本文提供了全人源單克隆抗體(mab)。更具體地，本文描述了特異性結(jié)合人顆粒蛋白前體(也稱為gp88)的mab。顆粒蛋白前體的其他名稱包括顆粒蛋白/上皮蛋白前體、gep和顆粒體蛋白(acrogranin)。

背景技術(shù)：

1、已鑒定出一種有前途的癌癥治療和診斷的新靶點(diǎn)，并且稱為pc-細(xì)胞衍生的生長因子(pcdgf)(也稱為顆粒蛋白-上皮蛋白前體[gep或gp88]或顆粒蛋白前體)。pcdgf(本文稱為顆粒蛋白前體)是一種88kda的糖蛋白，其含有20kda的糖部分和68kda的核心蛋白，與上皮蛋白/顆粒蛋白的前體相同，所述上皮蛋白/顆粒蛋白是六個(gè)富含雙半胱氨酸的多肽的家族，其衍生于顆粒蛋白前體的蛋白酶解加工(bhandari，v.等，proc?natl?acad?sci?usa89(5)：1715-1719，1992)。該家族中首次被鑒定的成員是6kda的多肽生長調(diào)節(jié)因子，從大鼠腎臟中分離的上皮蛋白1和2(shoyab，m.等，proc?natl?acad?of?sci?87(20)：7912，1990)或來自人粒細(xì)胞提取物中的顆粒蛋白(bateman等，biochem?biophys?res?commun?173(3)：1161-1168，1990)。

2、上皮蛋白和顆粒蛋白的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cdna)的克隆表明，其編碼一種63kda的蛋白質(zhì)，其含有7.5kda富含半胱氨酸的上皮蛋白/顆粒蛋白重復(fù)序列、信號(hào)肽以及幾個(gè)推定的糖基化位點(diǎn)(bhandari，v.等，proc?natl?acad?sci?u?s?a?89(5)：1715-1719，1992)。對克隆和表達(dá)的前體的生物學(xué)功能的研究表明，其不具有生物活性(bhandari，v.等，1992和plowman，g.等，j?biol?chem?267(18)：13073-13078，1992)。這導(dǎo)致一種假設(shè)，即前體需要被加工成6kda的分子形式以獲得生物活性。基于這一假設(shè)，大分子量形式被定義為顆粒蛋白/上皮蛋白前體或pgrn，現(xiàn)在稱為顆粒蛋白前體。在正常生理?xiàng)l件下，顆粒蛋白前體不被分泌，而是作為成熟顆粒蛋白/上皮蛋白的前體。serrero實(shí)驗(yàn)室的工作報(bào)告了從高致瘤性畸胎瘤pc細(xì)胞系的培養(yǎng)基中純化自分泌生長因子，首次提供了所述前體作為具有生物活性的生長因子的生理存在的證明，該前體作為88kda的糖蛋白，具有17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和20kda的糖部分(zhou，g.等，j?biol?chem?268(15)：10863-10869,1993)。在對上皮或間質(zhì)來源的幾種細(xì)胞系的其他研究中(zanocco-marani，t.等，cancer?res59(20)：5331-5340，1999；he，z.等，cancer?research?62(19)：5590，2002；he，z.等，j?mol?med?81(10)：600-612，2003；serrero，g，biochem?biophys?res?commun?308(3)：409-413，2003)，得知顆粒蛋白前體的自分泌產(chǎn)生和分泌導(dǎo)致生長失調(diào)，導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤形成，表明顆粒蛋白前體充當(dāng)致瘤生長因子。

