本技術(shù)涉及用于測(cè)定核酸是否甲基化的組合物和用于測(cè)定核酸是否甲基化的方法。

背景技術(shù)：

1、作為測(cè)量dna樣品甲基化水平的方法，有qmsp、methylight和ms-hrm等，并且所有的方法都被構(gòu)建用于相對(duì)確定每個(gè)樣品的甲基化水平。例如，qmsp法通過(guò)對(duì)相同量的dna樣品使用僅與甲基化(或非甲基化)模板結(jié)合的引物，并測(cè)量在樣品中相應(yīng)條件下擴(kuò)增dna產(chǎn)生的dna量的pcr?cq值來(lái)測(cè)定甲基化水平。methylight法通過(guò)向qmsp中加入探針，在擴(kuò)增的dna中使擴(kuò)增的dna中與待測(cè)標(biāo)志物特異性結(jié)合的dna與所述探針結(jié)合，從而提高了測(cè)量的特異性。此外，ms-hrm法使用不論dna樣品的甲基化狀態(tài)如何都能與模板株結(jié)合的引物，并且根據(jù)通過(guò)在除了擴(kuò)增產(chǎn)物的引物結(jié)合區(qū)域之外的區(qū)域中包含一定數(shù)量的cpg造成的溫度升高來(lái)確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔點(diǎn)差異的信號(hào)。

2、qmsp和methylight分析在引物設(shè)計(jì)上幾乎沒(méi)有限制，并且具有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，并且可以實(shí)現(xiàn)相對(duì)高的靈敏度。然而，需要額外的對(duì)照標(biāo)志物分析來(lái)校正用于分析的樣品量，并且使用結(jié)果來(lái)校正測(cè)量值，定量分析是間接的和限制性的，并且類(lèi)型ⅱ錯(cuò)誤的頻率高。此外，特定模板的偏向性擴(kuò)增具有降低特異性的缺點(diǎn)，因?yàn)樗赡茉黾用總€(gè)dna樣品的非特異性擴(kuò)增的頻率。在開(kāi)發(fā)methylight作為彌補(bǔ)特異性的方法的情況下，還需要能夠特異性結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針，這造成增加成本和增加分析測(cè)試設(shè)計(jì)難度的缺點(diǎn)。此外，在許多情況下，探針的特異性結(jié)合具有局限性，即很難分析非常少量的樣品，因?yàn)檫@降低了pcr的擴(kuò)增效率。

3、在ms-hrm分析的情況下，由于甲基化和非甲基化核酸在同一試管中同時(shí)擴(kuò)增，dna樣品的甲基化水平可以比msp更直觀(guān)地定量測(cè)量，而無(wú)需額外的對(duì)照標(biāo)志物分析。然而，由于引物中不應(yīng)包含cpg或引物設(shè)計(jì)中應(yīng)包含非特異性堿基的設(shè)計(jì)限制，開(kāi)發(fā)特異性分析方法并不容易。此外，在引物中不包含cpg的情況下，存在與甲基化鏈相比偏向結(jié)合非甲基化鏈的問(wèn)題，并且由于樣品驗(yàn)證結(jié)果的非甲基化偏向，可能發(fā)生類(lèi)型ⅰ錯(cuò)誤，并且在需要靈敏的甲基化異常測(cè)量的實(shí)驗(yàn)(如癌癥診斷)中，存在實(shí)際樣品中的甲基化比率測(cè)量值低或得到不準(zhǔn)確結(jié)果的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、【技術(shù)問(wèn)題】

2、本技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案是建立一種確定甲基化狀態(tài)的方法，該方法彌補(bǔ)了常規(guī)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法的不足。根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方案的用于測(cè)定甲基化狀態(tài)的方法可以測(cè)量相對(duì)甲基化比率，而無(wú)需在同一試管中分析對(duì)照標(biāo)志物，無(wú)需使用干擾擴(kuò)增效率的探針，并且具有高檢測(cè)靈敏度。此外，為了測(cè)量生物樣品如血液等中非常低比率的甲基化水平，可以調(diào)節(jié)甲基化和非甲基化dna的擴(kuò)增效率。

