本公開涉及用于跨越血腦屏障的方法和靶向肽。

背景技術(shù)：

1、血腦屏障(bbb)是開發(fā)有效的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)研究工具和療法的根本瓶頸。此結(jié)構(gòu)主要包括腦內(nèi)皮細(xì)胞，這需要通過侵入性顱內(nèi)注射、技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性的聚焦超聲或受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用來遞送大分子。長(zhǎng)期以來，由于對(duì)轉(zhuǎn)胞吞作用中所涉及的機(jī)制的不完全理解，阻礙了bbb跨越的大分子的合理設(shè)計(jì)，其中僅有如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等少數(shù)靶標(biāo)被驗(yàn)證用于研究和療法。

2、因此，需要鑒定bbb跨越的靶標(biāo)、機(jī)制、分子和方法，以改善cns的研究工具和療法的效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本文所公開的包含一種增加血腦屏障的滲透性的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括提供能夠與碳酸酐酶iv結(jié)合的靶向肽，由此增加血腦屏障的滲透性。在一些實(shí)施例中，該碳酸酐酶iv的至少一種活性通過與靶向肽的結(jié)合而降低。本文還提供了包含一種增加血腦屏障的滲透性的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括降低碳酸酐酶iv活性，由此增加該血腦屏障的滲透性。在本文所公開的方法中，該靶向肽可以例如與該碳酸酐酶iv的鋅結(jié)合位點(diǎn)和/或疏水性底物結(jié)合口袋結(jié)合。在一些實(shí)施例中，如與不存在靶肽或碳酸酐酶iv活性降低的情況相比，該血腦屏障的滲透性增加了至少25％、50％、75％、100％或更多。本文還提供了包含一種將有效負(fù)載遞送到神經(jīng)系統(tǒng)的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括提供能夠與碳酸酐酶iv結(jié)合的靶向肽或其衍生物，其中該靶向肽是遞送系統(tǒng)的一部分，并且其中該遞送系統(tǒng)包括該要遞送到神經(jīng)系統(tǒng)的有效負(fù)載；以及向受試者施用該遞送系統(tǒng)。

2、如本文所公開的，該遞送系統(tǒng)可以例如包括納米顆粒、納米管、納米線、樹枝狀大分子、脂質(zhì)體、醇質(zhì)體(ethosome)和水質(zhì)體(aquasome)、聚合物囊泡和非離子表面活性劑囊泡(niosome)、泡沫、水凝膠、立方體、量子點(diǎn)、外泌體、巨噬細(xì)胞和其組合。在一些實(shí)施例中，該遞送系統(tǒng)包括病毒載體或非病毒載體。該病毒載體可以例如包括腺病毒載體、aav載體、慢病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在一些實(shí)施例中，靶肽是aav載體的衣殼蛋白的一部分。該aav載體可以是選自以下的載體：aav1、aav2、aav3、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav-dj、人分離株hu.31、人分離株hu.32、恒河猴分離株rh.8、恒河猴分離株rh.10和其變體。在一些實(shí)施例中，該aav載體是aav9。該非病毒載體可以例如包括基于脂質(zhì)的納米顆粒、聚合物納米顆粒、無機(jī)納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、納米線、二氧化硅納米顆粒、基于肽或蛋白質(zhì)的顆粒、脂質(zhì)-聚合物顆粒、納米脂蛋白顆粒和其組合。

3、在一些實(shí)施例中，該要遞送到神經(jīng)系統(tǒng)的有效負(fù)載是生物分子、非生物分子或其組合。該生物分子可以是核酸序列、蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、多糖或其組合。在一些實(shí)施例中，該有效負(fù)載是治療性分子。在一些實(shí)施例中，該要遞送到神經(jīng)系統(tǒng)的核酸序列包括以下中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：a)營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子或其它可能從經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞釋放并影響該細(xì)胞和/或周圍細(xì)胞的存活率或功能的可溶性因子；b)為攜帶基因中的基因突變的人或動(dòng)物恢復(fù)蛋白質(zhì)功能的cdna；c)編碼可以用于控制或改變細(xì)胞的活性或狀態(tài)的蛋白質(zhì)的cdna；d)編碼用于評(píng)估細(xì)胞的狀態(tài)的蛋白質(zhì)或核酸的cdna；e)用于進(jìn)行基因組工程化的cdna和/或相關(guān)的向?qū)na；f)用于通過同源重組進(jìn)行基因組編輯的序列；g)編碼治療性rna的dna序列；h)shrna或人工mirna遞送系統(tǒng)；或i)影響內(nèi)源性基因的剪接的dna序列。

