背景技術(shù)：

1、作為實(shí)時(shí)pcr的進(jìn)一步發(fā)展，精確而靈敏的核酸檢測(cè)方法，特別是數(shù)字pcr，近年來(lái)徹底改變了分子診斷，因?yàn)樗鼈冊(cè)跈z測(cè)稀有基因靶標(biāo)方面優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)pcr(garcia-murillas等，2015；milbury等，2014)。在數(shù)字pcr(dpcr)中，反應(yīng)混合物及其所含的核酸(例如ctdna或dna)被分成數(shù)千個(gè)反應(yīng)空間，從而將靶標(biāo)序列彼此分離，并促進(jìn)其擴(kuò)增和檢測(cè)，尤其是對(duì)于稀有靶標(biāo)序列。這里常用的方法是將反應(yīng)混合物與要檢測(cè)的核酸微流體滴入油中或分成固定的微腔，從而形成的每個(gè)單元形成封閉的反應(yīng)空間，用于擴(kuò)增和檢測(cè)，例如在pcr期間。如果液滴中存在核酸靶標(biāo)序列，則通過(guò)pcr(或其他擴(kuò)增方法)進(jìn)行擴(kuò)增。通常通過(guò)序列特異性熒光核酸探針檢測(cè)單個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，從而產(chǎn)生相應(yīng)的熒光信號(hào)。除了絕對(duì)定量外，dpcr還具有減少抑制劑影響的優(yōu)勢(shì)。由于數(shù)字pcr中的定量是作為終點(diǎn)分析進(jìn)行的，因此可以通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)度將數(shù)據(jù)空間中的“信號(hào)簇”(也稱為群體)分配給特定的dna或cdna靶序列，從而實(shí)現(xiàn)另一種類型的數(shù)據(jù)分類(quan等，2018；whale等，2016)。

2、dpcr的一個(gè)相關(guān)方面是多路復(fù)用，因?yàn)椴煌暮怂岚行蛄型ǔＲ苑浅５偷臐舛瘸霈F(xiàn)在樣品中，因此在樣品中檢測(cè)盡可能多的靶序列非常重要。dpcr中最常見(jiàn)的多路復(fù)用方法基于這樣一個(gè)事實(shí)：dna報(bào)告分子在與檢測(cè)通道的檢測(cè)范圍相對(duì)應(yīng)的光譜范圍內(nèi)為每個(gè)dna靶序列產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此，可以在設(shè)備端的每個(gè)檢測(cè)通道上檢測(cè)到dna靶序列。然而，設(shè)備的復(fù)用程度最初受限于可用的檢測(cè)通道數(shù)量。目前市場(chǎng)上可用的dpcr設(shè)備具有2-6個(gè)不同的熒光檢測(cè)通道，這意味著在設(shè)備端最多可以分析6個(gè)靶序列。這里的主要問(wèn)題是波長(zhǎng)可能與大量檢測(cè)通道重疊，從而導(dǎo)致由于產(chǎn)生的串?dāng)_而降低特異性和靈敏度。

3、一種增加多路復(fù)用程度的方法是使用組合方法，例如通過(guò)將taqman探針和dropoff探針組合為特定報(bào)告分子的靶序列。在這種情況下，這些探針產(chǎn)生的信號(hào)的組合也會(huì)導(dǎo)致更高的多路復(fù)用程度(madic等，2018；stilla?technologies；corné等，2021)。由于在某些情況下僅間接檢測(cè)到單個(gè)突變，因此這些方法的開發(fā)也非常復(fù)雜，評(píng)估要求非常高，并且認(rèn)證或轉(zhuǎn)移到新的目標(biāo)面板也相應(yīng)地很復(fù)雜。

4、此外，還有其他方法用于提高數(shù)字pcr的多路復(fù)用程度，其旨在在數(shù)據(jù)空間中生成額外的群體。bio-rad的一項(xiàng)美國(guó)專利(us9921154b2)描述了一種多路復(fù)用數(shù)字pcr分析，其靶序列多于可用的光學(xué)通道，同時(shí)考慮到其他樣品特異性方面。然而，該專利并未公開任何新的檢測(cè)特征或生成此類靶序列群體的方法。根據(jù)目前的知識(shí)水平，這些方法只能用于本質(zhì)上存在具有不同dna靶序列的液滴的明顯多重占用的情況，或者信號(hào)由靶序列特異性報(bào)告分子(例如taqman探針或非序列特異性插層染料)產(chǎn)生的情況，然而，這些方法本身并不代表對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的創(chuàng)新。其中描述了不同的靶序列特異性探針可以使用例如不同的熒光團(tuán)作為此目的的標(biāo)記，或者可以攜帶多種熒光團(tuán)標(biāo)記以在同一檢測(cè)通道中生成多個(gè)群體。由于本文所述探針的信號(hào)在基態(tài)下被低效率的fret淬滅抑制，初始信號(hào)抑制相對(duì)較低，這就是為什么只能在有限的范圍內(nèi)對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行有效建模，從而在數(shù)據(jù)空間中分離群體。由于這些標(biāo)記探針也是靶序列特異性的，因此對(duì)其熒光特性進(jìn)行大量?jī)?yōu)化的效率非常低，因?yàn)槊看味急仨毢铣尚碌臉?biāo)記探針，并且在轉(zhuǎn)移到其他序列時(shí)必須重新啟動(dòng)該過(guò)程。同樣，用熒光團(tuán)對(duì)這種靶序列特異性探針進(jìn)行多次修飾非常復(fù)雜，還需要用額外的淬滅劑進(jìn)行修飾以充分抑制基態(tài)信號(hào)，從而避免數(shù)據(jù)空間中出現(xiàn)非特異性信號(hào)群體。這種多次修飾的合成非常復(fù)雜，通常需要大量?jī)?yōu)化，這就是為什么它們很少用于靶序列特異性報(bào)告分子，因?yàn)檫@個(gè)過(guò)程非常低效。