3、根據(jù)本技術(shù)一個(gè)實(shí)施方案的組合物和方法一起使用甲基化引物和非甲基化引物，因此這樣不會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，并且即使在所需目標(biāo)核酸以痕量存在的條件下也可以比常規(guī)的基于pcr的分析方法更靈敏地測(cè)量樣品的甲基化水平。

4、本技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案是提供用于測(cè)定待測(cè)核酸是否甲基化的組合物，和通過(guò)彌補(bǔ)常規(guī)dna樣品甲基化水平測(cè)量方法的不足，提供高靈敏度的測(cè)定待測(cè)核酸是否甲基化的方法。

5、本技術(shù)的另一個(gè)實(shí)施方案是提供一種引物的設(shè)計(jì)策略和優(yōu)化方法，其可以通用于各種dna甲基化標(biāo)志物。

6、本技術(shù)的其他實(shí)施方案是提供一種用于診斷癌癥的方法、一種用于提供用于診斷癌癥的信息的方法、一種用于診斷癌癥的組合物或一種用于診斷癌癥的試劑盒，其測(cè)定生物樣品(如血液)中存在的cfdna(無(wú)細(xì)胞dna)中的癌癥患者中少量存在的ctdna(循環(huán)腫瘤dna)的dna甲基化水平，所述測(cè)定在所述樣品中通過(guò)半定量方法來(lái)進(jìn)行，并基于此實(shí)現(xiàn)高靈敏度和特異性。

7、【技術(shù)方案】

8、本技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案涉及用于測(cè)定待測(cè)核酸是否甲基化的組合物，其包含用于擴(kuò)增待測(cè)核酸的靶位點(diǎn)的引物組。

9、本技術(shù)的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種用于測(cè)定待測(cè)核酸是否甲基化的方法，該方法包括：在包含待測(cè)核酸的生物樣品中，將甲基化的待測(cè)核酸和非甲基化的待測(cè)核酸修飾成彼此不同的步驟；和通過(guò)用所述組合物處理生物樣品來(lái)擴(kuò)增靶位點(diǎn)的步驟。

10、在下文中，將更詳細(xì)地描述本技術(shù)。

11、本技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案涉及用于測(cè)量待測(cè)核酸的甲基化水平的新方法，所述方法彌補(bǔ)了用于測(cè)量待測(cè)核酸的甲基化水平的常規(guī)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法的不足。具體地，當(dāng)設(shè)計(jì)ms-hrm引物時(shí)，使用包含cpg識(shí)別位點(diǎn)的甲基化引物，所述cpg識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別引物中的cpg序列，并且為了防止僅擴(kuò)增甲基化模板，同時(shí)使用用于擴(kuò)增非甲基化模板的包含tpg識(shí)別位點(diǎn)的非甲基化引物，所述tpg識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別tpg序列。然后，為了防止ms-hrm的相對(duì)低的靈敏度和包含tpg的引物的偏向性擴(kuò)增，構(gòu)建了通過(guò)調(diào)節(jié)pcr的引物退火步驟的溫度來(lái)增加包含cpg的引物的結(jié)合機(jī)會(huì)和減少包含tpg的引物的結(jié)合機(jī)會(huì)的方法。

12、在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“甲基化”是指甲基連接到組成dna的堿基上。例如，甲基化可能發(fā)生在特定基因或核酸的特定cpg位點(diǎn)的胞嘧啶中。

13、在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“是否甲基化”或“甲基化狀態(tài)”是指在特定基因或核酸的特定cpg位點(diǎn)的胞嘧啶中是否甲基化。具體地說(shuō)，它是指堿基序列中至少一個(gè)cpg二核苷酸的5-甲基胞嘧啶的存在或不存在。

14、在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“甲基化水平”或“甲基化程度”是指待測(cè)核酸的堿基序列中存在的甲基化的量。

15、在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“cpg位點(diǎn)”或“cpg序列”是指存在于特定基因或核酸的堿基序列中的cpg位點(diǎn)。基因是全部一系列組成單元的概念，所述組成單元是表達(dá)所必需的，并且彼此可操作地相互連接，并且可以包括啟動(dòng)子區(qū)、蛋白質(zhì)編碼區(qū)(開(kāi)放閱讀框，orf)和終止子區(qū)。因此，cpg位點(diǎn)可以存在于相應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)、蛋白質(zhì)編碼區(qū)(開(kāi)放閱讀框，orf)或終止子區(qū)等。例如，它可以是存在于基因啟動(dòng)子區(qū)的cpg位點(diǎn)。