4、在一些實(shí)施例中，該碳酸酐酶iv是小鼠碳酸酐酶iv。在一些實(shí)施例中，該碳酸酐酶iv具有與seq?id?no:179的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，該碳酸酐酶iv是人碳酸酐酶iv。在一些實(shí)施例中，該碳酸酐酶iv具有與seq?id?no:180的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，在結(jié)合時(shí)，該靶向肽能夠與以下相互作用：(1)一個(gè)或多個(gè)功能上等效于該碳酸酐酶iv中的具有seq?idno:179的氨基酸序列的s20、g21、w22、l36、w41、p42、e90、v111、q112、h114、h139、v141、k143、f156、l217、t218、t219、p220、n221、d223或w228的位置；或(2)一個(gè)或多個(gè)功能上等效于該碳酸酐酶iv中的具有seq?id?no:180的氨基酸序列的s21、h22、w23、l37、w42、g43、m92、k113、q114、h116、h141、v143、e145、q158、l224、t225、t226、p227、t228、d231或w236的位置。在一些實(shí)施例中，該靶向肽包括(1)選自由seq?id?no:70-174組成的組的氨基酸序列；或(2)與選自由seq?id?no:70-174組成的組的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，該靶向肽包括選自seq?id?no:70-108的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，該靶向肽包括選自seq?id?no:70-86的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，該靶向肽包括(1)選自由以下組成的組的氨基酸序列：akptpllgllqaqtg(seq?id?no:70)、akptplllllqaqtg(seq?id?no:71)、aqpplggllaqaqtg(seq?id?no:72)、akppgpwaeaqaqtg(seq?id?no:73)和aqppllgglaqaqtg(seq?id?no:74)；或(2)與選自由seq?id?no:70-74組成的組的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，該靶向肽插入在aav9載體的seq?id?no:178的aa587-594中的兩個(gè)相鄰氨基酸之間，或者插入在與seq?id?no:178至少80％相同的氨基酸序列中的aa587-594的功能等效物之間。在一些實(shí)施例中，該靶向肽插入在該aav9載體的seq?id?no:178的aa588-589之間，或者插入在與seq?id?no:178至少80％相同的氨基酸序列中的aa588-589的功能等效物之間。該aav載體可以例如與納米顆粒、第二分子或其組合綴合。

5、該施用可以是全身施用。在一些實(shí)施例中，該施用是靜脈內(nèi)施用。在一些實(shí)施例中，該施用是鞘內(nèi)施用。該受試者可以是例如哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，該受試者是人。在一些實(shí)施例中，該受試者是患有或有風(fēng)險(xiǎn)患上以下中的一種或多種的受試者：慢性疼痛、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)(friedreich's?ataxia)、亨廷頓氏病(huntington's?disease，hd)、阿爾茨海默氏病(alzheimer's?disease，ad)、帕金森氏病(parkinson's?disease，pd)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(als)、i型和ii型脊髓性肌萎縮癥(sma?i和ii)、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)(fa)、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、多發(fā)性硬化癥(ms)、慢性創(chuàng)傷性腦病(cte)、hiv-1相關(guān)癡呆或涉及cns內(nèi)的細(xì)胞的溶酶體貯積癥。該涉及cns內(nèi)的細(xì)胞的溶酶體貯積癥可以是例如克拉伯病(krabbe?disease)、桑德霍夫病(sandhoff?disease)、泰-薩克斯病(tay-sachs)、戈謝病(gaucher?disease，i型、ii型或iii型)、尼曼-匹克病(niemann-pick?disease，npc1或npc2缺乏癥)、赫爾勒綜合征(hurler?syndrome)、龐貝病(pompe?disease)或巴藤病(battendisease)。在一些實(shí)施例中，該受試者是患有、有風(fēng)險(xiǎn)患上或已經(jīng)患有中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷、癲癇或脊髓損傷的受試者。