5、因此，這種強(qiáng)度多路復(fù)用中最常見(jiàn)的變體是改變不同類型的靶序列特異性報(bào)告分子(例如taqman探針)的濃度，同時(shí)保持每個(gè)檢測(cè)通道的熒光標(biāo)記均勻且簡(jiǎn)單(圖1右)(pecoraro等，2016；whale等，2016)。這可以在圖形的數(shù)據(jù)空間中創(chuàng)建額外的群體。由于使用靶序列特異性熒光報(bào)告分子，信號(hào)生成直接取決于靶序列或pcr系統(tǒng)。因此，這種直接檢測(cè)帶來(lái)了高優(yōu)化工作量的問(wèn)題，因?yàn)閺?qiáng)方差(位于不同群體之間的數(shù)據(jù)點(diǎn))會(huì)導(dǎo)致信號(hào)群體模糊，從而降低精度(強(qiáng)度多路復(fù)用)。各個(gè)pcr組分，尤其是具有相同熒光標(biāo)記的熒光報(bào)告分子必須彼此很好地匹配，例如以正交濃度比，但這在實(shí)踐中并不總是可能的。該方法還可以通過(guò)與其他表現(xiàn)出額外熒光標(biāo)記的染料相結(jié)合來(lái)補(bǔ)充，這些染料在不同的熒光檢測(cè)通道之間具有最大發(fā)射率，因此可以在多個(gè)熒光通道中平等地檢測(cè)到。這會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)空間中其他簇之間的對(duì)應(yīng)群體，由于額外的檢測(cè)通道，隨著數(shù)據(jù)空間維度的增加，變得越來(lái)越抽象。這使得相應(yīng)的多重檢測(cè)的開發(fā)，尤其是它們的批準(zhǔn)變得非常復(fù)雜。強(qiáng)度多路復(fù)用的另一種變化使用更復(fù)雜的濃度變化來(lái)抵消數(shù)據(jù)空間中的群體，從而使它們不易受到方差的影響(hughesman等，2016)。

6、相反，一種不使用靶序列特異性報(bào)告分子的核酸檢測(cè)方法是媒介探針pcr，該方法基于靶序列特異性媒介探針的核酸檢測(cè)與靶序列非特異性通用報(bào)告分子的信號(hào)生成的分離，該方法由弗萊堡大學(xué)于2012年獲得專利(wo2013079307a1，faltin等，2012)。該方法設(shè)計(jì)用于使用可標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)告分子進(jìn)行比色多路復(fù)用。每個(gè)檢測(cè)通道都會(huì)記錄信號(hào)，無(wú)論其信號(hào)強(qiáng)度如何，在均相反應(yīng)中只能將其分配給一個(gè)激活的通用報(bào)告分子。已經(jīng)觀察到，不同的熒光團(tuán)在實(shí)時(shí)pcr條件下會(huì)產(chǎn)生不同的信號(hào)強(qiáng)度和信號(hào)曲線，并且可以通過(guò)最大化靶序列非特異性熒光通用報(bào)告分子的信號(hào)生成來(lái)優(yōu)化相應(yīng)的多重實(shí)時(shí)pcr的性能特征(lehnert等，2018；kipf等，2022)。然而，在實(shí)時(shí)pcr中對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行建模并沒(méi)有實(shí)際的附加價(jià)值，因?yàn)槭褂眠@種方法無(wú)法區(qū)分同一檢測(cè)通道中的信號(hào)曲線。在比色數(shù)字多重媒介探針pcr中，還顯示與陰性對(duì)照相比，最大化熒光信號(hào)生成可以更好地分離數(shù)據(jù)空間中的群體(schlenker等，2021b)。

7、在同一時(shí)期，seegene?inc.開發(fā)了一項(xiàng)技術(shù)，該技術(shù)也是基于實(shí)時(shí)pcr中通過(guò)兩種檢測(cè)分子分離dna序列檢測(cè)和信號(hào)生成。在這里，未標(biāo)記的pto探針與dna靶序列結(jié)合，被切割并釋放出片段，然后與熒光標(biāo)記的靶序列非特異性檢測(cè)分子(cto分子)形成延伸的雙鏈。該過(guò)程用于影響這些檢測(cè)分子的不同長(zhǎng)度的信號(hào)生成。這使得例如可以通過(guò)在定義的預(yù)定溫度下讀取信號(hào)來(lái)區(qū)分同一檢測(cè)通道中的多個(gè)靶序列。另一項(xiàng)專利也在同一檢測(cè)通道中以一種方法在實(shí)時(shí)pcr中使用不同溫度下的讀數(shù)，因此可以解釋為上述seegene技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展(pct/cn2018/084794)。在這里，延伸的報(bào)告分子也在檢測(cè)后熔化。與之前的專利不同，報(bào)告分子可用于區(qū)分不同的靶序列。由于目前在市售設(shè)備中無(wú)法將讀取過(guò)程中的溫度控制作為dpcr的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)，因此無(wú)法將其直接轉(zhuǎn)移到dpcr。

8、hahn-schickard已經(jīng)致力于通過(guò)光漂白生成虛擬熒光通道來(lái)提高pcr的多路復(fù)用程度(wo2016087637a1)(schuler等，2016)。為了將這種方法與數(shù)字媒介探針pcr中分離信號(hào)生成和檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，在數(shù)字媒介探針pcr中增加了一個(gè)步驟，使用具有不同熒光團(tuán)標(biāo)記的各種通用報(bào)告類型，其中這些熒光團(tuán)被led燈發(fā)出的光漂白(漂白)并在同一熒光檢測(cè)通道中讀取。根據(jù)所選的熒光團(tuán)，可以觀察到由于漂白而導(dǎo)致的信號(hào)強(qiáng)度降低，從而可以分離圖的數(shù)據(jù)空間中的群體并生成額外的所謂虛擬通道(schlenker等，2021a)。然而，由于漂白技術(shù)需要額外的設(shè)備和工藝步驟，而目前市售設(shè)備無(wú)法提供這些設(shè)備和工藝步驟，因此由于技術(shù)和監(jiān)管障礙，無(wú)法在現(xiàn)有的dpcr平臺(tái)中實(shí)施。然而，在這種方法中，被選為通用報(bào)告分子標(biāo)記的熒光團(tuán)在漂白步驟之前還沒(méi)有產(chǎn)生不同的熒光信號(hào)強(qiáng)度，如果每個(gè)反應(yīng)包含多于一個(gè)靶序列，這使得圖的數(shù)據(jù)空間中的群體能夠均勻分離。所使用的通用報(bào)告分子沒(méi)有必要的熒光團(tuán)和淬滅劑配置，無(wú)法進(jìn)行單色識(shí)別。由于報(bào)告分子標(biāo)記的熒光信號(hào)強(qiáng)度的散射性高，無(wú)法在數(shù)據(jù)空間中明確區(qū)分具有更高“方差”的單個(gè)熒光信號(hào)群體和第二個(gè)信號(hào)群體。特別是，該技術(shù)不能明顯地評(píng)估多重反應(yīng)是一個(gè)還是兩個(gè)群體，因此不提供通過(guò)靶序列非特異性報(bào)告分子在同一檢測(cè)通道中直接進(jìn)行多路復(fù)用的可能性(schlenker等，2021a)。

