背景技術：

1、原核生物已經(jīng)發(fā)展出適應性免疫系統(tǒng)，稱為成簇規(guī)律間隔短回文重復序列(crispr)，其與cas蛋白締合以構成適應性免疫系統(tǒng)，該適應性免疫系統(tǒng)可以對抗外來移動遺傳元件諸如質粒和噬菌體的攻擊。crispr-cas系統(tǒng)分為兩類(1類和2類)，它們再細分為六種類型(i型至vi型)。1類(i、iii和iv型)系統(tǒng)在其crispr核糖核蛋白效應核酸酶中使用多種cas蛋白，而2類系統(tǒng)(ii、v和vi型)使用單一cas蛋白。2類v型進一步分為4個亞型(v-a、v-b、v-c、v-u)。目前，v-c和v-u仍未被廣泛表征，也沒有關于這些系統(tǒng)的結構信息。v-a編碼蛋白cas12a(也稱為cpf1)，最近cas12a的幾個高分辨率結構提供了對其工作機制的深入了解。

2、2類v型crispr-cas?12a是一種rna引導的核酸內切酶，其已被用作基因組編輯工具。這些酶在基因和表觀遺傳編輯中的更廣泛應用需要改進某些性質。

技術實現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、在一些方面，本公開提供了具有改善的性質(諸如超高活性(hyperactivity)和低的不加選擇的單鏈dna降解活性)的變體cas12a核酸內切酶。野生型cas12a的廣泛應用受到限制，部分原因是其相對于cas9而言具有較低的編輯效率以及其不加選擇的單鏈dna降解活性。參與檢查點進行準確靶識別的lid區(qū)域負責所有野生型cas12a直向同源物所展示的這種不加選擇的ssdna降解活性。令人驚訝的是，本文描述的數(shù)據(jù)表明，對cas12a的lid區(qū)域的某些修飾不僅可以影響不加選擇的單鏈脫氧核糖核酸酶(ssdnase)活性，還可以影響靶向切割活性-包括雙鏈和單鏈切割活性。

2、在一些實施方案中，工程改造的變體核酸內切酶相對于其野生型參考cas12a核酸內切酶表現(xiàn)出更高效的切割活性。在其它實施方案中，本公開的工程改造的變體核酸內切酶表現(xiàn)出低至沒有不加選擇的單鏈dna酶活性。在一些實施方案中，本文還提供了表現(xiàn)出對雙鏈dna中一條鏈的切割優(yōu)先于對另一條鏈的切割的變體cas12a核酸內切酶。

3、根據(jù)lbcas12a?nd2006核酸內切酶的結構研究，本技術人鑒定了一個特定的結構域，在本文中稱為“l(fā)id-hub結構域”，其參與一個亞組的催化事件。例如，在位置k932、n933和v936進行的某些取代提高了切割效率(“超高活性”)，而在位置k932、n933、v936、q944、f983和m986進行的某些取代降低了不加選擇的ssdna酶活性。lid和lid-hub結構域附近內的某些氨基酸取代也影響活性(例如v938或q941)。

4、此外，本技術人還出乎意料地顯示，對lid穩(wěn)定化電荷網(wǎng)絡(根據(jù)其三維結構，定義為至少包括參考lbcas12a?nd2006的氨基酸位置編號而言位置e835、r836、r935和/或k940)的修飾改變了cas12a切割偏好性(例如從雙鏈dna切割活性)。

5、在一些實施方案中，變體cas12a核酸內切酶在lid區(qū)域內的一個或多個氨基酸位置處包含氨基酸突變。例如，在一些實施方案中，變體cas12a核酸內切酶在對應于毛螺旋菌科(lachnospiraceae)細菌nd2006(例如seq?id?no：1)的位置925至937的氨基酸位置處包含一個或多個突變。在一些實施方案中，變體cas12a核酸內切酶在對應于毛螺旋菌科細菌coe1(例如seq?id?no：47)的位置936至948的氨基酸位置處包含一個或多個突變。

