；和(xi)檢測結(jié)合至所述靶核酸的所述第三標記探針組的所述標記探針，從而檢測所述第三靶核酸亞組。

38、在另一方面，本文提供了一種用于檢測生物樣本中的靶蛋白的試劑盒，其包括(i)抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與寡核苷酸共價附接；和(ii)產(chǎn)生信號的復合物，其中所述產(chǎn)生信號的復合物包含能夠與所述寡核苷酸雜交的核酸組分。

39、在一些實施方案中，所述抗體或其片段選自單克隆抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、三特異性抗體、四價抗體、單域抗體和嵌合抗體。在一些實施方案中，所述試劑盒包含多克隆抗體的組合物，其中所述組合物中的多個抗體與所述寡核苷酸共價附接。在一些實施方案中，所述抗體或其片段選自fab、scfv、fv、scfv-fc、fab′、fab′-sh、f(ab′)2、雙抗體、微抗體、三抗體、納米抗體和親和體。

40、在一些實施方案中，所述寡核苷酸的長度為約10至約100個核苷酸。在一些實施方案中，所述寡核苷酸經(jīng)由接頭與所述抗體共價附接。在一些實施方案中，所述接頭包含寡核苷酸序列。

41、在一些實施方案中，所述產(chǎn)生信號的復合物包含：前置前置擴增子、前置擴增子和/或擴增子；和一個或多個標記探針，其中每個標記探針包含可檢測標記。在一些實施方案中，所述產(chǎn)生信號的復合物包含前置擴增子、擴增子和一個或多個標記探針。在一些實施方案中，所述可檢測標記包含熒光部分或發(fā)色部分。在一些實施方案中，所述可檢測標記包括可切割標記。

42、在一些實施方案中，所述抗體或其片段直接結(jié)合至所述靶蛋白。

43、在一些實施方案中，所述試劑盒還包含阻斷劑、交聯(lián)劑、蛋白酶或它們的任何組合。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于實施檢測所述生物樣本中的所述靶蛋白的方法的說明書。

44、在一些實施方案中，所述試劑盒用于檢測所述生物樣本中的兩種或更多種靶蛋白，并且所述試劑盒包含(i)多個抗體或其片段，其中每個抗體或其片段與不同的寡核苷酸共價附接；和(ii)多個產(chǎn)生信號的復合物，其中每個產(chǎn)生信號的復合物包含能夠與所述寡核苷酸中的一者雜交的核酸組分。

45、在另一方面，本文提供了一種用于檢測生物樣本中的靶蛋白的試劑盒，其包含(i)包含用于綴合至抗體的反應(yīng)性部分的寡核苷酸；和(ii)產(chǎn)生信號的復合物，其中所述產(chǎn)生信號的復合物包含能夠與所述寡核苷酸雜交的核酸組分。

46、在一些實施方案中，所述寡核苷酸的長度為約10至約100個核苷酸。

47、在一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于將所述寡核苷酸與所述抗體綴合的交聯(lián)劑。

48、在一些實施方案中，所述產(chǎn)生信號的復合物包含：前置前置擴增子、前置擴增子和/或擴增子；和一個或多個標記探針，其中每個標記探針包含可檢測標記。在一些實施方案中，所述產(chǎn)生信號的復合物包含前置擴增子、擴增子和一個或多個標記探針。在一些實施方案中，所述可檢測標記包含熒光部分或發(fā)色部分。在一些實施方案中，所述可檢測標記包括可切割標記。

49、在一些實施方案中，所述試劑盒還包含阻斷劑、交聯(lián)劑、蛋白酶或它們的任何組合。

50、在一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于將所述寡核苷酸與所述抗體綴合的綴合試劑。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于將所述寡核苷酸與所述抗體綴合的說明書。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于實施檢測所述生物樣本中的所述靶蛋白的方法的說明書。

51、在一些實施方案中，所述試劑盒用于檢測所述生物樣本中的兩種或更多種靶蛋白，并且所述試劑盒包含(i)多個寡核苷酸，其中每個寡核苷酸包含用于綴合至抗體的反應(yīng)性部分；和(ii)多個產(chǎn)生信號的復合物，其中每個產(chǎn)生信號的復合物包含能夠與所述寡核苷酸中的一者雜交的核酸組分。