9、發(fā)明目的

10、現(xiàn)有技術(shù)中仍缺少一種調(diào)節(jié)靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子(由例如不同的熒光團(tuán)和/或淬滅劑產(chǎn)生)的信號(hào)強(qiáng)度的方法，使得在一次反應(yīng)中在相同的檢測(cè)通道中或在多維數(shù)據(jù)空間的相應(yīng)區(qū)域中產(chǎn)生多個(gè)可區(qū)分的信號(hào)簇，從而利用間接信號(hào)產(chǎn)生在測(cè)定精度和穩(wěn)健性方面的優(yōu)勢(shì)，以規(guī)避先前描述的數(shù)字pcr中比色多路復(fù)用或靶序列特定強(qiáng)度多路復(fù)用的問(wèn)題。到目前為止，僅描述了在通過(guò)靶序列進(jìn)行的數(shù)字?jǐn)U增中單色多路復(fù)用非特異性報(bào)告分子，從而通過(guò)引入額外的工藝步驟(例如漂白)實(shí)現(xiàn)更高的多路復(fù)用程度。這使過(guò)程或評(píng)估變得復(fù)雜，降低了精度，導(dǎo)致額外的優(yōu)化工作，并使例如批準(zhǔn)程序變得復(fù)雜。因此，本發(fā)明的目的是增加檢測(cè)反應(yīng)中可檢測(cè)的核酸靶序列的數(shù)量，使其超過(guò)設(shè)備端的檢測(cè)通道數(shù)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明通過(guò)從屬權(quán)利要求和獨(dú)立權(quán)利要求的方法解決了這一目的。

2、因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于在同一檢測(cè)通道中通過(guò)至少兩種靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子特異性檢測(cè)至少兩個(gè)核酸靶序列的方法，包括以下步驟：

3、a.提供至少第一核酸靶序列和第二核酸靶序列，

4、b.提供至少第一媒介探針和第二媒介探針，每個(gè)媒介探針均包括寡核苷酸，

5、其中第一媒介探針的寡核苷酸包括媒介序列和探針序列，其中媒介序列對(duì)第一類型的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子具有親和性，并且探針序列對(duì)第一核酸靶序列表現(xiàn)出親和性，

6、其中第二媒介探針的寡核苷酸包括媒介序列和探針序列，其中媒介序列對(duì)第二類型的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子具有親和性，并且探針序列對(duì)第二核酸靶序列表現(xiàn)出親和性，

7、其中至少第一媒介探針和第二媒介探針沒(méi)有標(biāo)記，或優(yōu)選地沒(méi)有信號(hào)生成標(biāo)記，

8、c.提供至少第一類型和第二類型的至少兩種靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子，每種分子包含在同一檢測(cè)通道中具有可測(cè)量信號(hào)的至少一種標(biāo)記，以及對(duì)至少一個(gè)媒介序列具有特異性親和性的核酸序列，

9、其中至少兩種靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子中的每種類型由各自的至少一種標(biāo)記表征，使得其具有的信號(hào)強(qiáng)度優(yōu)選對(duì)于各自類型的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子而言是唯一的，并且與所有其他靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子類型的標(biāo)記的信號(hào)強(qiáng)度可區(qū)分，并且能夠直接分配給各自的核酸靶序列，

10、d.進(jìn)行核酸檢測(cè)反應(yīng)，其中，當(dāng)至少第一媒介探針的探針序列與至少第一核酸靶序列結(jié)合時(shí)，釋放至少第一媒介探針的至少一個(gè)媒介序列，

11、其中至少一個(gè)釋放的媒介序列與第一類型的至少一種靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子結(jié)合，其中，通過(guò)至少一種標(biāo)記產(chǎn)生信號(hào)，所述信號(hào)通過(guò)其對(duì)于第一核酸靶序列的信號(hào)強(qiáng)度和/或發(fā)射光譜表征，所述第一核酸靶序列分配給各自的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子，至少一種第一媒介探針的至少一個(gè)探針序列已經(jīng)與所述各自的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子結(jié)合，

12、并且可選地，其中至少一種第二媒介探針的至少一個(gè)媒介序列在其探針序列與至少一個(gè)第二核酸靶序列結(jié)合時(shí)被釋放，其中至少一個(gè)釋放的媒介序列與至少一種第二類型的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子結(jié)合，其中至少一種標(biāo)記產(chǎn)生信號(hào)，所述信號(hào)的的信號(hào)強(qiáng)度和/或發(fā)射光譜對(duì)于分配給各自的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子的第二核酸靶序列是特征性的，至少一種第二媒介探針的至少一個(gè)探針序列已經(jīng)與所述各自的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子結(jié)合，

13、e.檢測(cè)步驟d.下產(chǎn)生的信號(hào)，包括在檢測(cè)通道中檢測(cè)信號(hào)和/或在數(shù)據(jù)空間中分析信號(hào)、信號(hào)強(qiáng)度和/或信號(hào)的發(fā)射光譜和/或由此產(chǎn)生的信號(hào)簇，優(yōu)選地，其中不同的靶序列非特異性報(bào)告分子的信號(hào)也可以通過(guò)它們?cè)谕粰z測(cè)通道或數(shù)據(jù)空間的相應(yīng)區(qū)域中的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)區(qū)分。

14、在實(shí)施方式中，第一媒介探針因此包含寡核苷酸，第一媒介探針本身包含媒介序列，以及探針序列。因此，在實(shí)施方式中，第二媒介探針進(jìn)一步包含寡核苷酸，第二媒介探針本身包含媒介序列，以及探針序列。優(yōu)選地，第一媒介探針的媒介序列不同于第二媒介探針的媒介序列。優(yōu)選地，第一媒介探針的探針序列不同于第二媒介探針的探針序列。

15、換句話說(shuō)，在根據(jù)本發(fā)明方法的實(shí)施方式中，第一媒介探針的媒介序列不同于第二媒介探針的媒介序列，并且第一媒介探針的探針序列不同于第二媒介探針的探針序列。因此，優(yōu)選地，第二媒介探針的探針序列對(duì)“第二”核酸靶序列也具有親和性，該“第二”核酸靶序列不同于“第一”核酸靶序列(例如在其核酸序列中)，而第一媒介探針的探針序列又對(duì)該“第一”核酸靶序列具有親和性。同樣適用于可選地存在和可選地使用的進(jìn)一步的(第三、第四等)媒介探針。

16、在實(shí)施方式中，步驟c.包括提供至少兩種至少第一類型和第二類型的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子，每種報(bào)告分子包括在同一檢測(cè)通道中具有各自的可測(cè)量信號(hào)和/或在同一檢測(cè)通道中具有各自的信號(hào)強(qiáng)度最大值的至少一種標(biāo)記，以及各自對(duì)至少一種媒介序列具有特定親和性的核酸序列。