16、在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“核酸”是聚合物形式的核苷酸，代表核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸，并且包括多核苷酸、寡核苷酸、寡聚物、寡聚體(oligos)、編碼序列等含義。核酸的含義可以包括單鏈、雙鏈或多鏈dna或rna、基因組dna、cdna、dna-rna雜合體，或嘌呤和嘧啶堿基，或具有其他天然、化學(xué)或生物化學(xué)修飾的、非天然或衍生的核苷酸堿基的聚合物。

17、在本說(shuō)明書(shū)中，當(dāng)描述“包括”一種成分時(shí)，并不意味著排除其他成分，而是可以進(jìn)一步包括其他成分，除非另外特別提到。

18、在本說(shuō)明書(shū)中，除非另有說(shuō)明，核酸分別以5’至3’的方向從左至右書(shū)寫(xiě)。

19、在本說(shuō)明書(shū)中，單數(shù)包括復(fù)數(shù)對(duì)象，除非上下文另有明確說(shuō)明。

20、本技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案涉及用于測(cè)定待測(cè)核酸是否甲基化的組合物，其包含用于擴(kuò)增待測(cè)核酸的靶位點(diǎn)的引物組，或包含該組合物的用于確定待測(cè)核酸是否甲基化的試劑盒。引物組可以包括正向引物和反向引物，并且正向引物和反向引物中的一個(gè)可以包括甲基化引物和非甲基化引物，并且另一個(gè)可以是通用引物。甲基化引物可以包含識(shí)別待測(cè)核酸的cpg序列的cpg識(shí)別位點(diǎn)，非甲基化引物可以包含識(shí)別待測(cè)核酸的tpg序列的tpg識(shí)別位點(diǎn)，并且tpg序列可以由待測(cè)核酸的cpg序列轉(zhuǎn)換而來(lái)。通用引物是指無(wú)論待測(cè)核酸是否甲基化，都能特異性識(shí)別并結(jié)合待測(cè)核酸的引物。

21、本技術(shù)的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種用于測(cè)定待測(cè)核酸是否甲基化的方法，該方法包括：將甲基化的待測(cè)核酸和非甲基化的待測(cè)核酸修飾成彼此不同的步驟，其中所述待測(cè)核酸包含于生物樣品中；和通過(guò)用所述組合物處理生物樣品來(lái)擴(kuò)增靶位點(diǎn)的步驟。修飾步驟可以通過(guò)用試劑處理生物樣品來(lái)進(jìn)行，所述試劑將待測(cè)甲基化核酸和待測(cè)非甲基化核酸修飾成彼此不同。

22、靶位點(diǎn)是測(cè)定待測(cè)核酸是否甲基化的感興趣的位點(diǎn)，并且可以包含至少一個(gè)cpg序列。所述靶位點(diǎn)的大小可以是50至150bp、50至140bp、50至130bp、50至120bp、50至110bp、50至100bp、60至150bp、60至140bp、60至130bp、60至120bp、60至110bp或60至100bp。

23、例如，所述靶位點(diǎn)可以包括生物標(biāo)志物。具體地，所述生物標(biāo)志物可以是甲基化生物標(biāo)志物。所述甲基化生物標(biāo)志物是指根據(jù)生物標(biāo)志物是否被甲基化而顯示出與特定疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物。更具體地，所述甲基化生物標(biāo)志物是指依據(jù)在生物標(biāo)志物的堿基序列中cg的c(胞嘧啶)上添加甲基(ch3)時(shí)發(fā)生的表觀(guān)遺傳變化從而顯示與特定疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物。

