相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本技術(shù)要求基于2022年3月18日提交的韓國(guó)專利申請(qǐng)第10-2022-0034233號(hào)的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，并且相應(yīng)韓國(guó)專利申請(qǐng)文件中公開的全部?jī)?nèi)容作為本說(shuō)明書的一部分并入。本發(fā)明提供了一種源自赤擬谷盜(t.castaneum)的天冬氨酸1-脫羧酶的變體多肽；一種包括該變體多肽的微生物；一種生產(chǎn)β-丙氨酸或β-丙氨酸衍生化合物的組合物，該組合物包含該微生物；以及一種生產(chǎn)β-丙氨酸或β-丙氨酸衍生化合物的方法，該方法包括培養(yǎng)該微生物的步驟。

背景技術(shù)：

1、β-丙氨酸(β-alanine)是天然存在的β-氨基酸，其中，氨基與β碳結(jié)合。β-丙氨酸天然存在于諸如家禽、肉類和魚類的食品中，并用于在肌肉中合成肌肽。

2、β-丙氨酸衍生化合物，例如β-丙氨酸和泛酸，是商業(yè)上重要的物質(zhì)之一，應(yīng)用于各種工業(yè)領(lǐng)域，例如保健食品、食品、藥品、動(dòng)物飼料等。

3、因此，需要開發(fā)一種在生物技術(shù)制備β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物中具有有利作用的微生物，以及使用所述微生物制備β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的技術(shù)。

4、現(xiàn)有技術(shù)

5、專利文獻(xiàn)

6、(專利文獻(xiàn)1)美國(guó)專利第7718205號(hào)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、技術(shù)問(wèn)題

2、本技術(shù)提供了一種具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的變體多肽，其中，對(duì)應(yīng)于seq?idno：51的氨基酸序列的第139位殘基的氨基酸被另一種氨基酸取代。

3、本技術(shù)提供了一種編碼變體多肽的多核苷酸。

4、本技術(shù)提供了一種包含所述多核苷酸的重組載體。

5、本技術(shù)提供了一種包含變體多肽和/或編碼所述變體多肽的多核苷酸的微生物。

6、本技術(shù)提供了一種生產(chǎn)β-丙氨酸或β-丙氨酸衍生化合物的組合物，其包括包含變體多肽和/或編碼所述變體多肽的多核苷酸的微生物。

7、本技術(shù)提供了一種生產(chǎn)β-丙氨酸或β-丙氨酸衍生化合物的方法，包括培養(yǎng)包含變體多肽和/或編碼所述變體多肽的多核苷酸的微生物。

8、本技術(shù)提供了一種微生物用于生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的用途。

9、本技術(shù)提供了一種微生物用于制備生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的組合物的用途。

10、技術(shù)方案

11、在本技術(shù)中，提供了一種具有能夠提高β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力的天冬氨酸1-脫羧酶(或pand蛋白)活性的變體多肽，或一種其中引入了該變體多肽的、具有優(yōu)異的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物生產(chǎn)能力的重組微生物(菌株)。

12、一個(gè)方面，本技術(shù)為實(shí)現(xiàn)上述目的，可以提供一種具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的變體多肽。變體多肽可以包括用另一種氨基酸取代對(duì)應(yīng)于seq?id?no：51的氨基酸序列的第139位殘基的氨基酸。

13、另一種實(shí)施方式提供了一種編碼(encoding)(或編碼(coding))該多肽的多核苷酸。

14、其它實(shí)施方式提供了一種包含多核苷酸的重組載體。重組載體可以用作多肽的表達(dá)載體。

15、其它實(shí)施方式提供了一種微生物，其包含選自由多肽、編碼該多肽的多核苷酸和包含該多核苷酸的重組載體所組成的組中的至少一種。微生物可以是生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的微生物。

16、其它實(shí)施方式提供了一種生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的組合物，包含該微生物。

17、其它實(shí)施方式提供了一種生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的方法，包括培養(yǎng)微生物。

18、在下文中，將更詳細(xì)地描述。

19、多肽

20、本技術(shù)的一個(gè)方面，提供了一種具有天冬氨酸1-脫羧酶(或pand蛋白)活性的變體多肽。具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的變體多肽可以是天冬氨酸1-脫羧酶蛋白中至少一個(gè)氨基酸殘基被取代、缺失或插入的變體多肽。

21、本技術(shù)的引入突變的蛋白可以是具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的蛋白。蛋白質(zhì)的序列可以從已知的數(shù)據(jù)庫(kù)ncbi獲得，并且具體地，其可以由seq?id?no：51的氨基酸序列組成，或者包含seq?id?no：51的氨基酸序列并且具有天冬氨酸1-脫羧酶的活性，但不限于此。換句話說(shuō)，不排除在seq?id?no:51的氨基酸序列之前和之后添加無(wú)意義的序列，或可自然發(fā)生的突變，或其沉默突變，并且只要其具有與包含seq?id?no:51的氨基酸序列的蛋白質(zhì)相同或相應(yīng)的活性，則其可對(duì)應(yīng)于本技術(shù)的引入突變的蛋白質(zhì)。例如，本技術(shù)的引入突變的蛋白可以是由seq?id?no：51的氨基酸序列、或與其具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高同源性或同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。此外，只要是具有這樣的同源性或同一性并且表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)的功效的氨基酸序列，具有其中一些序列被缺失、修飾、取代或添加的氨基酸序列的蛋白質(zhì)也被包括在本技術(shù)的引入突變的蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)。

22、在一種實(shí)施方式中，具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的變體多肽可以是對(duì)應(yīng)于seq?idno：51的氨基酸序列的第139位殘基的氨基酸被另一種氨基酸取代的多肽，該另一種氨基酸為選自由色氨酸(trp，w)、組氨酸(his，h)、酪氨酸(tyr，t)、丙氨酸(ala，a)、半胱氨酸(cys，c)、脯氨酸(pro，p)、絲氨酸(ser，s)、亮氨酸(leu，l)、異亮氨酸(ile，i)、精氨酸(arg，r)、賴氨酸(lys，k)、纈氨酸(val，v)、甲硫氨酸(met，m)、天冬氨酸(asp，d)、谷氨酸(glu，e)、甘氨酸(gly，g)、天冬酰胺(asn，n)、谷氨酰胺(gln，q)和酪氨酸(tyr，y)所組成的組中的氨基酸，并且不同于原始氨基酸(苯丙氨酸phe，f)。在一種具體的實(shí)施方式中，具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的變體多肽可以是對(duì)應(yīng)于seq?id?no：51的氨基酸序列的第139位殘基的氨基酸被堿性氨基酸(精氨酸、組氨酸或賴氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸或谷氨酸)、極性氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺)、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸或甘氨酸取代的多肽。在一種具體的實(shí)施方式中，具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的變體多肽可以是對(duì)應(yīng)于seq?id?no：51的氨基酸序列的第139位殘基的氨基酸被蘇氨酸、丙氨酸、絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、組氨酸或酪氨酸取代的多肽。在一種具體的實(shí)施方式中，具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的變體多肽可以是對(duì)應(yīng)于seq?id?no：51的氨基酸序列的第139位殘基的氨基酸被酪氨酸取代的多肽。在一種具體實(shí)施方式中，天冬氨酸1-脫羧酶的變體可由選自seq?id?no:52至seq?id?no:61的至少一個(gè)氨基酸序列組成，或包含選自seq?idno:52至seq?id?no:61的至少一個(gè)氨基酸序列。