17、根據(jù)本發(fā)明，“第一”核酸靶序列和“第二”核酸靶序列優(yōu)選在其核酸序列和/或其表觀遺傳修飾方面不同。同樣適用于可選地存在和可選地可檢測(cè)的進(jìn)一步的(第三、第四等)核酸靶序列。

18、在根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，將標(biāo)記寡核苷酸形式的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子分配給核酸靶序列。這些報(bào)告分子通過(guò)釋放另一個(gè)寡核苷酸作為核酸檢測(cè)反應(yīng)的部分而被激活，從而產(chǎn)生信號(hào)。不同類型的報(bào)告分子各自用不同的標(biāo)記(例如熒光團(tuán)和/或淬滅劑和/或不同數(shù)量的熒光團(tuán)和淬滅劑)修飾，并具有不同的dna序列，這間接地使得能夠分配給靶序列。在相同的檢測(cè)通道中，不同的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子類型由于其不同的標(biāo)記而產(chǎn)生不同信號(hào)強(qiáng)度的信號(hào)。因此，基于不同的信號(hào)強(qiáng)度，還可以在相同的檢測(cè)通道或相應(yīng)的跨度數(shù)據(jù)空間(由多維表示中的軸或純數(shù)學(xué)比較/分析和/或算法分析中的不同檢測(cè)通道跨越)中區(qū)分各自具有不同標(biāo)記的不同報(bào)告分子類型的信號(hào)，并且可以分配靶序列。根據(jù)本發(fā)明，可以優(yōu)選地在同一檢測(cè)通道或數(shù)據(jù)空間的相應(yīng)區(qū)域中檢測(cè)至少兩種不同的報(bào)告分子復(fù)合物的信號(hào)。這些報(bào)告分子獨(dú)立于靶序列的事實(shí)使得能夠首次開發(fā)在同一檢測(cè)通道內(nèi)具有特別好區(qū)分的信號(hào)強(qiáng)度的報(bào)告分子。由于這些報(bào)告分子是靶序列獨(dú)立的，因此它們還可以具有適當(dāng)?shù)臉?biāo)記配置，從而實(shí)現(xiàn)有效的信號(hào)建模。例如，它們的信號(hào)可以在初始狀態(tài)下通過(guò)接觸淬滅而被抑制，從而它們?cè)诩せ顮顟B(tài)下顯示出更大的信號(hào)生成差異或具有帶有熒光團(tuán)和/或淬滅劑的多種標(biāo)記。這允許使用者將反應(yīng)中可檢測(cè)的靶序列數(shù)量增加到超過(guò)檢測(cè)通道數(shù)量，而無(wú)需購(gòu)買額外的設(shè)備、擴(kuò)展設(shè)備或?qū)嵤┻M(jìn)一步的復(fù)雜工藝步驟，這代表了巨大的附加值并確保了高成本效率。可以保留現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室流程，并且可以繼續(xù)使用已經(jīng)認(rèn)證的設(shè)備，而無(wú)需重新實(shí)施，如果需要，也無(wú)需重新認(rèn)證。此外，這使得這些靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子能夠得到有效優(yōu)化，因?yàn)樗鼈冸S后可用于進(jìn)一步的靶序列，而不必在靶序列依賴性方面從頭開始開發(fā)和優(yōu)化。因此，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同靶序列的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的簡(jiǎn)化和有效的過(guò)程優(yōu)化，并減少了所需的工作和成本。

19、根據(jù)本發(fā)明的方法，通過(guò)靶序列非特異性報(bào)告分子能夠?qū)崿F(xiàn)精確、有效(直接)的單色多路復(fù)用。因此，它能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)報(bào)告分子進(jìn)行有效的靶序列獨(dú)立性優(yōu)化，從而改善了同一檢測(cè)通道或數(shù)據(jù)空間的相應(yīng)區(qū)域中信號(hào)群體的分離。這使得能夠精確檢測(cè)超出設(shè)備檢測(cè)通道數(shù)量的額外核酸靶序列。這是可能的，因?yàn)榕c靶序列特異性報(bào)告分子相比，使用靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子顯著簡(jiǎn)化和改進(jìn)了在合適的配置和/或熒光信號(hào)生成建模中對(duì)同一檢測(cè)通道使用熒光團(tuán)和淬滅劑的對(duì)稱多重標(biāo)記和/或使用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，例如通過(guò)接觸淬滅。

20、這是使用靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子(例如通用報(bào)告分子)完成的，這些報(bào)告分子是標(biāo)記的寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸都可以(間接)分配給要檢測(cè)的核酸靶序列，并通過(guò)結(jié)合釋放的進(jìn)一步寡核苷酸作為核酸檢測(cè)反應(yīng)(例如pcr或數(shù)字pcr)的一部分而被激活。為了區(qū)分表示/指示同一檢測(cè)通道中或數(shù)據(jù)空間的相應(yīng)區(qū)域中存在不同核酸靶序列的信號(hào)(檢測(cè)到的信號(hào)的圖形表示)，要檢測(cè)的至少兩個(gè)靶序列分別分配給兩種不同類型的靶序列非特異性報(bào)告分子，靶序列非特異性報(bào)告分子在同一檢測(cè)通道中產(chǎn)生具有不同信號(hào)強(qiáng)度的信號(hào)。

21、根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)點(diǎn)在于，可以在(pcr)裝置的同一檢測(cè)通道(例如，用于檢測(cè)紅色熒光信號(hào)的通道)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。通過(guò)使用不同的靶序列非特異性報(bào)告分子，可以實(shí)現(xiàn)在單個(gè)檢測(cè)通道中同時(shí)檢測(cè)，每種非特異性報(bào)告分子包含產(chǎn)生具有相似熒光發(fā)射光譜的不同信號(hào)的標(biāo)記，并且可以在裝置(例如，數(shù)字pcr裝置)的同一熒光檢測(cè)通道中同時(shí)檢測(cè)，并且仍然可以彼此區(qū)分。利用此特征，本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)單色多路復(fù)用，即在單個(gè)(“單色”)熒光檢測(cè)通道(具有特定波長(zhǎng)范圍)內(nèi)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)。