24、在本技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶位點(diǎn)可以包括存在于cpg島中的生物標(biāo)志物。根據(jù)本技術(shù)實(shí)施方案的引物組包括(1)甲基化正向引物、非甲基化正向引物和通用反向引物；或者(2)通用正向引物、甲基化反向引物和非甲基化反向引物，并且即使當(dāng)難以制備通用引物時(shí)，例如當(dāng)序列復(fù)雜性通過(guò)亞硫酸處理而降低時(shí)，或者當(dāng)生物標(biāo)志物存在于其中相鄰位點(diǎn)一起發(fā)生變化的cpg島中時(shí)，也可以準(zhǔn)確地測(cè)定靶位點(diǎn)是否甲基化。具體地，在常規(guī)hrm分析方法中，當(dāng)通過(guò)亞硫酸處理降低gdna的序列復(fù)雜性并且非特異性反應(yīng)頻繁發(fā)生時(shí)，或者特別地，在cpg島的情況下，當(dāng)難以制備不含cpg的mip(甲基化非依賴(lài)性引物；通用引物)時(shí)，分析會(huì)變得困難，但是本技術(shù)能夠通過(guò)在一個(gè)方向的引物中同時(shí)使用甲基化引物和非甲基化引物來(lái)確保引物設(shè)計(jì)的自由度，并能夠在誘導(dǎo)靶標(biāo)的特異性結(jié)合的同時(shí)準(zhǔn)確地測(cè)定靶位點(diǎn)是否被甲基化。

25、所述甲基化引物，具體地，所述甲基化正向引物或甲基化反向引物，包含識(shí)別待測(cè)核酸的cpg序列的cpg識(shí)別位點(diǎn)，而所述非甲基化引物，具體地，所述非甲基化正向引物或非甲基化反向引物，包含識(shí)別待測(cè)核酸的tpg序列的tpg識(shí)別位點(diǎn)，在所述tpg序列中cpg序列被轉(zhuǎn)換。所述tpg序列是用將待測(cè)甲基化核酸和待測(cè)非甲基化核酸修飾成彼此不同的試劑轉(zhuǎn)化的cpg序列。例如，所述修飾劑可以將非甲基化的胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。作為一個(gè)實(shí)例，所述修飾劑可以是選自由亞硫酸、亞硫酸氫鹽(bisulfite)、氫亞硫酸鹽(hydrogensulfite)和焦亞硫酸鹽組成的組中的至少一種。

26、當(dāng)用將待測(cè)甲基化核酸和待測(cè)非甲基化核酸修飾成彼此不同的試劑處理模板時(shí)，如果模板的cpg胞嘧啶被甲基化，則cpg胞嘧啶不會(huì)轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，如果cpg胞嘧啶未被甲基化，則cpg胞嘧啶會(huì)轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。

27、所述甲基化引物的cpg識(shí)別位點(diǎn)可以識(shí)別待測(cè)甲基化核酸的cpg序列。例如，所述cpg識(shí)別位點(diǎn)可以包括cg序列。

28、所述非甲基化引物的tpg識(shí)別位點(diǎn)可以識(shí)別tpg序列，所述tpg序列是由將待測(cè)甲基化核酸和待測(cè)非甲基化核酸修飾成彼此不同的試劑轉(zhuǎn)化的待測(cè)非甲基化核酸的cpg序列。例如，所述tpg識(shí)別位點(diǎn)可以包含tg序列。

29、所述cpg識(shí)別位點(diǎn)和tpg識(shí)別位點(diǎn)分別位于甲基化引物和非甲基化引物的3’末端附近，并且可以分別特異性地識(shí)別由將待測(cè)甲基化核酸和待測(cè)非甲基化核酸修飾成彼此不同的試劑轉(zhuǎn)化的待測(cè)甲基化核酸和待測(cè)非甲基化核酸。例如，所述cpg識(shí)別位點(diǎn)和tpg識(shí)別位點(diǎn)可以位于甲基化引物和非甲基化引物的3’端的40、35、30、25、20、10、9、8、7、6、5、4、3或2個(gè)堿基內(nèi)，或者位于其3’端。

30、與甲基化引物相比，非甲基化引物具有較低的tm值，因此為了彌補(bǔ)這一點(diǎn)，通過(guò)在非甲基化引物的5’末端添加核苷酸，可以類(lèi)似地設(shè)計(jì)甲基化引物和非甲基化引物的tm。例如，通過(guò)在5’末端進(jìn)一步包含核苷酸，所述非甲基化引物可以比甲基化引物具有更多的核苷酸。例如，與甲基化引物相比，所述非甲基化引物可以在5’末端進(jìn)一步包含1至5、1至4、1至3、1至2或1個(gè)核苷酸。例如，甲基化引物和非甲基化引物之間的tm差異可以是15℃或更低、14℃或更低、13℃或更低、12℃或更低、11℃或更低、10℃或更低、9℃或更低、8℃或更低、7℃或更低、6℃或更低、5℃或更低、4℃或更低、3℃或更低、2℃或更低或1.5℃或更低。