3、自分泌顆粒蛋白前體的高表達(dá)水平與惡性程度最高的乳腺癌細(xì)胞相關(guān)。例如，顆粒蛋白前體信使核糖核酸(mrna)和蛋白質(zhì)表達(dá)在永生化、非致瘤性乳腺上皮mcf-10a細(xì)胞和雌激素受體陽性(er+)mcf-7細(xì)胞中非常低。相反，在更具侵襲性的雌激素受體陰性(er-)細(xì)胞系(例如mda-mb-468、453和231)中觀察到顆粒蛋白前體水平顯著增加(lu，r.等，procnatl?acad?sci?usa?97(8)：3993-3998，2000)。進(jìn)一步研究已證實(shí)，顆粒蛋白前體介導(dǎo)17-β雌二醇(e2)在人類乳腺癌細(xì)胞中的生長促進(jìn)作用；其中，在e2依賴性的mcf-7細(xì)胞中，顆粒蛋白前體的過表達(dá)使得細(xì)胞不依賴e2，而e2受體狀態(tài)和e2反應(yīng)性沒有改變，導(dǎo)致細(xì)胞變?yōu)樗舴铱剐缘?lu，r.等，proc?natl?acad?sci?usa?98(1)：142-147，2001)。此外，已發(fā)現(xiàn)接受他莫昔芬治療的攜帶顆粒蛋白前體過表達(dá)腫瘤的小鼠比未接受他莫昔芬治療的小鼠形成更大的腫瘤，表明過表達(dá)顆粒蛋白前體的er+乳腺癌細(xì)胞不僅對他莫昔芬的生長抑制作用產(chǎn)生抗性，而且其對他莫昔芬產(chǎn)生不利反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤生長受到刺激。除了賦予他莫昔芬抗性之外，數(shù)據(jù)還表明er+乳腺癌細(xì)胞中顆粒蛋白前體的過表達(dá)導(dǎo)致對氟維司群(faslodex)、芳香化酶抑制劑來曲唑和化療藥劑阿霉素的抗性(tangkeangsirisin，w.等，carcinogenesis?25(9)：1587-1592，2004；abrhale；t.等，bmc?cancer?11：231，2011；tangkeangsirisin，w.等，advances?in?breast?cancer?research?vol.3no.3∶11，2014)。后一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)得到了kudoh等人研究(kudoh，r.等，cancer?research?60(15)：4161，2000)的支持，其中微陣列分析確認(rèn)顆粒蛋白前體是阿霉素抗性乳腺癌細(xì)胞mcf-7/d40中顯著(>12倍)上調(diào)的基因。此外，在用阿霉素處理1?5小時(shí)的mcf-7細(xì)胞中，顆粒蛋白前體上調(diào)了17倍。這些結(jié)果表明乳腺腫瘤中顆粒蛋白前體表達(dá)的增加與化學(xué)-抗性相關(guān)。

4、盡管對顆粒蛋白前體受體由于其尚未完全克隆而知之甚少，但一些實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)研究了介導(dǎo)增殖和生存的顆粒蛋白前體依賴性信號(hào)通路(arechavaleta-velasco，f.等，medoncol?34(12)：194，2017)。關(guān)于受體，已經(jīng)證明了特異性的、時(shí)間和溫度依賴性的顆粒蛋白前體與細(xì)胞的結(jié)合是可飽和的。使用交聯(lián)劑dss將生物素化的顆粒蛋白前體與人乳腺癌細(xì)胞交聯(lián)，顯示存在交聯(lián)帶，其表觀分子量約為190-200kda，表明推定的受體的表觀分子量為100-110kda(xia等，biochem?biophys?res?commun?245(2)：539-543，1998)。不結(jié)合或不響應(yīng)顆粒蛋白前體的細(xì)胞并未呈現(xiàn)這種交聯(lián)蛋白復(fù)合物。顆粒蛋白前體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑包括mapk?erk?1/2、pi-3激酶和fak，其導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin?d1和cyclinb的激活(zanocco-marani，t.等，cancer?res?59(20)：5331-5340，1999；lu，r.等，procnatl?acad?sci?usa?98(1)∶142-147，2001；he，z.等，j?mol?med?81(10)：600-612，2003；jones，m.b.等，clin?cancer?res?9(1)：44-51，2003)。已表明，在her-2過表達(dá)的乳腺癌中，顆粒蛋白前體及其受體可以與her-2受體而非egf受體發(fā)生相互作用，導(dǎo)致her-2磷酸化，并且隨后導(dǎo)致赫賽汀抗性(kim，w.e.等，clin?cancer?res12(14pt1)：4192-4199，2006)。

5、關(guān)于顆粒蛋白前體的生存功能，作用機(jī)制調(diào)查表明，顆粒蛋白前體通過上調(diào)bcl-2表達(dá)來阻斷他莫昔芬的凋亡作用，并且還強(qiáng)烈刺激血管生成因子血管內(nèi)皮生長因子(vegf)和血管生成素-2的表達(dá)(tangkeangsirisin，w.等，carcinogenesis?25(9)：1587-1592,2004)。由于顆粒蛋白前體刺激vegf，進(jìn)行了調(diào)查以確定顆粒蛋白前體是否還刺激參與轉(zhuǎn)移的其他過程。無論是在mcf-7細(xì)胞中過表達(dá)還是外源添加，顆粒蛋白前體都刺激遷移、基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)以及侵襲(tangkeangsirisin，w.等，tangkeangsirisin，w.等，cancerres?64(5)：1737-1743，2004；tangkeangsirisin，w.等，carcinogenesis?25(9)：1587-1592，2004)。除mmp-9外，還報(bào)道了mmp-2的激活(he，z.等，j?mol?med81(10)：600-612,2003)。因此，顆粒蛋白前體刺激了至少部分地通過分別刺激vegf和基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)而介導(dǎo)的血管生成和腫瘤細(xì)胞侵襲性(he，z.等，cancer?research62(19)：5590，2002；he等，2003；tangkeangsirisin，w.等，cancer?res64(5)：1737-1743，2004；tangkeangsirisin，w.等，carcinogenesis25(9)：1587-1592，2004)。這些數(shù)據(jù)表明顆粒蛋白前體水平升高與轉(zhuǎn)移增加相關(guān)。