22、在現(xiàn)有技術(shù)的一些數(shù)字pcr方法中，使用兩個(gè)標(biāo)記探針在乳化液滴中檢測(cè)第一或第二靶序列，每個(gè)標(biāo)記探針在一個(gè)液滴中分離，每個(gè)標(biāo)記探針產(chǎn)生可以與非特異性擴(kuò)增區(qū)分開的均質(zhì)信號(hào)。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，不使用標(biāo)記探針，其優(yōu)點(diǎn)在于，標(biāo)記報(bào)告分子可以比現(xiàn)有技術(shù)的已知方法可能的更大程度地優(yōu)化，因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的報(bào)告分子隨后可用于進(jìn)一步的測(cè)定。此外，根據(jù)本發(fā)明的報(bào)告分子優(yōu)選可以僅采用一種發(fā)生接觸淬滅的配置。這種優(yōu)選特性優(yōu)選能夠或支持以本發(fā)明的形式進(jìn)行的(直接)單色復(fù)用。

23、根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，可以通過(guò)選擇所使用的獨(dú)立于待檢測(cè)靶序列的各自的報(bào)告分子來(lái)精確調(diào)整所需的檢測(cè)特性。具有所需特性(例如熒光強(qiáng)度和/或顏色)的報(bào)告分子之間的連接部分是媒介探針，其包含探針序列和媒介序列，該連接部分易于生產(chǎn)和設(shè)計(jì)。為了個(gè)體化待檢測(cè)的靶核酸，僅需提供媒介探針的兩種不同序列組分。然后，這些組分可以與匹配媒介序列的靶序列非特異性報(bào)告分子相結(jié)合。這種獨(dú)立性允許設(shè)置所需的特定接觸淬滅，從而能夠在同一檢測(cè)通道中檢測(cè)多個(gè)可區(qū)分的報(bào)告分子信號(hào)。此外，信號(hào)的優(yōu)化可以獨(dú)立于眾多靶序列進(jìn)行一次。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法節(jié)省資源，因?yàn)閳?bào)告分子組可以重復(fù)用于任意數(shù)量的核酸靶序列，從而使可組合報(bào)告分子信號(hào)的初始一次性開發(fā)非常省力且成本低廉。

24、此外，根據(jù)本發(fā)明的方法能夠直接檢測(cè)核酸靶序列，因?yàn)檫@可以直接分配給數(shù)據(jù)群體(評(píng)估/分析中的信號(hào)群體)，并且不需要組合。

25、通過(guò)對(duì)報(bào)告分子進(jìn)行不同標(biāo)記來(lái)產(chǎn)生不同信號(hào)強(qiáng)度的一種可能性是，例如，由于標(biāo)記的物理分子特性，這些特性在靶序列非特異性報(bào)告分子激活后通過(guò)接觸淬滅而被放大：

26、因此，在實(shí)施方式中，靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子的至少一種標(biāo)記是至少一種熒光團(tuán)和/或至少一種淬滅劑。

27、這些靶序列非特異性報(bào)告分子在有效生成精確可區(qū)分信號(hào)群體方面的另一個(gè)基本特性是，選擇標(biāo)記配置，使得能夠以這樣的方式生成信號(hào)，即它們的信號(hào)強(qiáng)度足夠穩(wěn)健、穩(wěn)定，因此足夠精確，以在讀出過(guò)程中保持可區(qū)分，而無(wú)需進(jìn)一步的處理步驟(例如漂白)。結(jié)果表明，例如，通過(guò)使用與通用報(bào)告分子的基本結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的配置或以標(biāo)準(zhǔn)化方式進(jìn)行相應(yīng)的修改，這是可能的。靶序列非特異性報(bào)告分子可以以合適的方式建模，從而可以在檢測(cè)通道中精確調(diào)整不同的信號(hào)強(qiáng)度(lehnert等，2018)。

28、因此，在實(shí)施方式中，不同的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子類型在其至少一種標(biāo)記的信號(hào)強(qiáng)度和/或發(fā)射光譜方面不同。

29、在實(shí)施方式中，靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子的至少一種標(biāo)記包括具有相同或不同發(fā)射光譜和/或相同或不同信號(hào)強(qiáng)度的至少兩種熒光團(tuán)和/或兩種淬滅劑。

30、在一些實(shí)施方式中，第一類型的報(bào)告分子與至少第二類型的報(bào)告分子的區(qū)別在于標(biāo)記的數(shù)量或熒光團(tuán)和/或淬滅劑的數(shù)量。因此，不同類型的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子可以通過(guò)其激活時(shí)釋放的熒光的信號(hào)強(qiáng)度和/或強(qiáng)度來(lái)區(qū)分。為此，不同類型的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子可以包含不同數(shù)量和/或不同的熒光團(tuán)(具有不同的發(fā)射光譜/顏色和/或強(qiáng)度)和/或淬滅劑或它們的任何組合。

31、在標(biāo)記包含至少一種熒光團(tuán)的優(yōu)選實(shí)施方式中，該至少一種熒光團(tuán)的熒光信號(hào)優(yōu)選通過(guò)接觸淬滅來(lái)抑制，直到報(bào)告分子被激活。因此，優(yōu)選未激活的報(bào)告分子不釋放信號(hào)。激活優(yōu)選通過(guò)媒介序列與相應(yīng)的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子的結(jié)合和/或在核酸檢測(cè)反應(yīng)中，已經(jīng)通過(guò)聚合酶與靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子結(jié)合的媒介序列的后續(xù)延伸而發(fā)生。

32、因此，在實(shí)施方式中，靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子的至少一種標(biāo)記包括至少一種熒光團(tuán)和至少一種淬滅劑，其中，只要沒(méi)有媒介序列與相應(yīng)的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子結(jié)合，或者只要結(jié)合的媒介序列在核酸檢測(cè)反應(yīng)期間沒(méi)有延伸，則優(yōu)選在至少一種熒光團(tuán)和至少一種淬滅劑之間發(fā)生接觸淬滅。

33、這使得例如能夠在合適的設(shè)備中檢測(cè)額外的dna靶序列作為數(shù)字dna擴(kuò)增和基于熒光的檢測(cè)的一部分，而無(wú)需進(jìn)一步的技術(shù)輔助或改變具有熒光標(biāo)記的報(bào)告分子的濃度。這允許例如產(chǎn)生與數(shù)字媒介探針pcr(mp-pcr)與光漂白相結(jié)合的結(jié)果類似的結(jié)果，而無(wú)需漂白過(guò)程(例如通過(guò)led或熱漂白)，這顯著減少了實(shí)驗(yàn)工作量，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)并使其能夠在現(xiàn)有設(shè)備中實(shí)施。因此，與數(shù)字媒介探針pcr(mp-pcr)或其他現(xiàn)有技術(shù)方法相比，根據(jù)本發(fā)明的方法代表了極高的附加值，因?yàn)樗c現(xiàn)有平臺(tái)直接兼容，并且可以顯著簡(jiǎn)化特定檢測(cè)方法的可能診斷批準(zhǔn)。根據(jù)本發(fā)明的方法在檢測(cè)開發(fā)中提供了額外的新自由度，其中相應(yīng)的靶序列特異性探針的合成過(guò)程不一定很復(fù)雜。此外，由于可以在每個(gè)反應(yīng)中包括額外的核酸序列，因此可以顯著提高根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)的靈敏度。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，一組合適的靶序列非特異性報(bào)告分子總是在數(shù)據(jù)空間的相似區(qū)域中產(chǎn)生群體，從而可以獨(dú)立于檢測(cè)反應(yīng)中的靶序列得出關(guān)于激活報(bào)告分子的結(jié)論，因此同一組可以與不同的核酸靶序列面板一起使用，而無(wú)需耗時(shí)的優(yōu)化。