6、本文所公開的包含一種aav衣殼蛋白，該aav衣殼蛋白包括對(duì)碳酸酐酶iv具有結(jié)合特異性的靶向肽。在一些實(shí)施例中，該靶向肽是raav載體的衣殼蛋白的一部分。在一些實(shí)施例中，該靶向肽插入在seq?id?no:178的aa587-594中的兩個(gè)相鄰氨基酸之間，或者插入在與seq?id?no:178至少80％相同的氨基酸序列中的aa587-594的功能等效物之間。在一些實(shí)施例中，該靶向肽包括(1)選自由seq?id?no:70-174組成的組的氨基酸序列；(2)與選自由seq?id?no:70-174組成的組的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。aav可以是例如aav1、aav2、aav3、aav3b、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav-dj、人分離株hu.31、人分離株hu.32、恒河猴分離株rh.8、恒河猴分離株rh.10或其變體。在一些實(shí)施例中，該aav載體是aav9。

7、本文所公開的包含一種重組腺相關(guān)病毒(raav)，該raav包括本文所公開的aav衣殼蛋白中的任一種。本文所公開的包含一種raav，該raav包括aav衣殼蛋白，該aav衣殼蛋白包括對(duì)碳酸酐酶iv具有結(jié)合特異性的靶向肽，其中該靶向肽的氨基酸序列插入在該aav衣殼蛋白的aa587-594中的兩個(gè)相鄰氨基酸或其功能等效物之間。在一些實(shí)施例中，該兩個(gè)相鄰氨基酸是aa588和aa589。在一些實(shí)施例中，該靶向肽包括(1)選自seq?id?no:70-174的氨基酸序列；或(2)與選自seq?id?no:70-174的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

8、本文所公開的包含一種用于將藥劑遞送到有需要的受試者的神經(jīng)系統(tǒng)的組合物。在一些實(shí)施例中，該組合物包括aav，該aav包括(1)本文所公開的aav衣殼蛋白中的任一種和(2)要遞送到該受試者的該神經(jīng)系統(tǒng)的藥劑。在一些實(shí)施例中，該神經(jīng)系統(tǒng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)、外周神經(jīng)系統(tǒng)(pns)或其組合。該神經(jīng)系統(tǒng)可以是例如腦內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、腦中的毛細(xì)血管、腦中的小動(dòng)脈、腦中的動(dòng)脈或其組合。在一些實(shí)施例中，該組合物是包括一種或多種藥學(xué)上可接受的載劑的藥物組合物。在一些實(shí)施例中，該要遞送的藥劑包括核酸、肽、小分子、適體或其組合。

9、本文所公開的包含一種抗體或其片段，其中該抗體或其片段包括對(duì)碳酸酐酶iv具有結(jié)合特異性的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，該抗體或其片段包括(1)選自由seq?id?no:70-174組成的組的氨基酸序列；或(2)與選自由seq?id?no:70-174組成的組的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，該抗體或其片段是雙特異性抗體，該雙特異性抗體包括至少一個(gè)對(duì)該碳酸酐酶iv具有特異性的fab。本文所公開的包含一種抗體綴合物，該抗體綴合物包括本文所公開的抗體中的任一種或其片段。在一些實(shí)施例中，該抗體綴合物進(jìn)一步包括治療劑或可檢測(cè)標(biāo)記。

10、本文所公開的包含一種肽或其衍生物或綴合物，其對(duì)碳酸酐酶iv具有特異性。本文所公開的包含一種核酸，該核酸包括編碼本文所公開的抗體中的任一種或其片段或本文所公開的肽中的任一種或其衍生物或綴合物的序列。

11、本文所公開的包含一種遞送系統(tǒng)，該遞送系統(tǒng)包括(1)對(duì)碳酸酐酶iv具有特異性的靶向肽；以及(2)藥劑。在一些實(shí)施例中，該靶向肽(1)顯示在該遞送系統(tǒng)的表面上；或(2)部分嵌入在該遞送系統(tǒng)中。在一些實(shí)施例中，該遞送系統(tǒng)可以選自納米顆粒、納米管、納米線、樹枝狀大分子、脂質(zhì)體、醇質(zhì)體和水質(zhì)體、聚合物囊泡和非離子表面活性劑囊泡、泡沫、水凝膠、立方體、量子點(diǎn)、外泌體、巨噬細(xì)胞和其組合。在一些實(shí)施例中，該遞送系統(tǒng)包括病毒載體或非病毒載體。在一些實(shí)施例中，該遞送系統(tǒng)包括選自以下的納米顆粒：基于脂質(zhì)的納米顆粒、聚合物納米顆粒、無機(jī)納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、納米線、二氧化硅納米顆粒、病毒樣顆粒、基于肽或蛋白質(zhì)的顆粒、脂質(zhì)-聚合物顆粒、納米脂蛋白顆粒和其組合。