6、如本文中所述，術語“變體cas12a核酸內切酶”可與術語“cas12a變體”互換。

7、一些方面涉及工程改造的變體cas12a核酸內切酶，其包含在對應于參考lbcas12and2006的氨基酸位置編號而言位置e95、e125、n256、r747、h759、n813、k932、n933、s934、v936、s982或k984的氨基酸位置處具有突變的多肽序列。在一些實施方案中，前述變體cas12a核酸內切酶中的任一種或多種表現(xiàn)出超高活性(hyperactivity)。

8、其它方面涉及工程改造的變體cas12a核酸內切酶，其包含在對應于參考lbcas12and2006的氨基酸位置編號而言位置e95r、e95y、e125a、e125w、n256a、r747y、h759v、h759d、n813r、n813h、k932l、n933e、n933v、s934q、v936e、v936m、v936k、s982n或k984r的氨基酸位置處具有突變的多肽序列。在一些實施方案中，前述變體cas12a核酸內切酶中的任一種或多種表現(xiàn)出超高活性。

9、一些方面涉及工程改造的變體cas12a核酸內切酶，其包含在對應于參考lbcas12and2006的氨基酸位置編號而言位置n256、i831、k932、n933、s934、v936、q944、s982、f983、k984、m986或t988的氨基酸位置處具有突變的多肽序列。在一些實施方案中，前述變體cas12a核酸內切酶中的任一種或多種表現(xiàn)出過低活性。

10、其它方面涉及工程改造的變體cas12a核酸內切酶，其包含在對應于參考lbcas12and2006的氨基酸位置編號而言位置n256k、i831a、i831y、k932a、k932f、k932h、k932m、k932n、k932q、k932r、k932s、k932t、k932w、k932y、n933l、s934w、v936g、q944d、q944e、q944k、q944m、s982t、s982w、f983g、f983l、k984f、m986g、m986l、m986s或t988f的氨基酸位置處具有突變的多肽序列。在一些實施方案中，前述變體cas12a核酸內切酶中的任一種或多種表現(xiàn)出過低活性。

11、其它方面涉及工程改造的變體cas12a核酸內切酶，其包含在對應于參考lbcas12and2006的氨基酸位置編號而言位置：k932f和f983l、k932f和t988f、k932r和q944d、k932r和f983l、k932r和t988f、k932y和f983l、k932y和t988f、n933l和q944m、v936g和q944d、v936g和s982w、v936g和m986g、v936g和t988f、q944d和s982w、q944d和f983l、q944d和t988f、s982w和f983l；s982w和t988f或f983g和m986g的氨基酸位置處具有突變的多肽序列。在一些實施方案中，前述變體cas12a核酸內切酶中的任一種或多種表現(xiàn)出過低活性。

12、一些方面涉及工程改造的變體cas12a核酸內切酶，其包含在對應于參考lbcas12and2006的氨基酸位置編號而言位置n813、i831、k932、n933、s934、v936、q944、s982、f983、k984、m986或t988的氨基酸位置處具有突變的多肽序列。在一些實施方案中，前述變體cas12a核酸內切酶中的任一種或多種表現(xiàn)出低的(或無)ssdna酶活性，諸如低的(或無)不加選擇的ssdna酶活性。

13、其它方面涉及工程改造的變體cas12a核酸內切酶，其包含在對應于參考lbcas12and2006的氨基酸位置編號而言位置n813h、n813r、n813w、i831a、i831y、k932a、k932f、k932h、k932m、k932n、k932q、k932r、k932s、k932t、k932w、k932y、n933e、n933l、s934k、s934q、v936e、v936g、q944d、q944e、q944k、s982w、f983g、f983l、k984f、m986f、m986g或t988f的氨基酸位置處具有突變的多肽序列。在一些實施方案中，前述變體cas12a核酸內切酶中的任一種或多種表現(xiàn)出低的(或無)ssdna酶活性，諸如低的(或無)不加選擇的ssdna酶活性。