31、引物組包括正向引物和反向引物，當(dāng)甲基化引物和非甲基化引物是正向引物時(shí)，反方向的引物是反向引物，當(dāng)甲基化引物和非甲基化引物是反向引物時(shí)，反方向的引物是正向引物。所述反方向的引物是能夠結(jié)合待測(cè)甲基化核酸和待測(cè)非甲基化核酸兩者的通用引物。因此，所述反方向的引物(通用引物)可以不包含cpg結(jié)合位點(diǎn)，但是當(dāng)由于待測(cè)核酸的結(jié)構(gòu)而不可避免地在反方向的引物中包含cpg結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，5’末端區(qū)域可以包含5個(gè)或更少、4個(gè)或更少、3個(gè)或更少、2個(gè)或更少、1至5個(gè)、1至4個(gè)、1至3個(gè)、1至2個(gè)，或者作為一個(gè)例子，1個(gè)cpg結(jié)合位點(diǎn)。然而，此時(shí)優(yōu)選將反方向的引物設(shè)計(jì)成具有與甲基化引物和非甲基化引物相似的tm。

32、所述甲基化引物、非甲基化引物和反方向的引物的大小可以包括15至40、15至35、15至30、15至25、18至40、18至35、18至30、18至25、20至40、20至35、20至30或20至25個(gè)堿基。

33、所述甲基化引物、非甲基化引物和反方向的引物可以與待測(cè)核酸結(jié)合，所述待測(cè)核酸被將待測(cè)甲基化核酸和待測(cè)非甲基化核酸修飾成彼此不同的試劑轉(zhuǎn)化，通過(guò)包含1個(gè)或多個(gè)、2個(gè)或多個(gè)、或3個(gè)或多個(gè)非cpg胞嘧啶。

34、所述甲基化引物、非甲基化引物和反方向的引物的tm可以是50至80℃、50至75℃、50至70℃、50至65℃、55至80℃、55至75℃、55至70℃、55至65℃、60至80℃、60至75℃、60至70℃或60至65℃。

35、根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方案所述的組合物可以包含濃度比為100：1至1：100、100：1至1：50、100：1至1：20、100：1至1：10、100：1至1：5、100：1至1：1、100：1至小于1：1、100：1至1.3：1、100：1至1.5：1、100：1至2：1、100：1至2.5：1、100：1至3：1、100：1至3.5：1、100：1至4：1、50：1至1：100、50：1至1：50、50：1至1：20、50：1至1：10、50：1至1：5、50：1至1：1、50：1至小于1：1、50：1至1.3：1、50：1至1.5：1、50：1至2：1、50：1至2.5：1、50：1至3：1、50：1至3.5：1、50：1至4：1、10：1至1：100、10：1至1：50、10：1至1：20、10：1至1：10、10：1至1：5、10：1至1：1、10：1至小于1：1、10：1至1.3：1、10：1至1.5：1、10：1至2：1、10：1至2.5：1、10：1至3：1、10：1至3.5：1、10：1至4：1、5：1至1：100、5：1至1：50、5：1至1：20、5：1至1：10、5：1至1：5、5：1至1：1、5：1至小于1：1、5：1至1.3：1、5：1至1.5：1、5：1至2：1、5：1至2.5：1、5：1至3：1、5：1至3.5：1、5：1至4：1、4.5：1至1：100、4.5：1至1：50、4.5：1至1：20、4.5：1至1：10、4.5：1至1：5、4.5：1至1：1、4.5：1至小于1：1、4.5：1至1.3：1、4.5：1至1.5：1、4.5：1至2：1、4.5：1至2.5：1、4.5：1至3：1、4.5：1至3.5：1、或4.5：1至4：1的所述甲基化引物和非甲基化引物。