34、在根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方式中，在步驟e.下對(duì)信號(hào)、信號(hào)強(qiáng)度和/或信號(hào)的發(fā)射光譜的分析包括在由評(píng)估的檢測(cè)通道所跨越的數(shù)據(jù)空間中根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度和/或檢測(cè)通道和/或發(fā)射光譜顯示和/或分析檢測(cè)到的信號(hào)。

35、在本發(fā)明的上下文中，數(shù)據(jù)空間優(yōu)選由不同檢測(cè)通道的繪圖(plot)、圖表(diagram)或圖形(graph)或由不同檢測(cè)通道的純數(shù)學(xué)和/或算法和/或基于計(jì)算機(jī)的評(píng)估、比較或并置來(lái)生成，其中所使用的靶序列非特異性報(bào)告分子的各自的熒光信號(hào)在此1-n維數(shù)據(jù)空間中生成數(shù)據(jù)點(diǎn)(取決于評(píng)估所需的檢測(cè)通道數(shù)量)，其可以分組為簇(組、集合)。

36、在本發(fā)明的上下文中，數(shù)據(jù)空間優(yōu)選是在繪圖、圖表或圖形中由x軸和y軸(二維繪圖)跨越的空間，并且可選地在三維圖形的情況下額外由z軸跨越的空間，或者在相應(yīng)更高維空間的情況下由另一個(gè)軸跨越的空間，并且其中表示要顯示的數(shù)據(jù)(檢測(cè)到的信號(hào)的數(shù)據(jù))。在用于該過(guò)程的檢測(cè)通道顯示在圖形的軸上的實(shí)施方式中，例如在x軸上在紅色檢測(cè)通道中檢測(cè)到的信號(hào)和在y軸上在綠色檢測(cè)通道中檢測(cè)到的信號(hào)，數(shù)據(jù)空間也可以稱為“由檢測(cè)通道跨越”。優(yōu)選地，可以將數(shù)據(jù)空間中顯示的檢測(cè)到的信號(hào)清楚地分配給靶序列，該檢測(cè)到的信號(hào)可以優(yōu)選地以不同的信號(hào)群體的形式顯示。如果在同一檢測(cè)通道中檢測(cè)到對(duì)不同靶序列特異性的多個(gè)信號(hào)，則這優(yōu)選也是可能的。

37、在實(shí)施方式中，在pcr反應(yīng)中同時(shí)使用的報(bào)告分子彼此不同，其不同之處在于熒光團(tuán)的類型(例如顏色、發(fā)射光譜和/或強(qiáng)度)和/或淬滅劑的類型和/或不同報(bào)告分子上的標(biāo)記數(shù)量不同。在根據(jù)本發(fā)明的單色多路復(fù)用的實(shí)施方式中，同一檢測(cè)通道中的至少兩種靶核酸通過(guò)具有不同或可區(qū)分信號(hào)的報(bào)告分子間接檢測(cè)到。在要檢測(cè)超過(guò)兩種靶核酸的實(shí)施方式中，如果需要，可以將要產(chǎn)生的用于檢測(cè)靶核酸的信號(hào)分配到多個(gè)檢測(cè)通道之間(并且可以相應(yīng)地選擇不同類型的報(bào)告分子的標(biāo)記)，其中優(yōu)選地，同一檢測(cè)通道中的至少兩種靶核酸通過(guò)具有不同或可區(qū)分信號(hào)的報(bào)告分子間接檢測(cè)到。

38、在實(shí)施方式中，可以檢測(cè)至少第一核酸靶序列和第二核酸靶序列，或者甚至至少第一、第二和第三，或者甚至第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一或甚至更多靶序列或檢測(cè)它們的存在。

39、根據(jù)待檢測(cè)的核酸靶序列的數(shù)量，提供至少第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一或甚至更多媒介探針，每個(gè)媒介探針包含寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸包含媒介序列和探針序列。

40、因此，根據(jù)待檢測(cè)的核酸靶序列的數(shù)量，提供第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一或甚至更多類型的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子，并將其用于本文所述的根據(jù)本發(fā)明的方法或試劑盒中。

41、本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解如何組合根據(jù)本發(fā)明的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子及其標(biāo)記的類型，以實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的所需靶序列的檢測(cè)。

42、在實(shí)施方式中，至少一種靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子的標(biāo)記包括至少兩個(gè)互補(bǔ)的相對(duì)核堿基，每個(gè)核堿基具有至少一種標(biāo)記，或至少兩個(gè)相對(duì)的堿基與互補(bǔ)的堿基對(duì)偏移一個(gè)堿基位置，每個(gè)互補(bǔ)的堿基對(duì)具有至少一種標(biāo)記。

43、本發(fā)明能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶核酸(多路復(fù)用)，其中同時(shí)檢測(cè)到的靶核酸的數(shù)量可以大于檢測(cè)裝置中可用的檢測(cè)通道的數(shù)量。這是因?yàn)椋诿糠N情況下使用的報(bào)告分子都包含標(biāo)記，盡管在同一檢測(cè)通道中同時(shí)檢測(cè)到多種不同的報(bào)告分子的信號(hào)，但這些標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)可以彼此區(qū)分，并且可以在分析中表示為二維或三維數(shù)據(jù)空間中不同的(非重疊的)信號(hào)群。在實(shí)施方式中，這使得盡管在相同的檢測(cè)通道中檢測(cè)，但能夠區(qū)分指示不同靶核酸存在的信號(hào)，并且在特定實(shí)施方式中，還可以與背景噪聲區(qū)分開來(lái)。

44、在根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方式中，在步驟d.-e.中，通過(guò)n種不同的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子類型間接檢測(cè)到n種不同的核酸靶序列，其中在步驟d.中產(chǎn)生的信號(hào)的檢測(cè)發(fā)生在k個(gè)檢測(cè)通道中，