23、與具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的野生型多肽相比，本技術(shù)的變體多肽可以具有增加β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力的特性。

24、顯然，即使在變體多肽中除了對(duì)應(yīng)于seq?id?no:51的氨基酸序列的第139位氨基酸殘基的氨基酸之外的某些氨基酸序列被缺失、修飾、取代或添加，只要其表現(xiàn)出天冬氨酸1-脫羧酶的活性，則其也包括在本技術(shù)的變體多肽中。

25、例如，在n末端、c末端和/或氨基酸序列內(nèi)部添加或缺失不改變本技術(shù)的變體多肽功能的序列的情況、可能自然發(fā)生的突變、沉默突變或保守取代的情況。

26、“保守取代”是指一種氨基酸被具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性的另一氨基酸取代。這種氨基酸取代通常可以基于殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性性質(zhì)的相似性而發(fā)生。通常，保守取代可以幾乎不影響或不影響蛋白質(zhì)或多肽的活性。

27、換句話說(shuō)，在本技術(shù)的變體多肽中，對(duì)應(yīng)于seq?id?no：51的氨基酸序列的第139位殘基的氨基酸可以被另一種氨基酸取代，并且本技術(shù)的變體多肽可以具有或包含與氨基酸序列seq?id?no：51的氨基酸序列具有以下同源性或同一性的氨基酸序列：70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、98.2％或更高、98.4％或更高、98.6％或更高、98.8％或更高、98.9％或更高、99％或更高、99.1％或更高、99.3％或更高、99.5％或更高、99.7％或更高、或99.9％或更高，或由以下氨基酸序列組成，或基本上由以下氨基酸序列組成：所述氨基酸序列與seq?idno:51的氨基酸序列具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、98.2％或更高、98.4％或更高、98.6％或更高、98.8％或更高、98.9％或更高、99％或更高、99.1％或更高、99.3％或更高、99.5％或更高、99.7％或更高、或99.9％或更高同源性或同一性，但不限于此。此外，在一種實(shí)施方式中，本技術(shù)的變體多肽可具有或包含以下序列，在與seq?id?no:51具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％同源性或同一性的氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于seq?id?no:51的氨基酸序列的第139位殘基的氨基酸被另一種氨基酸取代；或本技術(shù)的變體多肽由以下序列組成，或基本上由以下序列組成：在與seq?id?no:51具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％至的同源性或同一性的氨基酸序列中，對(duì)應(yīng)于seq?id?no:51的氨基酸序列的第139位殘基的氨基酸被另一種氨基酸取代，但不限于此。

28、在一種實(shí)施方式中，變體多肽可與seq?id?no:51具有70％或更高和小于100％、75％或更高和小于100％、80％或更高和小于100％、85％或更高和小于100％、90％或更高和小于100％、95％或更高和小于100％、96％或更高和小于100％、97％或更高和小于100％、98％或更高和小于100％、98.2％或更高和小于100％、98.4％或更高和小于100％、98.6％或更高和小于100％、98.8％或更高和小于100％、98.9％或更高和小于100％、99％或更高和小于100％、99.1％或更高和小于100％、99.3％或更高和小于100％、99.5％或更高和小于100％、99.77％或更高和小于100％、99.3％或更高和小于100％、99.5％或更高和小于100％、99.7％或更高和小于100％、99.9％或更高和小于100％的序列同源性或序列同一性，或包含所述序列，或由所述序列組成，或基本上由所述序列組成，但不限于此。

29、在本技術(shù)中，術(shù)語(yǔ)“變體多肽”是指通過(guò)保守取代和/或修飾至少一個(gè)氨基酸而與變體多肽突變前的氨基酸序列不同，但保持功能或性質(zhì)的多肽。

30、該變體多肽通常可以通過(guò)修飾多肽的氨基酸序列的至少一個(gè)氨基酸并評(píng)估修飾的多肽的特征來(lái)鑒定。換句話說(shuō)，與突變之前的多肽相比，變體多肽的能力可以增加或不變或減少。此外，一些變體多肽可以包括其中至少一個(gè)部分例如n-末端前導(dǎo)序列或跨膜結(jié)構(gòu)域被去除的變體多肽。另一種變體多肽可以包括其中一部分從成熟蛋白的n-和/或c-末端去除的變體多肽。術(shù)語(yǔ)“變體多肽”可以與諸如突變多肽、修飾多肽、變體多肽、突變蛋白、突變和變體等術(shù)語(yǔ)互換使用(如英語(yǔ)表達(dá)modification、modified?polypeptide、modifiedprotein、mutant、mutein、divergent、variant等)，只要是用作突變含義的術(shù)語(yǔ)即可，不限于此。為了本技術(shù)的目的，變體多肽可以是包含以下氨基酸序列的多肽，在該氨基酸序列中，對(duì)應(yīng)于seq?id?no：51的氨基酸序列中從n-末端開始第139位殘基的氨基酸被另一種氨基酸取代。

31、此外，變體多肽可以包含對(duì)多肽的特性和二級(jí)結(jié)構(gòu)具有最小作用的氨基酸的缺失或添加。例如，在變體多肽的n-末端，可以結(jié)合參與共翻譯或翻譯后蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)(或前導(dǎo))序列。此外，變體多肽可以與另一個(gè)序列或接頭結(jié)合以實(shí)現(xiàn)確認(rèn)、純化或合成。

32、多核苷酸

33、另一方面提供了一種編碼變體多肽的多核苷酸。

34、在本技術(shù)中，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指特定長(zhǎng)度或更長(zhǎng)的dna或rna鏈，其是核苷酸單體通過(guò)共價(jià)鍵連接成長(zhǎng)鏈的核苷酸聚合物。