36、例如，所述非甲基化引物的濃度可以是甲基化引物濃度的100％或更低，小于100％、99.99％或更低，99.95％或更低，99.9％或更低，99％或更低，98％或更低，97％或更低，96％或更低，95％或更低，90％或更低，85％或更低，80％或更低，75％或更低，70％或更低，65％或更低，60％或更低，55％或更低，50％或更低，40％或更低，30％或更低或者25％或更低。并且作為一個(gè)實(shí)例，它可以是50％或更低。

37、根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方案所述的組合物和方法可以準(zhǔn)確地測(cè)定待測(cè)核酸是否甲基化，而不使用檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光探針。因此，根據(jù)本技術(shù)實(shí)施方案所述的組合物可以不包含熒光探針。此外，根據(jù)本技術(shù)實(shí)施方案所述的方法可以不使用熒光探針。

38、通過(guò)根據(jù)本技術(shù)實(shí)施方案所述的組合物和方法測(cè)定甲基化的待測(cè)核酸可以包含在生物樣品中。所述生物樣品可以包含選自由血液、血清、組織、細(xì)胞、糞便和尿液組成的組中的至少一種。

39、根據(jù)本技術(shù)實(shí)施方案所述的組合物和方法可以高靈敏度地確定待測(cè)核酸是否被甲基化，即使當(dāng)生物樣品中待測(cè)甲基化核酸的濃度非常低時(shí)。

40、例如，所述生物樣品中待測(cè)定的甲基化核酸的濃度可以是100ng/μl或更少、90ng/μl或更少、80ng/μl或更少、70ng/μl或更少、60ng/μl或更少、50ng/μl或更少、40ng/μl或更少、30ng/μl或更少、20ng/μl或更少、15ng/μl或更少、10ng/μl或更少、9ng/μl或更少、8ng/μl或更少、7ng/μl或更少、6ng/μl或更少、5ng/μl或更少、4ng/μl或更少、3ng/μl或更少、2ng/μl或更少、1.5ng/μl或更少、1ng/μl或更少、0.5ng/μl或更少、0.4ng/μl或更少、0.3ng/μl或更少、0.2ng/μl或更少、0.1ng/μl或更少、0.05ng/μl或更少、0.04ng/μl或更少、0.03ng/μl或更少、0.02ng/μl或更少、0.01ng/μl或更少、0.009ng/μl或更少、0.008ng/μl或更少、0.007ng/μl或更少、0.006ng/μl或更少、或0.005ng/μl或更少。

41、例如，所述生物樣品包含待測(cè)甲基化核酸和待測(cè)非甲基化核酸，并且待測(cè)甲基化核酸的濃度可以是待測(cè)非甲基化核酸的濃度的75％或更少、70％或更少、60％或更少、50％或更少、40％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少、小于19％、18％或更少、15％或更少、10％或更少、5％或更少、4.5％或更少、4％或更少、3.5％或更低、3％或更少、2.5％或更少、2％或更少、1.5％或更少、1.4％或更少、1.3％或更少、1.2％或更少或者1.1％或更少。

42、例如，所述生物樣品包含待測(cè)甲基化核酸和待測(cè)非甲基化核酸，并且基于100％的待測(cè)甲基化核酸和待測(cè)非甲基化核酸的總鏈，其可以包含100％或更少、少于100％、99％或更少、95％或更少、90％或更少、85％或更少、80％或更少、75％或更少、70％或更少、65％或更少、60％或更少、55％或更少、50％或更少、45％或更少、40％或更少、35％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少、少于10％、5％或更少、少于5％、4.5％或更少、4％或更少、3.5％或更少、3％或更少、2.5％或更少、2％或更少、1.5％或更少、1.4％或更少、1.3％或更少、1.2％或更少、1.1％或更少、或1％或更少的待測(cè)甲基化核酸。

43、例如，生物樣品可以包含20000條或更少、15000條或更少、10000條或更少、5000條或更少、4000條或更少、3000條或更少、2000條或更少、1000條或更少、500條或更少、400條或更少、300條或更少、200條或更少、150條或更少、100條或更少、90條或更少、80條或更少、70條或更少、60條或更少、50條或更少、40條或更少、30條或更少、20條或更少、10條或更少、9條或更少、8條或更少、7條或更少、6條或更少、5條或更少、4條或更少或者3條或更少的待測(cè)甲基化核酸。