45、其中n>k且n≥2，并且

46、其中至少兩種不同的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子類型在步驟e.中在同一檢測(cè)通道中檢測(cè)到和/或在步驟e.下的表示中在數(shù)據(jù)空間的相同區(qū)域中表示。

47、通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的方法，在實(shí)施方式中可以在更高維數(shù)據(jù)空間(>3維，具有超過(guò)三個(gè)檢測(cè)通道)中執(zhí)行數(shù)據(jù)分類。在實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法允許數(shù)字pcr中可區(qū)分的靶序列的數(shù)量是可用的檢測(cè)通道的至少兩倍，前提是這本身不受設(shè)備端的技術(shù)限制的阻礙，例如不同檢測(cè)通道之間可能存在的串?dāng)_(熒光信號(hào)的相互干擾；由于錯(cuò)誤地檢測(cè)到來(lái)自相鄰檢測(cè)通道的熒光而導(dǎo)致熒光信號(hào)與另一種熒光團(tuán)的信號(hào)錯(cuò)誤關(guān)聯(lián))。

48、在實(shí)施方式中，抑制、刪除或淬滅報(bào)告分子的標(biāo)記的信號(hào)，直到媒介序列與報(bào)告分子結(jié)合，并且優(yōu)選地通過(guò)聚合酶作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)的一部分延伸。在實(shí)施方式中，通過(guò)聚合酶實(shí)現(xiàn)空間分離，例如至少一種熒光團(tuán)與至少一種淬滅劑的空間分離，從而產(chǎn)生信號(hào)并可以檢測(cè)到。

49、在根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方式中，靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子的標(biāo)記的信號(hào)通過(guò)靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子的切割和/或分離和/或通過(guò)至少一種熒光團(tuán)和至少一種淬滅劑的空間分離產(chǎn)生。

50、在實(shí)施方式中，至少一種靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子是寡核苷酸或寡核苷酸復(fù)合物。

51、在根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方式中，步驟d.中的核酸檢測(cè)反應(yīng)包括dna和/或cdna的擴(kuò)增程序。

52、在根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方式中，步驟d.下的核酸檢測(cè)反應(yīng)是pcr、rt-pcr、rpa或lamp，其中，在dna擴(kuò)增過(guò)程中，與靶核酸結(jié)合的媒介探針的媒介序列通過(guò)生物分子的酶活性釋放，然后生物分子與靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子結(jié)合，從而產(chǎn)生信號(hào)。

53、在實(shí)施方式中，步驟e.下的檢測(cè)作為數(shù)字?jǐn)U增和/或信號(hào)生成的一部分進(jìn)行。

54、在根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方式中，靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子是通用報(bào)告分子和/或模塊化報(bào)告分子復(fù)合物，并且至少一個(gè)(分別)釋放的媒介序列是媒介探針pcr或媒介置換lamp的組件。

55、在實(shí)施方式中，核酸靶序列源自另一生物分子轉(zhuǎn)化為dna序列信息。

56、在一些實(shí)施方式中，可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將rna序列轉(zhuǎn)錄為cdna來(lái)確定樣品中rna序列(生物分子的實(shí)施方式)的存在和/或量。在實(shí)施方式中，該cdna可以作為根據(jù)本發(fā)明的方法的一部分進(jìn)行擴(kuò)增，并通過(guò)靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子間接檢測(cè)到。

57、在根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方式中，至少一種標(biāo)記包括選自電化學(xué)活性標(biāo)記和/或磁性標(biāo)記的標(biāo)記。

58、在根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施方式中，在不同溫度下讀出信號(hào)。

59、在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，媒介探針包括寡核苷酸和序列特異性探針部分，該序列特異性探針部分與靶序列結(jié)合并在3'端受到保護(hù)。3'端的這種保護(hù)可以是阻斷基團(tuán)(保護(hù)基團(tuán))，例如化學(xué)阻斷或保護(hù)基團(tuán)，在一些實(shí)施方式中，其包括三個(gè)碳原子的鏈。媒介探針在3'端的保護(hù)優(yōu)選防止在擴(kuò)增反應(yīng)期間聚合酶對(duì)序列鏈的(非特異性)延伸。根據(jù)本發(fā)明，在實(shí)施方式中，媒介探針可以包括任何適合于防止在擴(kuò)增反應(yīng)期間聚合酶對(duì)媒介探針序列鏈的(非特異性)延伸的保護(hù)或阻斷基團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，媒介探針通過(guò)除3'端的阻斷基團(tuán)(保護(hù)基團(tuán))之外的手段來(lái)保護(hù)以免受(非特異性)聚合酶延伸。

60、在其他實(shí)施方式中，媒介探針在3'端不包含阻斷基團(tuán)(保護(hù)基團(tuán))，并且不受到免受(非特異性)聚合酶延伸的保護(hù)。

61、在實(shí)施方式中，在3'端受保護(hù)的媒介探針可以包含“c3間隔物”。這種c3間隔物可以是化學(xué)阻斷基團(tuán)，在一些實(shí)施方式中，該化學(xué)阻斷基團(tuán)包含三個(gè)碳原子的鏈。因此，該“c3間隔物”優(yōu)選防止媒介探針序列鏈的(非特異性)聚合酶延伸。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉典型的、并且取決于實(shí)施方式的合適的阻斷基團(tuán)(保護(hù)基團(tuán))。此外，基于本發(fā)明的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何選擇合適的阻斷基團(tuán)(保護(hù)基團(tuán))作為本文所述本發(fā)明的常規(guī)調(diào)整。