35、本技術(shù)的多核苷酸可以編碼變體多肽，在該變體多肽中，對(duì)應(yīng)于seq?id?no：51的氨基酸序列中的第139位殘基的氨基酸被另一種氨基酸取代。另外，本技術(shù)的多核苷酸可以包含編碼變體多肽的堿基序列，在該堿基序列中，對(duì)應(yīng)于seq?id?no：62的核苷酸序列中的第415位至第417位的密碼子被編碼其它氨基酸的密碼子取代。作為本技術(shù)的一種實(shí)施方式，本技術(shù)的多核苷酸可以包含編碼選自seq?id?no：52至seq?id?no：61中任何一種seq?idno所述的氨基酸序列的堿基序列。作為本技術(shù)的一種實(shí)施方式，本技術(shù)的多核苷酸可以具有或包含選自seq?id?no：63至seq?id?no：72中的任何一個(gè)序列。此外，本技術(shù)的多核苷酸可以由選自seq?id?no：63至seq?id?no：72中的任何一個(gè)序列組成或基本上由其組成。

36、考慮到旨在表達(dá)本技術(shù)的變體多肽的生物體中的密碼子簡(jiǎn)并性或優(yōu)選密碼子，在不改變本技術(shù)的變體多肽的氨基酸序列的范圍內(nèi)，本技術(shù)的多核苷酸可以在編碼區(qū)中具有各種修飾。具體地，本技術(shù)的多核苷酸可以具有或包含與選自seq?id?no：63至seq?id?no：72中的任何一個(gè)序列具有以下同源性或同一性的堿基序列：70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.1％或更高、99.2％或更高、99.3％或更高、99.4％或更高、99.5％或更高、99.6％或更高、99.7％或更高、99.8％或更高或99.99％或更高，或者可以由以下堿基序列組成、或基本上由以下堿基序列組成：該堿基序列與選自seq?id?no：63至seq?id?no：72中的任何一個(gè)序列具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.1％或更高、99.2％或更高、99.3％或更高、99.4％或更高、99.5％或更高、99.6％或更高、99.7％或更高、99.8％或更高、或99.9％或更高的同源性或同一性，但不限于此。

37、在一種實(shí)施方式中，在具有同源性或同一性的序列中，編碼對(duì)應(yīng)于seq?id?no：51中的第139位的氨基酸的密碼子可以是編碼色氨酸、組氨酸、酪氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或酪氨酸的密碼子之一。在一種具體的實(shí)施方式中，在具有同源性或同一性的序列中，編碼對(duì)應(yīng)于seq?id?no：51中第139位的氨基酸的密碼子可以是編碼堿性氨基酸(精氨酸、組氨酸或賴氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸或谷氨酸)、極性氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺)、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸或甘氨酸的密碼子之一。在一種具體的實(shí)施方式中，在具有同源性或同一性的序列中，編碼對(duì)應(yīng)于seq?id?no：51中第139位的氨基酸的密碼子可以是編碼蘇氨酸、丙氨酸、絲氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、組氨酸或酪氨酸的密碼子之一。在一種具體的實(shí)施方式中，在具有同源性或同一性的序列中，編碼對(duì)應(yīng)于seq?id?no：51中第139位的氨基酸的密碼子可以是編碼酪氨酸的密碼子之一。

38、此外，本技術(shù)的多核苷酸可以包括而不受限，只要它可以是由已知基因序列制備的探針，例如可以在嚴(yán)格條件下與本技術(shù)多核苷酸序列的全部或部分互補(bǔ)的序列雜交的序列?！皣?yán)格條件”是指使多核苷酸之間能夠特異性雜交的條件。該條件在文獻(xiàn)中具體描述(參見j.sambrook等人，molecular?cloning,alaboratory?manual,2nd?edition,cold?springharbor?laboratory?press,cold?spring?harbor,紐約,1989；f.m.ausubel等人，currentprotocols?in?molecular?biology,john?wiley&sons,inc.,紐約,9.50-9.51,11.7-11.8)。例如，可以列出彼此具有高同源性或同一性的多核苷酸(具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.1％或更高、99.2％或更高、99.3％或更高、99.4％或更高、99.5％或更高、99.6％或更高、99.7％或更高、99.8％或更高或99.9％或更高的同源性或同一性的多核苷酸)雜交，而彼此具有比其更低同源性或同一性的多核苷酸不雜交的條件，或在對(duì)應(yīng)于60℃、1×ssc、0.1％sds，具體地60℃、0.1×ssc、0.1％sds，更具體地68℃、0.1×ssc、0.1％sds的鹽濃度和溫度(其是常見southern雜交的洗滌條件)下進(jìn)行洗滌1次、具體地洗滌2次至3次的條件。

39、雜交要求兩個(gè)核酸具有互補(bǔ)序列，盡管堿基之間根據(jù)雜交的嚴(yán)格性而可以錯(cuò)配。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”用于描述能夠彼此雜交的核苷酸堿基之間的關(guān)系。例如，關(guān)于dna，腺嘌呤與胸腺嘧啶互補(bǔ)，胞嘧啶與鳥嘌呤互補(bǔ)。因此，本技術(shù)的多核苷酸還可以不僅包含基本上類似的核酸序列，還包含與整個(gè)序列互補(bǔ)的分離的核酸片段。

40、具體地，可以使用包括在tm值為55℃下的雜交步驟的雜交條件，并使用上述條件來(lái)檢測(cè)與本技術(shù)的多核苷酸具有同源性或同一性的多核苷酸。此外，tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)目的適當(dāng)?shù)卣{(diào)整。

41、雜交多核苷酸的適當(dāng)嚴(yán)格性取決于多核苷酸的長(zhǎng)度和互補(bǔ)性程度，并且變量在本領(lǐng)域是公知的(例如，j.sambrook等人，同上)。

42、在本說(shuō)明書中，多核苷酸(可與“基因”可互換地使用)或多肽(可與“蛋白質(zhì)”可互換地使用)“包含特定的核酸序列或氨基酸序列或由特定的核酸序列或氨基酸序列組成或表達(dá)為特定的核酸序列或氨基酸序列”可指多核苷酸或多肽基本上包括特定的核酸序列或氨基酸序列，并且其可被解釋為包括“基本上等同的序列”，其中在維持多核苷酸或多肽的原始功能和/或所需功能(或不排除無(wú)意義的突變)的范圍內(nèi)，對(duì)特定核酸序列或氨基酸序列應(yīng)用無(wú)意義的突變(缺失、取代、修飾和/或添加)。

43、在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“同源性”或“同一性”是指兩個(gè)給定氨基酸序列或堿基序列之間的相似程度，并且可以表示為百分比。術(shù)語(yǔ)同源性和同一性通常可以互換使用。