44、根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方案的用于確定待測(cè)核酸是否甲基化的方法可以進(jìn)一步包括待測(cè)核酸的甲基化水平的定量步驟。定量步驟可以是通過(guò)比較生物樣品、待測(cè)核酸100％甲基化的樣品和待測(cè)核酸100％非甲基化的樣品的熔解曲線(xiàn)的auc(曲線(xiàn)下面積)來(lái)對(duì)生物樣品的甲基化水平進(jìn)行定量。

45、具體地，所述定量步驟可以包括獲得生物樣品的熔解曲線(xiàn)的步驟；

46、獲得其中鑒定了待測(cè)核酸的甲基化比率的生物樣品的標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線(xiàn)的步驟；以及通過(guò)比較生物樣品的熔解曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線(xiàn)來(lái)定量生物樣品的甲基化水平的步驟。所述生物樣品的熔解曲線(xiàn)可以是標(biāo)準(zhǔn)化的熔解曲線(xiàn)。所述生物樣品的熔解曲線(xiàn)可以通過(guò)hrm分析獲得。待測(cè)核酸的甲基化比率可以在待測(cè)甲基化核酸和待測(cè)非甲基化核酸的含量比率獲得。

47、在本技術(shù)的其他實(shí)施方案中，所述待測(cè)核酸可以包括用于診斷癌癥的生物標(biāo)志物。具體地，所述待測(cè)核酸可以包括用于診斷癌癥的生物標(biāo)志物，例如，在癌癥患者中特異性甲基化或非甲基化的標(biāo)志物，并且待測(cè)核酸的靶位點(diǎn)可以是用于診斷癌癥的生物標(biāo)志物的位置。在這種情況下，其可用于診斷癌癥，通過(guò)用根據(jù)本技術(shù)實(shí)施方案的組合物或方法來(lái)測(cè)定待測(cè)核酸是否被甲基化。

48、因此，本技術(shù)的其他實(shí)施方案涉及用于診斷癌癥的組合物或用于診斷癌癥的試劑盒，其包含根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方案的用于測(cè)定待測(cè)核酸是否甲基化的組合物。

49、此外，本技術(shù)的其他實(shí)施方案涉及用于診斷癌癥的方法或用于提供用于診斷癌癥的信息的方法，包括通過(guò)根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方案的用于測(cè)定待測(cè)核酸是否甲基化的方法來(lái)測(cè)定待測(cè)核酸是否甲基化的步驟。用于診斷癌癥的方法或用于提供用于診斷癌癥的信息的方法可以進(jìn)一步包括將待測(cè)核酸的甲基化水平與對(duì)照組的甲基化水平進(jìn)行比較的步驟。

50、所述對(duì)照組是指從來(lái)源已知的生物樣品中分離的核酸，并且可以使用來(lái)自無(wú)肝癌受試者(正常對(duì)照組)或肝癌受試者的所有樣品。

51、例如，在將源自無(wú)肝癌對(duì)象(正常對(duì)照組)的樣品用作對(duì)照組的情況下，當(dāng)待測(cè)核酸的甲基化水平高于從對(duì)照組分離的核酸的甲基化水平時(shí)，或者當(dāng)生物樣品中包含甲基化水平高于對(duì)照組的待測(cè)核酸時(shí)，其可以測(cè)定、診斷或者提供用于診斷的信息：即待測(cè)定核酸或生物樣品所源自的生物體(例如，脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、山羊、鹿、豬、鳥(niǎo)、雞、火雞、牛、馬、羊、魚(yú)、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，作為一個(gè)例子，人類(lèi))患有癌癥。

52、例如，在將源自患有肝癌的受試者的樣品用作對(duì)照組的情況下，當(dāng)待測(cè)核酸的甲基化水平與從對(duì)照組分離的核酸的甲基化水平相似，或者當(dāng)生物樣品中包含具有與對(duì)照組相似的甲基化水平的待測(cè)核酸時(shí)，其可以測(cè)定、診斷或者提供用于診斷的信息：即待測(cè)定核酸或生物樣品所源自的生物體(例如，脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、山羊、鹿、豬、鳥(niǎo)、雞、火雞、牛、馬、羊、魚(yú)、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，作為一個(gè)例子，人類(lèi))患有癌癥。