52、在另一方面，本文提供了一種用于檢測生物樣本中的靶核酸和靶蛋白的試劑盒，其包含(i)抗體或其片段，其中所述抗體或其片段與寡核苷酸共價附接；(ii)第一產(chǎn)生信號的復合物，其中所述產(chǎn)生信號的復合物包含能夠與所述寡核苷酸雜交的核酸組分；(iii)能夠與所述靶核酸雜交的一種或多種靶探針；和(iv)能夠與所述一種或多種靶探針雜交的第二產(chǎn)生信號的復合物，其中所述第二產(chǎn)生信號的復合物包含能夠與所述一種或多種靶探針雜交的核酸組分。

53、在一些實施方案中，所述抗體或其片段選自單克隆抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、三特異性抗體、四價抗體、單域抗體和嵌合抗體。在一些實施方案中，所述試劑盒包含多克隆抗體的組合物，其中所述組合物中的多個抗體與所述寡核苷酸共價附接。在一些實施方案中，所述抗體或其片段選自fab、scfv、fv、scfv-fc、fab′、fab′-sh、f(ab′)2、雙抗體、微抗體、三抗體、納米抗體和親和體。

54、在一些實施方案中，所述寡核苷酸的長度為約10至約100個核苷酸。

55、在一些實施方案中，所述寡核苷酸經(jīng)由接頭與所述抗體共價附接。在一些實施方案中，所述接頭包含寡核苷酸序列。

56、在一些實施方案中，所述第一產(chǎn)生信號的復合物包含：前置前置擴增子、前置擴增子和/或擴增子；和一個或多個標記探針，其中每個標記探針包含可檢測標記。

57、在一些實施方案中，所述第一產(chǎn)生信號的復合物包含前置擴增子、擴增子和一個或多個標記探針。在一些實施方案中，所述可檢測標記包含熒光部分或發(fā)色部分。在一些實施方案中，所述可檢測標記包括可切割標記。

58、在一些實施方案中，所述抗體或其片段直接結(jié)合至所述靶蛋白。

59、在一些實施方案中，所述一種或多種靶探針中的每一者包含靶(t)區(qū)段和標記(l)區(qū)段，其中所述t區(qū)段是與所述靶核酸上的區(qū)段互補的核酸序列，并且所述l區(qū)段是與所述第二產(chǎn)生信號的復合物的所述核酸組分上的區(qū)段互補的核酸序列，并且其中所述一種或多種靶探針的所述t區(qū)段與所述靶核酸的非重疊區(qū)互補，并且所述一種或多種靶探針的所述l區(qū)段與所述第二產(chǎn)生信號的復合物的所述核酸組分的非重疊區(qū)互補。

60、在一些實施方案中，所述第二產(chǎn)生信號的復合物包含：前置前置擴增子、前置擴增子和/或擴增子；和一個或多個標記探針，其中所述第二產(chǎn)生信號的復合物的每個標記探針包含與所述第一產(chǎn)生信號的復合物的所述可檢測標記不同的可檢測標記。

61、在一些實施方案中，所述第二產(chǎn)生信號的復合物包含前置擴增子、擴增子和一個或多個標記探針。在一些實施方案中，所述可檢測標記包含熒光部分或發(fā)色部分。在一些實施方案中，所述可檢測標記包括可切割標記。

62、在一些實施方案中，所述試劑盒還包含阻斷劑、交聯(lián)劑、蛋白酶或它們的任何組合。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于實施檢測所述生物樣本中的所述靶蛋白和所述靶核酸的方法的說明書。

63、在一些實施方案中，所述試劑盒還包含所述試劑盒用于檢測所述生物樣本中的兩種或更多種靶蛋白和/或所述生物樣本中的兩種或更多種靶核酸。

64、本公開的實施方案還包括一種用于檢測生物樣本中的靶蛋白的方法，所述方法包括(i)使所述樣本與至少一種抗體或其片段接觸，其中所述至少一種抗體或其片段與寡核苷酸共價附接；(ii)使所述樣本與產(chǎn)生信號的復合物接觸，其中所述產(chǎn)生信號的復合物包含能夠與所述寡核苷酸雜交的核酸組分；和(iii)檢測來自所述產(chǎn)生信號的復合物的信號。在一些實施方案中，所述方法包括在步驟(i)之后且在步驟(ii)之前使所述樣本與交聯(lián)劑接觸。在一些實施方案中，所述交聯(lián)劑是戊二醛。

65、在一些實施方案中，所述至少一種抗體或其片段包含對所述靶蛋白上的抗原具有特異性的一抗。在一些實施方案中，所述至少一種抗體或其片段包含對不同靶蛋白上的不同抗原具有特異性的至少兩種一抗。在一些實施方案中，所述至少一種抗體或其片段包含對同一靶蛋白上的不同抗原具有特異性的至少兩種一抗。在一些實施方案中，所述至少一種一抗或所述至少兩種一抗與所述寡核苷酸共價附接。