44、保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)陣列算法來(lái)確定，并且可以一起使用由所使用的程序建立的默認(rèn)空位罰分。基本上，同源性或同一性的序列通常可以在中等或高嚴(yán)格條件下與序列的整體或部分雜交。顯然，雜交還包括與多核苷酸中含有共同密碼子或考慮到密碼子簡(jiǎn)并性的密碼子的多核苷酸雜交。

45、任何兩個(gè)多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以諸如使用pearson等人(1988)[proc.natl.acad.sci.usa?85]:2444中的默認(rèn)參數(shù)，使用已知的計(jì)算機(jī)算法諸如“fasta”程序來(lái)確定。另外，可以使用如在emboss包(emboss：the?europeanmolecular?biology?open?software?suite,rice等人,2000,trends?genet.16:276-277)(版本5.0.0或以后版本)(包括gcg程序包(devereux,j.等人,nucleic?acids?research12:387(1984))的needleman程序中所執(zhí)行的needlean-wunsch算法(needleman和wunsch，1970，j.mol.biol.48：443-453)、blastp、blastn、fasta(atschul,[s.][f.,]等人,j?molecbiol?215]:403(1990)；guide?to?huge?computers,martin?j.bishop,[編]academicpress,san?diego,1994,以及[carillo等人.](1988)siam?japplied?math?48:1073)來(lái)確定。例如，可以使用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息數(shù)據(jù)庫(kù)中心的blast或clustalw來(lái)確定同源性、相似性或同一性。

46、多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以通過(guò)使用例如smith和waterman,adv.appl.math(1981)2:482中已知的，例如gap計(jì)算機(jī)程序如needleman等人(1970),j?molbiol.48:443比較序列信息來(lái)確定?？傊?，gap程序可以定義為通過(guò)將兩個(gè)序列中較短的序列中的符號(hào)總數(shù)除以類似比對(duì)符號(hào)(即，核苷酸或氨基酸)得到的值。gap程序的默認(rèn)參數(shù)可以包括(1)二元比較矩陣(包括相同值為1和不同值為0)和gribskov等人(1986)nucl.acidsres.14:6745的加權(quán)比較矩陣，在schwartz和dayhoff編，atlas?of?protein?sequence?andstructure,national?biomedical?research?foundation,第353-358頁(yè)(1979)中公開(或ednafull(ncbi?nuc4.4的emboss版)取代矩陣)；(2)每個(gè)空位的罰分為3.0并且每個(gè)空位的每個(gè)符號(hào)額外罰分0.10(或空位開放罰分為10，空位延伸罰分為0.5)；以及(3)末端空位沒有罰分。

47、在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“對(duì)應(yīng)于”是指多肽中列出的位置處的氨基酸殘基，或與多肽中列出的殘基相似、相同或同源的氨基酸殘基。確認(rèn)對(duì)應(yīng)位置處的氨基酸可以為確定參考特定序列的序列中的特定氨基酸。本技術(shù)中使用的“對(duì)應(yīng)區(qū)域”通常是指相關(guān)蛋白質(zhì)或參考蛋白質(zhì)中相似或?qū)?yīng)的位置。

48、例如，任何氨基酸序列與seq?id?no：52對(duì)齊，并且基于此，可以通過(guò)參考對(duì)應(yīng)于seq?id?no：52的氨基酸殘基的氨基酸殘基的編號(hào)位置，來(lái)對(duì)氨基酸序列的每個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)。例如，本技術(shù)中描述的序列比對(duì)算法可以與查詢序列(也稱為“參考序列”)比較來(lái)確認(rèn)氨基酸的位置，或者發(fā)生諸如替換、插入或缺失等的修飾的位置。

49、對(duì)于這種比對(duì)，例如可以使用needlean-wunsch算法(needleman和wunsch，1970,j.mol.biol.48:443-453)、emboss包的needle程序(emboss：the?european?molecularbiology?open?software?suite,rice?et?al.,2000),trends?genet.16:276-277)等，但不限于此，并且可以適當(dāng)?shù)厥褂帽绢I(lǐng)域已知的序列比對(duì)程序、成對(duì)序列比較算法等。

50、在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)多肽活性的“增強(qiáng)”是指多肽的活性與內(nèi)源活性相比增加。增強(qiáng)可以與諸如活化、上調(diào)、過(guò)表達(dá)、增加等術(shù)語(yǔ)互換使用。本文中，活化、上調(diào)、過(guò)表達(dá)和增加可包括表現(xiàn)出原始不存在的活性，或表現(xiàn)出與內(nèi)源活性或修飾前的活性相比改善的活性。“內(nèi)源活性”是指當(dāng)由于天然或人工因素引起的遺傳突變而性狀改變時(shí)，由性狀改變前的親本菌株或未修飾微生物最初具有的特定多肽的活性。這可以與“修飾前活性”互換使用。與內(nèi)源活性相比，多肽活性“增強(qiáng)”、“上調(diào)”、“過(guò)表達(dá)”或“增加”是指與在性狀改變之前的親本菌株或未修飾微生物最初具有的特定多肽的活性和/或濃度(表達(dá)水平)相比，多肽活性改善。

51、增強(qiáng)可通過(guò)引入外源多肽來(lái)實(shí)現(xiàn)或可以是增強(qiáng)內(nèi)源多肽的活性和/或濃度(表達(dá)水平)?？梢酝ㄟ^(guò)活性程度、相應(yīng)多肽的表達(dá)水平或從相應(yīng)多肽釋放的產(chǎn)物量的增加來(lái)確認(rèn)多肽活性是否增強(qiáng)。

52、對(duì)于多肽活性的增強(qiáng)，可以應(yīng)用本領(lǐng)域公知的各種方法，并且沒有限制，只要靶多肽的活性能夠與修飾之前微生物的活性相比增強(qiáng)即可。具體地，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的基因工程和/或蛋白質(zhì)工程，它們是分子生物學(xué)的常規(guī)方法，但不限于此(例如，sitnicka等人，functional?analysis?of?genes.advances?in?cell?biology.2010,vol.2.1-16,sambrook等人，molecular?cloning2012等)。

53、具體地，本技術(shù)多肽的增強(qiáng)可以為：

54、1)編碼多肽的多核苷酸的細(xì)胞拷貝數(shù)增加；

55、2)用具有強(qiáng)活性的序列替換染色體上編碼多肽的基因表達(dá)調(diào)控區(qū)；

56、3)修飾編碼多肽的基因轉(zhuǎn)錄組的起始密碼子或5’-utr區(qū)的堿基序列；

57、4)修飾多肽的氨基酸序列，以增強(qiáng)多肽的活性；

58、5)修飾編碼多肽的多核苷酸序列，以增強(qiáng)多肽的活性(例如，修飾多肽基因的多核苷酸以編碼經(jīng)修飾以增強(qiáng)多肽活性的多肽)；

59、6)引入表現(xiàn)出多肽活性的外源多肽或編碼多肽的外源多核苷酸；

60、7)密碼子優(yōu)化編碼多肽的多核苷酸；

61、8)通過(guò)分析多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)并選擇暴露位點(diǎn)的修飾或化學(xué)修飾；或