62、優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法因此能夠在k個(gè)檢測(cè)通道中直接終點(diǎn)檢測(cè)n個(gè)靶標(biāo)，其中n>k且n≥2。與現(xiàn)有技術(shù)相比，根據(jù)本發(fā)明的信號(hào)不是由熒光探針產(chǎn)生的，而是由靶標(biāo)序列獨(dú)立性報(bào)告分子產(chǎn)生的，其也可以被描述為群體特異性報(bào)告分子，其優(yōu)選在強(qiáng)度范圍內(nèi)具有唯一差異。這確保了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程的更大靈活性，并允許使用利用接觸淬滅進(jìn)行初始信號(hào)抑制的報(bào)告分子。此外，它允許控制信號(hào)生成，從而產(chǎn)生更易于區(qū)分和更穩(wěn)健的熒光信號(hào)，特別適合終點(diǎn)檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式基于通用報(bào)告分子結(jié)構(gòu)，并與媒介探針結(jié)合用于靶序列檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的方法的基本原理之一優(yōu)選是通過(guò)激活n種報(bào)告分子類型的n種靶標(biāo)特異性媒介探針類型檢測(cè)n種靶核酸序列，其中每種報(bào)告分子類型都標(biāo)記有具有確定的光學(xué)特性的獨(dú)特?zé)晒鈭F(tuán)(圖1)。在雙重反應(yīng)(duplex?reaction)的實(shí)例中，將選擇兩種熒光團(tuán)，它們?cè)谙嗤牟ㄩL(zhǎng)范圍內(nèi)發(fā)射熒光，但在檢測(cè)范圍內(nèi)的強(qiáng)度不同。在dpcr擴(kuò)增期間，結(jié)合的無(wú)標(biāo)記媒介探針被聚合酶切割并釋放媒介序列。該媒介物激活報(bào)告分子類型，然后產(chǎn)生熒光信號(hào)。所有具有特定報(bào)告分子類型的信號(hào)的液滴或隔室的總和在數(shù)據(jù)空間的某個(gè)區(qū)域中形成一個(gè)群體，對(duì)應(yīng)于獨(dú)特的熒光標(biāo)記。那些用較高量子收率熒光團(tuán)標(biāo)記的報(bào)告分子類型將產(chǎn)生具有較高熒光強(qiáng)度的陽(yáng)性群體(圖1底部：高強(qiáng)度顯示為較大的圓圈)，而那些在檢測(cè)區(qū)域中具有較低量子收率的分子將產(chǎn)生具有較低熒光強(qiáng)度的陽(yáng)性群體(圖1頂部：低強(qiáng)度顯示為較小的圓圈)。根據(jù)它們?cè)跀?shù)據(jù)空間中的位置，可以將形成的群體分配給樣品中要檢測(cè)的特定靶標(biāo)dna序列。當(dāng)一個(gè)隔室中存在兩個(gè)靶標(biāo)時(shí)，假設(shè)熒光強(qiáng)度具有累加效應(yīng)，這將導(dǎo)致形成具有更高信號(hào)強(qiáng)度的第三個(gè)群體。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，可以觀察到類似的信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)，例如，通過(guò)在雙重報(bào)告分子-dpcr反應(yīng)中在報(bào)告分子上使用兩種不同類型的淬滅劑或兩種類似的熒光團(tuán)標(biāo)記。在兩個(gè)檢測(cè)通道中進(jìn)行的四重報(bào)告分子dpcr檢測(cè)的實(shí)例中，一個(gè)隔室中存在多個(gè)靶標(biāo)導(dǎo)致正交群體的形成。這意味著通過(guò)使用四種不同的報(bào)告分子類型，理論上可以檢測(cè)到和區(qū)分多達(dá)十六種不同的群體(例如圖5)。不受理論的束縛，可以假設(shè)在數(shù)字測(cè)定中靶核酸的分布遵循泊松統(tǒng)計(jì)。因此，雙重和多重陽(yáng)性群體的產(chǎn)生可能取決于靶核酸的濃度，以及檢測(cè)共享相同引物對(duì)的基因座所引起的可能的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)。與現(xiàn)有技術(shù)的高階多路復(fù)用方法相比，本方法的優(yōu)點(diǎn)在于靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子的濃度可以在不同的測(cè)定中保持不變。這為測(cè)定設(shè)計(jì)提供了更大的自由度，并且可以高效地優(yōu)化熒光信號(hào)群體。在snp檢測(cè)中，將媒介探針與靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子相結(jié)合的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)發(fā)揮作用。在延伸過(guò)程中，優(yōu)選結(jié)合的媒介探針被聚合酶高度特異性地切割，其中媒介部分從探針部分切割。切割位點(diǎn)優(yōu)選位于媒介探針的探針部分的第一核苷酸和第二個(gè)核苷酸之間。只有正確進(jìn)行切割，釋放的媒介物才能完全結(jié)合到特異性靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子類型上的媒介物結(jié)合位點(diǎn)，從而啟動(dòng)信號(hào)產(chǎn)生。如果沒(méi)有發(fā)生正確的切割，則現(xiàn)有的3'突出部分將優(yōu)選阻礙靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子處的延伸過(guò)程，并且不會(huì)產(chǎn)生信號(hào)。因此，在snp檢測(cè)的情況下，第一核苷酸可以優(yōu)選位于媒介探針的靶特異性探針部分的5'端，而不是snp位置，以激活特異性靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子類型。

63、在另一方面，本發(fā)明涉及一種試劑盒，其包括：

64、-含有至少一種標(biāo)記的至少一種第一類型的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子，

65、-可選地，含有至少一種標(biāo)記的至少一種第二類型的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子，所述標(biāo)記優(yōu)選在與至少一種第一類型的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子相同的檢測(cè)通道或數(shù)據(jù)空間的相應(yīng)區(qū)域中發(fā)射信號(hào)；

66、-可選地，至少一種第一媒介探針，其媒介序列對(duì)至少一種第一類型的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子具有親和性，并且其寡核苷酸序列對(duì)第一核酸靶序列表現(xiàn)出親和性；

67、-可選地，至少一種第二媒介探針，其媒介序列對(duì)至少一種第二類型的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子具有親和性，并且其寡核苷酸序列對(duì)第二核酸靶序列表現(xiàn)出親和性；

68、-可選地，至少一種緩沖液；

69、-可選地，聚合酶；

70、-可選地，逆轉(zhuǎn)錄酶；

71、-可選地，至少一種pcr引物。

72、在一實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒適合于或配置用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法。

73、在實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以包括超過(guò)兩種不同類型的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子，并且可選地還包括多于第一和第二媒介探針，所述媒介探針的媒介序列對(duì)第一或第二或進(jìn)一步類型的各自的靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子具有親和性，并且其寡核苷酸序列相應(yīng)地分別對(duì)第一或第二或進(jìn)一步的核酸靶序列具有親和性，從而可以特異性地檢測(cè)超過(guò)兩種不同的核酸靶序列。

74、針對(duì)本發(fā)明的一個(gè)方面描述的實(shí)施方式也可以是本發(fā)明的任何其他方面的實(shí)施方式。因此，針對(duì)本發(fā)明的方法描述的實(shí)施方式也可以是本發(fā)明的試劑盒的實(shí)施方式。此外，本文描述的任何實(shí)施方式還可以包括本發(fā)明的任何其他實(shí)施方式的特征。本發(fā)明的各個(gè)方面統(tǒng)一于、受益于、基于和/或與本方法的意外有益效果的共同和令人驚訝的發(fā)現(xiàn)有關(guān)，即通過(guò)靶序列獨(dú)立性報(bào)告分子優(yōu)化同時(shí)使pcr檢測(cè)多個(gè)靶序列。