6、最近，一種命名為ag01的特異性結(jié)合人顆粒蛋白前體的人/鼠嵌合單克隆抗體被證明具有體內(nèi)功效。ag01治療的攜帶mda-mb-231皮下腫瘤的小鼠顯示腫瘤生長速度和腫瘤重量顯著降低，而體重和器官重量不受影響(guha，r.等，breast?cancer?res?treat186(3)：637-653，2021)。

7、因此，存在對于抗人顆粒蛋白前體的mab的需求，特別是特異性結(jié)合人顆粒蛋白前體并且可用于在患者中治療人類癌癥的全人源mab。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本文提供了與顆粒蛋白前體(pgrn或gp88)結(jié)合的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段。本文所描述的分離的抗體或抗原結(jié)合片段以小于或等于100pm的kd與人顆粒蛋白前體(gp88)結(jié)合。例如，本文所描述的分離的抗體或抗原結(jié)合片段可以與人顆粒蛋白前體以小于或等于10pm、小于或等于1pm、小于或等于0.1pm或小于或等于0.01pm的kd結(jié)合。更具體地，本文所描述的分離的抗體或抗原結(jié)合片段還可以與人顆粒蛋白前體以小于或等于0.05pm或小于或等于0.4pm的kd結(jié)合，如通過下文所描述的octet測定來測量或如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何測定來測量。本文中的某些mab不與mab?ag0?1競爭，mab?ag0?1是一種嵌合單克隆抗體，其含有(a)特異性結(jié)合人顆粒蛋白前體的小鼠可變區(qū)和(b)人恒定區(qū)(guha，r.等，2021)。本文描述了一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合人顆粒蛋白前體并且進(jìn)一步與本文所描述的mab?16c11、10b3、10c8或14a6競爭結(jié)合。本文描述了一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合與mab?16c?11、10b3、10c8或14a6相同的表位。具體地，本文中的mab包括具有表1中所述的氨基酸序列(使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫展示)的抗人顆粒蛋白前體抗體。這些可變區(qū)可以連接到igg1/κ同種型恒定區(qū)。chothia和kabat的cdr殘基編號(hào)系統(tǒng)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在dondelinger，m.等，front?immunol?9：2278，2018中有進(jìn)一步描述，并且用于確定下表1中展示的氨基酸序列。編碼可變區(qū)(vh和vl)的示例性cdna序列也如下所展示。所述單克隆抗體可以進(jìn)一步包含表1中所描述的抗體的完整重鏈和/或輕鏈。在一些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體可包含此類重鏈和/或輕鏈的抗原結(jié)合域，例如表1中所示的cdr。在一些實(shí)施方案中，本公開提供了編碼10c8、16c?11、14a6或10b3抗體(或其功能片段，例如其cdr和/或可變區(qū))的核苷酸序列，和/或與下述等效的特定氨基酸序列，其中等同物可以容易地從seq?id?no：1-56中任一個(gè)的氨基酸序列和表4中展示的信息以及使用本文中公開的功能測定和其他測定而得到，和/或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員以其他方式可獲得的。在一些實(shí)施方案中，本公開還提供了表達(dá)載體，其包括包含此類核苷酸序列和/或由此類核苷酸序列組成的分離的核酸(在優(yōu)選實(shí)施方案中為seq?id?no：57-64中的任一個(gè)或其衍生物)以及含有此類表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(例如細(xì)胞系)。本文描述的內(nèi)容涉及編碼本文單克隆抗體的重鏈或輕鏈的分離的核酸、包括所述分離的核酸的表達(dá)載體和含有表達(dá)載體的細(xì)胞系。本文還描述了通過識(shí)別具有表達(dá)顆粒蛋白前體的癌細(xì)胞的患者并且向所述患者施用如本文所描述的抗體或抗原結(jié)合片段來治療患者癌癥的方法。已知多種人類癌癥表達(dá)顆粒蛋白前體，包括卵巢癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、肺癌、腎癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、子宮癌、膀胱癌、膽管癌、食管癌、胃癌、喉癌、腦癌、白血病和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。應(yīng)理解，前述一般描述和以下詳細(xì)描述二者都僅是示例性和解釋性的，并且不是限制性的。附加特征將在以下的說明書部分中闡述，或者可以通過本文描述的實(shí)踐而習(xí)得。在考慮以下示例性實(shí)施方案的描述后，前述特征和其他特征對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見。