62、9)選自上述1)至8)中的至少2種的組合，但不限于此。

63、更具體地，上述1)中編碼多肽的多核苷酸的細(xì)胞中拷貝數(shù)的增加可以通過(guò)引入載體來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述載體可以獨(dú)立于宿主復(fù)制并起作用，其中編碼相應(yīng)多肽的多核苷酸可操作地連接。除此之外，可以通過(guò)將編碼相應(yīng)多肽的多核苷酸的1個(gè)拷貝或2個(gè)拷貝以上引入宿主細(xì)胞的染色體中來(lái)實(shí)現(xiàn)。引入染色體可以通過(guò)將能夠?qū)⒍嗪塑账岵迦胨拗骷?xì)胞染色體中的載體中而引入宿主細(xì)胞中來(lái)進(jìn)行，但不限于此。載體如上文所述。

64、上述2)中用具有強(qiáng)活性的序列替換染色體上編碼多肽的基因表達(dá)調(diào)控區(qū)(或表達(dá)調(diào)控序列)可以是例如通過(guò)缺失、插入、非保守或保守取代或其組合而發(fā)生序列的突變，以進(jìn)一步增強(qiáng)表達(dá)調(diào)控區(qū)的活性，或用具有更強(qiáng)活性的序列替換。表達(dá)調(diào)控區(qū)不特別地限于此，但可以包含啟動(dòng)子、操作子序列、編碼核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列等。作為一個(gè)實(shí)例，可以用強(qiáng)啟動(dòng)子替換原始啟動(dòng)子，但不限于此。

65、已知的強(qiáng)啟動(dòng)子的實(shí)例包括cj1至cj7啟動(dòng)子(美國(guó)專利us?7662943?b2)、lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、λ噬菌體pr啟動(dòng)子、pl啟動(dòng)子、tet啟動(dòng)子、gapa啟動(dòng)子、spl7啟動(dòng)子、spl13(sm3)啟動(dòng)子(美國(guó)專利us10584338?b2)、o2啟動(dòng)子(美國(guó)專利us10273491?b2)、tkt啟動(dòng)子、ycca啟動(dòng)子等，但不限于此。

66、上述3)中修飾編碼多肽的基因轉(zhuǎn)錄組的起始密碼子或5’-utr區(qū)的堿基序列可以是例如用編碼與內(nèi)源性起始密碼子相比具有更高多肽表達(dá)速率的另一種起始密碼子的堿基序列取代，但不限于此。

67、上述4)和5)的氨基酸序列或多核苷酸序列的修飾可以是通過(guò)缺失、插入、非保守性或保守取代或其組合在序列中發(fā)生突變，或者用改善以具有更強(qiáng)的活性氨基酸序列或多核苷酸序列替換多肽的氨基酸序列或編碼多肽的多核苷酸序列，從而增強(qiáng)多肽的活性，但不限于此。可以具體通過(guò)同源重組將多核苷酸插入染色體進(jìn)行替換，但不限于此。然后使用的載體還可以包括用于確認(rèn)染色體插入的選擇標(biāo)記物。選擇標(biāo)記物如上文所述。

68、上述6)中引入表現(xiàn)出多肽活性的外源多肽或編碼可以是將編碼表現(xiàn)出與多肽相同/相似活性的多肽的外源多核苷酸引入宿主細(xì)胞中。外源多核苷酸的來(lái)源或序列不受限制，只要其表現(xiàn)出與多肽相同/相似的活性即可。引入所使用的方法可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)適當(dāng)?shù)剡x擇已知的轉(zhuǎn)化方法，并且通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)引入的多核苷酸來(lái)進(jìn)行，可以生產(chǎn)多肽并且可以增加其活性。

69、上述7)中密碼子優(yōu)化編碼多肽的多核苷酸可以是密碼子優(yōu)化使得在宿主細(xì)胞中增加內(nèi)源多核苷酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或密碼子優(yōu)化使得外源多核苷酸在宿主細(xì)胞中優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和翻譯。

70、上述8)中通過(guò)分析多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)并選擇暴露位點(diǎn)的修飾或化學(xué)修飾可通過(guò)比較待分析的多肽的序列信息來(lái)根據(jù)序列的相似程度確定模板蛋白候選物，基于此確定結(jié)構(gòu)并選擇待修飾或化學(xué)修飾的暴露位點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化或修飾。

71、此類多肽活性的增強(qiáng)可以是基于野生型或修飾前的微生物菌株中表達(dá)的多肽的活性或濃度，相應(yīng)多肽的活性或濃度表達(dá)水平增加，或由相應(yīng)多肽生產(chǎn)的產(chǎn)物的量增加，但不限于此。

72、重組載體

73、其它實(shí)施方式提供了一種包含多核苷酸的重組載體。重組載體可以用作多肽的表達(dá)載體。重組載體可以用于將多核苷酸插入宿主細(xì)胞的基因組中或替換宿主細(xì)胞基因組的相應(yīng)基因。

74、本技術(shù)的載體可包含dna制備物，所述dna制備物包含編碼靶多肽的多核苷酸的堿基序列，所述堿基序列可操作地連接至合適的表達(dá)調(diào)控區(qū)(或表達(dá)調(diào)控序列)，以使得靶多肽在適當(dāng)宿主中表達(dá)。表達(dá)調(diào)控區(qū)可包含能夠起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、調(diào)控此類轉(zhuǎn)錄的任何操縱子序列、編碼合適mrna核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列和調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。載體轉(zhuǎn)化至合適的宿主細(xì)胞后，可以獨(dú)立于宿主基因組復(fù)制或運(yùn)行，并且整合到基因組本身中。

75、本技術(shù)中使用的載體沒有特別限制，并且可以使用本領(lǐng)域已知的任何載體。常用載體的實(shí)例可以包括天然狀態(tài)或重組狀態(tài)的質(zhì)粒、粘粒、病毒和噬菌體。例如，可以使用pwe15、m13、mbl3、mbl4、ixii、ashii、apii、t10、t11、charon4a和charon21a等作為噬菌體載體或粘粒載體，并且可以使用基于pdz、基于pbr、基于puc、基于pbluescript?ii、基于pgem、基于ptz、基于pcl和基于pet等作為質(zhì)粒載體。具體地，可以使用pdz、pdc、pdcm2、pacyc177、pacyc184、pcl、peccg117、puc19、pbr322、pmw118、pcc1bac、ptop33ori載體等。