53、所述癌癥可以包括選自由肝癌、大腸癌、食道癌、胃癌、直腸癌、結(jié)直腸癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、胰腺癌、膽道癌、骨癌、結(jié)締組織癌、皮膚癌、黑色素瘤、腦癌、頭頸癌、甲狀腺癌、白血病、霍奇金病(hodgkin?disease)、淋巴瘤、泌尿道癌和多發(fā)性骨髓瘤血癌組成的組中的至少一種。

54、所述肝癌可以是選自由肝細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、肝內(nèi)膽管癌、肝母細(xì)胞瘤、肝腫瘤、肝血管肉瘤或轉(zhuǎn)移性肝癌、模糊結(jié)節(jié)型hcc、乏血供型肝癌組成的組中的至少一種。

55、本技術(shù)的其他實(shí)施方案涉及用于治療癌癥的方法，其包括通過(guò)根據(jù)本技術(shù)的實(shí)施方案的用于診斷癌癥的組合物、用于診斷癌癥的試劑盒、用于診斷癌癥的方法或用于提供用于診斷癌癥的信息的方法來(lái)治療被確定患有癌癥的受試者的步驟。所述治療步驟可包括對(duì)受試者施用有效量的治療劑、化學(xué)療法、激素療法、放射療法、外科手術(shù)或其組合的步驟。

56、所述治療劑可以包括例如阿法替尼、ak105、安羅替尼、阿帕替尼、阿替利珠單抗、阿維魯單抗、阿昔替尼、貝伐珠單抗、博舒替尼、bsc、卡博替尼、蘋(píng)果酸卡博替尼(cabozantinib-s-malate)、卡瑞利珠單抗、卡奈替尼、卡鉑、卡培他濱、塞來(lái)昔布、cc-122、cf102、克唑替尼、達(dá)沙替尼、多西他賽、多納非尼、多韋替尼、多柔比星、度伐魯單抗(durvalumab)、ekb-569、恩曲替尼、表柔比星、厄洛替尼(erlotinib)、依托泊苷、依維莫司、fgf401、folfox?4、福坦替尼(fostamatinib)、galunisertib、吉非替尼、吉西他濱、ibi305、伊布替尼、伊馬替尼、inc280、英菲格拉替尼(infigratinib)、伊匹木單抗(ipilimumab)、伊立替康、拉帕替尼、來(lái)氟米特、侖伐替尼、ly2875358、甲磺酸鹽(mesylate)、絲裂霉素c、msc2156119j、來(lái)那替尼、尼洛替尼、尼達(dá)尼布(nintedanib)、納武利尤單抗(nivolumab)、奧沙利鉑、帕博西尼、帕比司他、帕唑帕尼、pdr001、帕博利珠單抗、佩米替尼、pexavec、磷酸鹽、雷莫蘆單抗、瑞戈非尼、蘆可替尼、司馬沙尼、司美替尼、sgo-110、shr-1210、信迪利單抗、索拉非尼、su6656、舒尼替尼(sunitinib)、信迪利單抗、斯巴達(dá)珠單抗(spartalizumab)、舒尼替尼(sutent)、tace、他喹莫德、替莫唑胺、替西羅莫司、替雷利珠單抗、tivantinib、對(duì)甲苯磺酸鹽(tosylate)、特瑞普利單抗、西木單抗、凡德他尼、瓦他拉尼、xl888、y90、其藥學(xué)上可接受的鹽或其組合。

57、【有利效果】

58、本技術(shù)的實(shí)施方案可以通過(guò)彌補(bǔ)常規(guī)qmsp、methylight和ms-hrm分析方法的不足來(lái)構(gòu)建新的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法的設(shè)計(jì)，并且可以通過(guò)液體活檢來(lái)檢測(cè)dna甲基化標(biāo)志物，并且具有比常規(guī)ms-hrm分析方法更高的靈敏度，并且可以定量甲基化水平。

59、本技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案可以對(duì)含量極少的靶標(biāo)(例如血液中存在的循環(huán)腫瘤dna)以更靈敏的水平進(jìn)行pcr，并且可以根據(jù)依賴(lài)于退火溫度和引物的濃度比的用途通過(guò)調(diào)節(jié)甲基化引物和非甲基化引物與模板的結(jié)合程度來(lái)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。