14、其它方面涉及工程改造的變體cas12a核酸內切酶，其包含在對應于參考lbcas12and2006的氨基酸位置編號而言位置：n933l和q944m或f983g和m986g的氨基酸位置處具有突變的多肽序列。在一些實施方案中，前述變體cas12a核酸內切酶中的任一種或多種表現(xiàn)出低的(或無)ssdna酶活性，諸如低的(或無)不加選擇的ssdna酶活性。

15、在一些實施方案中，工程改造的變體cas12a核酸內切酶與效應蛋白融合。

16、在一些實施方案中，本文提供的工程改造的變體cas12a核酸內切酶包含與選自酸氨球菌屬的某一種(acidaminococcus?sp.)、毛螺旋菌科的某一種(lachnospiraceae?sp.)和弗朗西絲菌屬的某一種(francisella?sp.)的野生型cas12a核酸內切酶的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％但小于100％同一性的氨基酸序列。

17、在一些實施方案中，工程改造的變體cas12a核酸內切酶相對于野生型參考cas12a核酸內切酶還包含不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個額外的氨基酸取代。在一些實施方案中，變體cas12a核酸內切酶相對于野生型參考cas12a核酸內切酶還包含不超過5個額外的氨基酸取代。

18、本發(fā)明還提供了工程改造的變體cas12a核酸內切酶，其包含含有seq?id?no：48-119和367-387中任一個或其直向同源物的氨基酸序列的多肽序列。

19、本文還提供了編碼本公開的工程改造的變體cas12a核酸內切酶的多核苷酸。

20、本文還提供了細胞，其包含(a)本公開的工程改造的變體cas12a核酸內切酶或本公開的多核苷酸核酸內切酶，和(b)引導rna或編碼引導rna的多核苷酸。

21、本文的一些方面涉及一種方法，該方法包括將(a)本公開的工程改造的變體cas12a核酸內切酶或本公開的多核苷酸和任選地(b)引導rna或編碼引導rna的多核苷酸引入細胞。

22、本公開還提供了本公開的工程改造的變體cas12a核酸內切酶用于切割核酸的用途。

23、在一些實施方案中，用于在靶核酸中引入雙鏈斷裂的方法包括向包含靶核酸的細胞中引入(a)本公開的工程改造的變體cas12a核酸內切酶和(b)引導rna，以及孵育所述細胞以在靶核酸中產(chǎn)生雙鏈斷裂。

24、在其它實施方案中，用于在靶核酸中引入雙鏈斷裂的方法包括向包含靶核酸的細胞中引入(a)本公開的工程改造的變體cas12a核酸內切酶和(b)引導rna，以及孵育所述細胞以在靶核酸中產(chǎn)生雙鏈斷裂。

25、在一些實施方案中，所述細胞中的脫靶單鏈核酸切割相對于包含野生型cas12a核酸內切酶和引導rna的對照細胞中的脫靶單鏈核酸切割而言減少。

26、在一些實施方案中，用于在靶核酸中引入單鏈斷裂的方法包括向包含靶核酸的細胞中引入(a)本公開的工程改造的變體cas12a核酸內切酶和(b)引導rna，以及孵育所述細胞以在靶核酸中產(chǎn)生單鏈斷裂。

27、一些方面涉及包含seq?id?no：48-119和367-387中任一個的氨基酸序列或其變體的工程改造的多肽，所述變體與seq?id?no：48-119和367-387中的任一個氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，任選地，其中所述工程改造的多肽是相對于天然存在的cas12a核酸內切酶(例如seq?idno：1)表現(xiàn)出超高活性、過低活性和/或低的ssdna酶活性(例如低的不加選擇的ssdna酶活性)的核酸內切酶。

28、一些方面涉及融合蛋白，其包含前述方面或實施方案中任一項的工程改造的變體cas12a核酸內切酶和堿基編輯酶。

29、一些方面涉及包含seq?id?no：163-185和388-408中任一個的氨基酸序列或其變體的工程改造的多肽，所述變體與seq?id?no：163-185和388-408中任一個的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。