76、作為一種實(shí)例，可以通過(guò)用于將染色體插入細(xì)胞的載體，將編碼靶多肽的多核苷酸插入染色體中。多核苷酸插入染色體可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行，例如同源重組，但不限于此。可以進(jìn)一步包括選擇標(biāo)記物，用于確認(rèn)染色體是否被插入。選擇標(biāo)記物用于選擇載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即，確認(rèn)是否插入靶核酸分子，可以使用賦予可選擇表型例如耐藥性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型、細(xì)胞毒性劑抗性或表面多肽的表達(dá)的標(biāo)記物。在用選擇性試劑處理的環(huán)境中，僅表達(dá)選擇標(biāo)記物的細(xì)胞存活或顯示其它表型，因此可以選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。

77、在本公開中，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”意指將包含編碼靶多肽的多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞或微生物中，以在宿主細(xì)胞中表達(dá)由多核苷酸編碼的多肽。轉(zhuǎn)化的多核苷酸可以包括所有的多核苷酸，而不管它們是否插入并位于宿主細(xì)胞的染色體或位于染色體外部，只要轉(zhuǎn)化的多核苷酸可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)即可。此外，所述多核苷酸包含編碼靶多肽的dna和/或rna。多核苷酸可以以任何形式引入，只要其可以引入宿主細(xì)胞并表達(dá)即可。例如，可以以表達(dá)盒的形式將多核苷酸引入宿主細(xì)胞，所述表達(dá)盒是包含自我表達(dá)所需的所有元件的基因結(jié)構(gòu)。表達(dá)盒通?？梢园刹僮鞯剡B接到多核苷酸的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和翻譯終止信號(hào)。表達(dá)盒可以是能夠自我復(fù)制的表達(dá)載體的形式。此外，多核苷酸可以自身的形式引入宿主細(xì)胞中，并且可操作地連接到宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的序列，但不限于此。

78、此外，在以上內(nèi)容中，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指能夠啟動(dòng)和介導(dǎo)編碼本技術(shù)的目標(biāo)變體的多核苷酸轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列與該多核苷酸序列功能性地連接。

79、微生物

80、其它方面提供了一種微生物，包含選自由變體多肽、編碼(encoding)(或編碼(coding))多肽的多核苷酸以及包含多核苷酸的重組載體所組成的組中的至少一種(例如，1種或多種、2種或更多種，或1種、2種或3種)。在一種實(shí)施方式中，微生物可以是其中β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力增加(或增強(qiáng))的微生物。

81、在本技術(shù)中，術(shù)語(yǔ)“微生物(或菌株)”包括所有野生型微生物、天然或人工發(fā)生遺傳修飾的微生物，并且微生物可以是包含生產(chǎn)靶多肽、蛋白質(zhì)或產(chǎn)物(例如天冬氨酸1-脫羧酶)的遺傳修飾的微生物，所述微生物是由于例如外源基因被插入和/或內(nèi)源基因的活性被增強(qiáng)或失活的原因而特定機(jī)制被弱化或強(qiáng)化的微生物。

82、本技術(shù)的微生物可以是通過(guò)包含變體多肽或編碼其的多核苷酸的載體遺傳修飾的微生物(例如重組微生物)，但不限于此。載體如上文所述。

83、本技術(shù)的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可以是具有β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力或具有改善的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)的微生物。

84、本技術(shù)的微生物可以是天然具有β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力的微生物，或與不具有β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力的微生物相比，賦予或提高β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力的微生物，但不限于此。賦予或提高β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力的微生物可以是其中引入具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的變體多肽的微生物。

85、所述微生物(或菌株，重組細(xì)胞)具有增加(或提高)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)，或具有β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力，可表示與未修飾微生物、重組前的細(xì)胞、親本菌株、野生型菌株或其中引入源自其他微生物(例如，野生型赤擬谷盜)的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可具有提高的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力；或賦予所述微生物與未修飾微生物、重組前的細(xì)胞、親本菌株和/或不具有β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物生產(chǎn)能力的野生型菌株不同的β-丙氨酸或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力。

86、本技術(shù)的微生物可以是包含本技術(shù)的變體多肽、編碼本技術(shù)的變體多肽的多核苷酸和包含本技術(shù)的多核苷酸的載體中的任何一種或多種的微生物；修飾以表達(dá)本技術(shù)的變體多肽或本技術(shù)的多核苷酸的微生物；表達(dá)本技術(shù)的變體或本技術(shù)的多核苷酸的微生物(例如重組菌株)；或具有本技術(shù)的變體多肽的活性的微生物(例如重組菌株)，但不限于此。

87、在一種實(shí)施方式中，本技術(shù)的微生物可以是棒狀桿菌屬微生物。該棒狀桿菌屬微生物可以是選自谷氨酸棒狀桿菌、生乳棒狀桿菌(corynebacteriumcrudilactis)、沙漠棒狀桿菌(corynebacterium?deserti)、有效棒狀桿菌(corynebacterium?efficiens)、帚石南棒狀桿菌(corynebacterium?callunae)、停滯棒狀桿菌(corynebacterium?stationis)、單一棒狀桿菌屬(corynebacterium?singulare)、耐鹽棒狀桿菌(corynebacteriumhalotolerans)、紋帶棒狀桿菌(corynebacterium?striatum)、產(chǎn)氨棒狀桿菌(corynebacterium?ammoniagenes)、污染棒狀桿菌(corynebacterium?pollutisoli)、亞胺棒狀桿菌(corynebacterium?imitans)、龜口腔棒狀桿菌(corynebacteriumtestudinoris)和微黃棒狀桿菌(corynebacterium?flavescens)所組成的組中的至少一種。

88、與相同種類的未修飾微生物相比，微生物可以具有提高的(增加的)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力。在本技術(shù)中，術(shù)語(yǔ)“未修飾的微生物”不排除包含可以天然地存在于微生物中的突變的菌株，可以指野生型菌株或天然菌株本身，或由于天然或人工因素導(dǎo)致的基因突變而改變性狀前的菌株。例如，根據(jù)一種實(shí)施方式，未修飾的微生物可以指其中未引入本技術(shù)的變體多肽、或未引入編碼該變體多肽的多核苷酸、或在其引入之前的菌株。另外，“未修飾的微生物”可以指引入源自野生型赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶或編碼其的多核苷酸的菌株。“未修飾的微生物”可以與“修飾前的菌株”、“修飾前的微生物”、“未突變的菌株”、“未修飾的菌株”、“未突變的微生物”或“參考微生物”互換使用。在一種實(shí)施方式中，未修飾的微生物是用于比較β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力是否增加的受試菌株，可以具體地為野生型谷氨酸棒狀桿菌atcc13032菌株，或其中引入野生型赤擬谷盜的pand而不是野生型谷氨酸棒狀桿菌atcc13032菌株的pand的菌株，但不限于此。