12、本文所公開的包含一種設(shè)計(jì)對(duì)碳酸酐酶iv具有特異性的靶向肽的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括：通過計(jì)算機(jī)模擬生成一個(gè)或多個(gè)靶向肽，該一個(gè)或多個(gè)靶向肽各自能夠與以下相互作用：(1)一個(gè)或多個(gè)功能上等效于該碳酸酐酶iv中的具有seq?id?no:179的氨基酸序列的s20、g21、w22、l36、w41、p42、e90、v111、q112、h114、h139、v141、k143、f156、l217、t218、t219、p220、n221、d223或w228的位置；或(2)一個(gè)或多個(gè)功能上等效于該碳酸酐酶iv中的具有seq?id?no:180的氨基酸序列的s21、h22、w23、l37、w42、g43、m92、k113、q114、h116、h141、v143、e145、q158、l224、t225、t226、p227、t228、d231或w236的位置。在一些實(shí)施例中，通過計(jì)算機(jī)模擬生成該一個(gè)或多個(gè)靶向肽包括：通過計(jì)算機(jī)模擬生成多個(gè)候選肽；對(duì)與該碳酸酐酶iv結(jié)合的該多個(gè)候選肽中的每個(gè)候選肽進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助對(duì)接模擬；以及分析與該多個(gè)候選肽中的一個(gè)或多個(gè)候選肽結(jié)合的該碳酸酐酶iv的結(jié)構(gòu)，以鑒定一個(gè)或多個(gè)靶向肽，該一個(gè)或多個(gè)靶向肽能夠與以下相互作用：(1)一個(gè)或多個(gè)功能上等效于該碳酸酐酶iv中的具有seq?id?no:179的氨基酸序列的s20、g21、w22、l36、w41、p42、e90、v111、q112、h114、h139、v141、k143、f156、l217、t218、t219、p220、n221、d223或w228的位置；或(2)一個(gè)或多個(gè)功能上等效于該碳酸酐酶iv中的具有seq?id?no:180的氨基酸序列的s21、h22、w23、l37、w42、g43、m92、k113、q114、h116、h141、v143、e145、q158、l224、t225、t226、p227、t228、d231或w236的位置。在一些實(shí)施例中，該方法包括：獲得與該碳酸酐酶iv結(jié)合的該多個(gè)候選肽中的每個(gè)候選肽的結(jié)合評(píng)分；以及選擇該多個(gè)候選肽中的結(jié)合評(píng)分高于閾值的一個(gè)或多個(gè)候選肽作為對(duì)該碳酸酐酶iv具有特異性的靶向肽。在一些實(shí)施例中，該方法包括：比較該多個(gè)候選肽中的兩個(gè)或更多個(gè)候選肽的該結(jié)合評(píng)分，以對(duì)該候選肽序列進(jìn)行排序。在一些實(shí)施例中，獲得多個(gè)候選肽序列中的每個(gè)候選肽序列的該結(jié)合評(píng)分包括(1)對(duì)候選肽與該碳酸酐酶iv的界面中的原子總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)；(2)對(duì)該候選肽中的原子總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，其中這些原子與該碳酸酐酶iv沖突；(3)獲得該候選肽的結(jié)合角；以及(4)獲得該候選肽的結(jié)合深度。

13、本文所公開的包含一種增加鼠類物種的血腦屏障的滲透性的方法。在一些實(shí)施例中，該方法包括：提供能夠與ly6c1結(jié)合的靶向肽，由此增加這些鼠類物種的血腦屏障的滲透性。在一些實(shí)施例中，該靶向肽具有1)選自由以下組成的組的氨基酸序列：aqryqgdsvaq(seq?id?no:7)、aqwstnagyaq(seq?id?no:8)、aqervgfaqaq(seq?id?no:9)、aqwmthgsaaq(seq?id?no:10)和sprykgdsvaq(seq?id?no:57)；或(2)與選自由以下組成的組的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列：aqryqgdsvaq(seq?id?no:7)、aqwstnagyaq(seqid?no:8)、aqervgfaqaq(seq?id?no:9)、aqwmthgsaaq(seq?id?no:10)和sprykgdsvaq(seqid?no:57)。在一些實(shí)施例中，該靶向肽具有sprykgdsvaq的氨基酸序列(seq?id?no:57)或與seq?id?no:57具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，該靶向肽插入在seqid?no:178的aa587-590中的兩個(gè)相鄰氨基酸之間，或者插入在與seq?id?no:178至少80％相同的氨基酸序列中的aa587-590的功能等效物之間。