30、其它方面涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含工程改造的變體cas12a核酸內切酶，其包含與seq?id?no：367-387中任一個的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

31、在一些實施方案中，堿基編輯酶能夠將嘌呤轉化為不同的嘌呤或將嘧啶轉化為不同的嘧啶。

32、在一些實施方案中，堿基編輯酶包括脫氨酶、鳥嘌呤氧化酶或鳥嘌呤甲基轉移酶。

33、在一些實施方案中，脫氨酶是胞苷脫氨酶或腺苷脫氨酶。

34、在一些實施方案中，脫氨酶包含rapobec1多肽、evoapobec1多肽、hapobec3a多肽、evocda多肽、evoferny多肽或tada多肽。

35、在一些實施方案中，融合蛋白還包含尿嘧啶糖基化酶抑制劑(ugi)。

36、在一些實施方案中，融合蛋白還包含一個或多個核定位信號(nls)，其任選地選自sv40?nls、核蛋白(np)nls和二分(bipartite,bp)nls。

37、在一些實施方案中，融合蛋白還包含尿嘧啶dna糖基化酶(ung)，任選地為人ung(hung)或大腸桿菌(escherichia?coli)ung(eung)。

38、在一些實施方案中，融合蛋白還包含n-甲基嘌呤糖基化酶(mpg)，任選地，其中mpg位于融合蛋白的n末端或c末端或其附近。

39、在一些實施方案中，融合蛋白還包含一個或多個接頭。

40、在一些實施方案中，接頭包含sgsetpgtsesatpes(seq?id?no：203)的序列。

41、在一些實施方案中，接頭包含sggssggssgsetpgtsesatpessggssggs(seq?id?no：204)的序列。

42、在一些實施方案中，融合蛋白還包含dna結合結構域(dbd)。

43、在一些實施方案中，dbd是rad51?dbd。

44、一些方面涉及編碼前述方面或實施方案中任一項的融合蛋白的多核苷酸。

45、其它方面涉及細胞，其包含：含有靶鏈和非靶鏈的靶核酸；引導rna(grna)或編碼與靶鏈結合的grna的核酸；以及前述方面或實施方案中任一項的融合蛋白或前述方面或實施方案中任一項的多核苷酸。

46、在一些實施方案中，所述細胞是人細胞。

47、在一些實施方案中，所述人細胞來自人受試者，其中所述人受試者患有與所述靶核酸相關的疾病、病癥或疾患。

48、在一些實施方案中，所述細胞是植物細胞。

49、一些方面涉及方法，所述方法包括向細胞中引入(a)前述方面或實施方案中任一項的融合蛋白或前述方面或實施方案中任一項的多核苷酸，以及任選的(b)引導rna或編碼引導rna的多核苷酸。

50、一些方面涉及基因編輯的方法，其包括(i)使靶核酸序列與前述方面或實施方案中任一項的融合蛋白和引導rna接觸，其中所述靶核酸包含靶核堿基；和(ii)修飾所述靶核堿基。

51、在一些實施方案中，所述靶核酸是靶雙鏈dna核酸。

52、在一些實施方案中，引導rna指導融合蛋白結合所述靶核酸的特定區(qū)段并接近所述靶核堿基。

53、在一些實施方案中，融合蛋白切割所述靶核酸。

54、在一些實施方案中，融合蛋白包含胞苷脫氨酶，并且所述靶核堿基是胞苷。在一些實施方案中，融合蛋白包含鳥嘌呤氧化酶，并且所述靶核堿基是鳥苷。在一些實施方案中，融合蛋白包含鳥嘌呤甲基轉移酶，并且所述靶核堿基是鳥苷。

55、在一些實施方案中，所述方法在細胞中進行，任選地在人細胞或植物細胞中進行。

56、在一些實施方案中，所述方法在體外進行或離體進行。在其它實施方案中，所述方法在體內進行。

57、在一些實施方案中，所述靶核酸是相對于野生型基因包含核堿基突變的基因。

58、在一些實施方案中，所述包含核堿基突變的基因與疾病或病癥相關。