89、微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可以包括突變以另外增加β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的產(chǎn)生，并且突變的位置和任何種類的經(jīng)受突變的基因和/或蛋白質(zhì)的位置可以包括但不限于，只要它增加β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)即可。重組細(xì)胞可以無(wú)限制地使用，只要它是能夠轉(zhuǎn)化的細(xì)胞即可。

90、在一種具體實(shí)施方式中，微生物可以是保藏編號(hào)kccm13077p。

91、β-丙氨酸衍生化合物可以是選自由β-硝基丙酸、β-氨基-丙腈、n-乙?；?β-丙氨酸、l-天冬氨酸、鵝肌肽、精胺、肌肽、β-丙氨酰精氨酸、羥基喹啉銅(quinolinate)、泛酸鹽(或泛酸)、丙二酸半醛、丙二酸鹽、乙炔-單羧酸鹽等所組成的組中的至少一種，但不限于此。

92、在其它實(shí)施方式中，與突變前的親本菌株、未修飾的微生物，引入源自另一種微生物的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物或引入源自野生型赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，具有提高的(增加的)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可以具有增加約100％或更多、約110％或更多、約120％或更多、約130％或更多、約140％或更多或約150％或更多的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)，但不限于此。

93、在其它實(shí)施方式中，與突變前的親本菌株、未修飾的微生物、引入源自另一種微生物的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物或引入源自野生型赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，具有提高的(增加的)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可以具有增加約2.0倍或更多、約2.1倍或更多、約2.2倍或更多、約2.3倍或更多、約2.4倍或更多或約2.5倍或更多的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)，但不限于此。

94、在另一種實(shí)施方式中，與突變前的親本菌株、未修飾的微生物、引入源自另一種微生物的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物或引入源自野生型赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，具有提高的(增加的)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可具有增加約1.0g/l或更大、約1.1g/l或更大、約1.2g/l或更大、約1.3g/l或更大、約1.4g/l或更大或約1.5g/l或更大的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)，但不限于此。

95、更具體地，與突變前的親本菌株、未修飾的微生物、引入源自另一種微生物的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物或引入源自野生型赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，具有提高的(增加的)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可具有增加約100％、約110％、約120％、約130％、約140％或約150％(或約2.0倍、約2.1倍、約2.2倍、約2.3倍、約2.4倍或約2.5倍；或約1.0g/l、約1.1g/l、約1.2g/l、約1.3g/l、約1.4g/l或約1.5g/l)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)，但不限于此。

96、在另一種實(shí)施方式中，與突變前的親本菌株、未修飾的微生物、引入源自另一種微生物的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物或引入源自野生型赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，具有提高的(增加的)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可具有增加約5％或更多、約10％或更多、約15％或更多、約20％或更多、約25％或更多、約30％或更多、約35％或更多、約40％或更多、約45％或更多、約50％或更多、約55％或更多、約60％或更多、約70％或更多、約80％或更多、約90％或更多、約100％或更多、約110％或更多、約120％或更多、125％或更多、約130％或更多、約140％或更多、或約150％或更多的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物(例如泛酸)的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)，但不限于此。

97、在另一種實(shí)施方式中，與突變前的親本菌株、未修飾的微生物、引入源自另一種微生物的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物或引入源自野生型赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，具有提高的(增加的)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可具有增加約1.05倍或更多、約1.1倍或更多、約1.15倍或更多、約1.2倍或更多、約1.25倍或更多、約1.3倍或更多、約1.35倍或更多、約1.4倍或更多、約1.45倍或更多、約1.5倍或更多、約1.55倍或更多、約1.6倍或更多、約1.7倍或更多、約1.8倍或更多、約1.9倍或更多、約2倍或更多、約2.1倍或更多、約2.2倍或更多、約2.25倍或更多、約2.3倍或更多、約2.4倍或更多或約2.5倍或更多的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)，但不限于此。

98、在另一種實(shí)施方式中，與突變前的親本菌株、未修飾的微生物、引入源自另一種微生物的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物或引入源自野生型赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，具有提高的(增加的)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可具有增加約0.05g/l或更大、約0.06g/l或更大、約0.07g/l或更大、約0.08g/l或更大、約0.09g/l或更大、約0.1g/l或更大、約0.13g/l或更大、約0.16g/l或更大、約0.19g/l或更大、約0.2g/l或更大、約0.23g/l或更大、約0.26g/l或更大、約0.29g/l或更大、約0.3g/l或更大、約0.33g/l或更大、約0.36g/l或更大、約0.39g/l或更大、約0.4g/l或更大、約0.43g/l或更大、約0.46g/l或更大、約0.49g/l或更大、約0.5g/l或更大、約0.53g/l或更大、約0.56g/l或更大、約0.59g/l或更大、約0.6g/l或更大、約0.63g/l或更大、約0.67g/l或更大、約0.69g/l或更大、約0.7g/l或更大、約0.8g/l或更大、約0.9g/l或更大、或約1.0g/l或更大的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)，但不限于此。

99、更具體地，與突變前的親本菌株、未修飾的微生物、引入源自另一種微生物的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物或引入源自野生型赤擬谷盜的天冬氨酸1-脫羧酶的微生物相比，具有提高的(增加的)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)的微生物(或菌株、重組細(xì)胞)可具有增加約10％、約15％、約20％、約25％、約35％、約40％、約55％、約100％或約125％(或約1.1倍、約1.15倍、約1.2倍、約1.25倍、約1.35倍、約1.4倍、約1.55倍、約2倍或2.25倍；或約0.06g/l、約0.1g/l、約0.13g/l、約0.16g/l、約0.23g/l、約0.26g/l、約0.36g/l、約0.5g/l或約0.6g/l)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)能力(或產(chǎn)量)，但不限于此。

100、術(shù)語(yǔ)“約”是包括所有±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等的范圍，并且包括在與術(shù)語(yǔ)約后的數(shù)值等同或相似范圍內(nèi)的所有數(shù)值，但不限于此。

101、其它方面提供了一種生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的組合物，其包含本技術(shù)的微生物、其中培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基或其組合。

102、本技術(shù)的組合物還可以包含通常用于生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的組合物的任何合適的賦形劑，并且該賦形劑可以是例如防腐劑、潤(rùn)濕劑、分散劑、懸浮劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑或張力劑等，但不限于此。