66、在一些實施方案中，所述至少一種抗體或其片段包含對至少一種一抗上的抗原具有特異性的至少一種二抗，其中所述至少一種一抗對所述靶蛋白上的抗原具有特異性。在一些實施方案中，所述至少一種抗體或其片段包含對至少兩種一抗上的不同抗原具有特異性的至少兩種二抗，其中所述至少兩種一抗對不同靶蛋白上的不同抗原具有特異性。在一些實施方案中，所述至少一種抗體或其片段包含對至少兩種一抗上的不同抗原具有特異性的至少兩種二抗，其中所述至少兩種一抗對同一靶蛋白上的不同抗原具有特異性。在一些實施方案中，所述至少一種二抗或所述至少兩種二抗與所述寡核苷酸共價附接。

67、在一些實施方案中，所述方法包括(i)使所述樣本與多個抗體或其片段接觸，其中所述多個抗體或其片段包含對靶蛋白具有特異性的至少一種一抗，并且其中所述至少一種一抗與寡核苷酸共價附接；(ii)使所述樣本與多個前置擴增子接觸，所述前置擴增子包含所述寡核苷酸的結(jié)合位點和擴增子的多個結(jié)合位點；(iii)使所述樣本與多個擴增子接觸，所述擴增子包含所述前置擴增子的結(jié)合位點和標記探針的結(jié)合位點；(iv)使所述樣本與多個標記探針接觸，所述標記探針包含標記和所述擴增子的結(jié)合位點，其中所述標記是可切割的；和(v)檢測所述多個標記探針，從而檢測所述靶蛋白。

68、在一些實施方案中，所述方法包括(i)使所述樣本與多個抗體或其片段接觸，其中所述多個抗體或其片段包含對靶蛋白具有特異性的至少一種一抗和對所述一抗具有特異性的至少一種二抗，并且其中所述至少一種二抗與寡核苷酸共價附接；(ii)使所述樣本與多個前置擴增子接觸，所述前置擴增子包含所述寡核苷酸的結(jié)合位點和擴增子的多個結(jié)合位點；(iii)使所述樣本與多個擴增子接觸，所述擴增子包含所述前置擴增子的結(jié)合位點和標記探針的結(jié)合位點；(iv)使所述樣本與多個標記探針接觸，所述標記探針包含標記和所述擴增子的結(jié)合位點，其中所述標記是可切割的；和(v)檢測所述多個標記探針，從而檢測所述靶蛋白。

69、在一些實施方案中，所述方法還包括從所述多個標記探針切割所述標記；(vi)使所述樣本與至少第二多個標記探針接觸，所述標記探針包含標記和所述擴增子的結(jié)合位點；和(xi)檢測所述第二多個標記探針，從而檢測第二靶蛋白。

70、本公開的實施方案還包括一種用于檢測生物樣本中的靶蛋白的試劑盒，其包含(i)至少一種抗體或其片段，其中所述至少一種抗體或其片段與寡核苷酸共價附接；和(ii)產(chǎn)生信號的復合物，其中所述產(chǎn)生信號的復合物包含能夠與所述寡核苷酸雜交的核酸組分。

71、在一些實施方案中，所述至少一種抗體或其片段包含對所述靶蛋白上的抗原具有特異性的一抗。在一些實施方案中，所述至少一種抗體或其片段包含對不同靶蛋白上的不同抗原具有特異性的至少兩種一抗。在一些實施方案中，所述至少一種抗體或其片段包含對同一靶蛋白上的不同抗原具有特異性的至少兩種一抗。在一些實施方案中，所述至少一種一抗或所述至少兩種一抗與所述寡核苷酸共價附接。

72、在一些實施方案中，所述至少一種抗體或其片段包含對至少一種一抗上的抗原具有特異性的至少一種二抗，其中所述至少一種一抗對所述靶蛋白上的抗原具有特異性。在一些實施方案中，所述至少一種抗體或其片段包含對至少兩種一抗上的不同抗原具有特異性的至少兩種二抗，其中所述至少兩種一抗對不同靶蛋白上的不同抗原具有特異性。在一些實施方案中，所述至少一種抗體或其片段包含對至少兩種一抗上的不同抗原具有特異性的至少兩種二抗，其中所述至少兩種一抗對同一靶蛋白上的不同抗原具有特異性。在一些實施方案中，所述至少一種二抗或所述至少兩種二抗與所述寡核苷酸共價附接。