103、在本技術(shù)的組合物中，微生物(菌株)或培養(yǎng)基等如上文其它方面所述。

104、其它方面提供了一種生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本技術(shù)的微生物。

105、本技術(shù)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)方法可以包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本技術(shù)的微生物。本技術(shù)的微生物如上文所述。

106、在本技術(shù)中，“培養(yǎng)”是指在適當(dāng)調(diào)節(jié)的環(huán)境條件下生長(zhǎng)本技術(shù)的包含變體多肽的微生物。本技術(shù)的培養(yǎng)過(guò)程可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的適當(dāng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行。根據(jù)選擇的菌株，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地調(diào)節(jié)和使用該培養(yǎng)過(guò)程。具體地，培養(yǎng)可以是分批、連續(xù)和/或分批補(bǔ)料，但不限于此。

107、在本技術(shù)中，“培養(yǎng)基”是指將培養(yǎng)本技術(shù)的微生物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為主要組分混合的材料，并提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子等，包括對(duì)于生存和生長(zhǎng)至關(guān)重要的水。具體地，可以使用用于培養(yǎng)本技術(shù)的微生物的培養(yǎng)基和其他培養(yǎng)條件，只要它是用于培養(yǎng)普通微生物的培養(yǎng)基而沒有特別限制，但是本技術(shù)的微生物可以在需氧條件下通過(guò)調(diào)節(jié)溫度、ph等在含有合適碳源、氮源、磷源、無(wú)機(jī)化合物、氨基酸和/或維生素等的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

108、具體地，用于本技術(shù)的微生物的培養(yǎng)基，例如棒狀桿菌屬菌株的培養(yǎng)基可見于文獻(xiàn)["manual?of?methods?for?general?bacteriology"by?the?american?society?forbacteriology(washington?d.c.,usa,1981)]。

109、在本技術(shù)中，作為碳源可以包括：碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等；糖醇，諸如甘露醇、山梨醇等；有機(jī)酸，諸如丙酮酸、乳酸、檸檬酸等；氨基酸，諸如谷氨酸、蛋氨酸、賴氨酸等。此外，可以使用天然有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，例如淀粉水合物、糖蜜、赤糖糊、米糠、木薯、甘蔗殘余物和玉米漿，并且具體地，可以使用碳水化合物諸如葡萄糖和滅菌的預(yù)處理糖蜜(即，用還原糖轉(zhuǎn)化的糖蜜)等，并且可以不同地使用適當(dāng)量的其他碳源，而沒有限制。這些碳源可以單獨(dú)使用或可以至少兩種組合使用，但不限于此。

110、作為氮源，可以使用：無(wú)機(jī)氮源，諸如氨、硫酸銨、氯化銨、檸檬酸銨、磷酸銨、碳酸銨、硝酸銨等；有機(jī)氮源，諸如氨基酸，包括谷氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺等，蛋白胨、nz-胺、肉提取物、酵母提取物、麥芽提取物、玉米漿、酪蛋白水合物、魚或其降解產(chǎn)物、脫脂大豆餅或其降解產(chǎn)物等。這些氮源可以單獨(dú)使用或可以至少兩種組合使用，但不限于此。

111、作為磷源，可以包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或與其對(duì)應(yīng)的含鈉的鹽等。作為無(wú)機(jī)化合物，可以使用氯化鈉、氯化鈣、氯化鐵、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳、碳酸鈣等。除這些之外，可以包括氨基酸、維生素和/或適當(dāng)?shù)那绑w等。這些組分或前體可以分批或連續(xù)方法添加。然而，不限于此。

112、此外，通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ诒炯夹g(shù)的微生物的培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)基中加入諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸、硫酸等的化合物，來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的ph。此外，在培養(yǎng)期間，可以使用消泡劑如脂肪酸聚乙二醇酯抑制起泡。此外，為了維持培養(yǎng)基的需氧狀態(tài)，可以將氧氣或含氧氣體注入培養(yǎng)基中，或者為了保持無(wú)氧和微氧狀態(tài)，可以不注入氣體或者可以注入氮?dú)?、氫氣或二氧化碳?xì)怏w，但不限于此。

113、在本技術(shù)的培養(yǎng)中的培養(yǎng)溫度可以保持在20℃-45℃，具體為25℃-40℃，并且培養(yǎng)可以進(jìn)行約10-160小時(shí)，但不限于此。

114、通過(guò)本技術(shù)的培養(yǎng)生產(chǎn)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物可以釋放到培養(yǎng)基中或保留在細(xì)胞中。

115、本技術(shù)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)方法，例如在培養(yǎng)之前可進(jìn)一步包括制備本技術(shù)的微生物(菌株)，制備用于培養(yǎng)該微生物的培養(yǎng)基，或其組合(以任何順序)。

116、本技術(shù)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)方法可進(jìn)一步包括根據(jù)培養(yǎng)，從培養(yǎng)基(其中進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基)或微生物(例如，棒狀桿菌屬菌株)中回收β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物?；厥湛梢赃M(jìn)一步包括在培養(yǎng)之后。

117、回收可以根據(jù)本技術(shù)的微生物的培養(yǎng)方法例如分批、連續(xù)或分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法等，通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的適當(dāng)方法收集目標(biāo)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物。例如，可以使用離心、過(guò)濾、通過(guò)結(jié)晶蛋白質(zhì)沉淀劑(鹽析法)處理、萃取、超聲破碎、超濾、透析、各種色譜法(諸如分子篩色譜法(凝膠過(guò)濾)、吸附色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法等)、hplc或這些方法的組合，并且使用本領(lǐng)域已知的適當(dāng)方法，可以從培養(yǎng)基或微生物中回收目標(biāo)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物。

118、此外，本技術(shù)的β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的生產(chǎn)方法還可以包括純化步驟?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的適當(dāng)方法進(jìn)行純化。在一種實(shí)施方式中，當(dāng)本技術(shù)的生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的方法包括回收步驟和純化步驟二者時(shí)，可以連續(xù)或非連續(xù)地進(jìn)行回收步驟和純化步驟而不管順序如何，或者可以通過(guò)整合為一個(gè)步驟來(lái)進(jìn)行，而不限于此。

119、其它方面提供了一種本技術(shù)的微生物用于生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物或制備用于生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的組合物的用途。本技術(shù)的微生物、β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物或生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的組合物如上文所述。

120、有益效果

121、本技術(shù)提供了一種具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的變體多肽、一種包含該變體多肽的微生物、一種生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的包含該微生物的組合物，以及一種生產(chǎn)β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的方法，所述方法包括培養(yǎng)所述微生物，并且所述微生物具有β-丙氨酸和/或β-丙氨酸衍生化合物的優(yōu)異生產(chǎn)能力。