背景技術(shù)：

1、癌癥是一種以細(xì)胞不受控制的生長為特征的疾病。已經(jīng)嘗試了許多治療癌癥的方法，包括藥物和放射療法。最近的癌癥治療試圖利用人體自身的免疫細(xì)胞來攻擊癌細(xì)胞。一種有前景的方法是使用從患者身上提取的t細(xì)胞，并通過對(duì)t細(xì)胞進(jìn)行基因工程化來產(chǎn)生嵌合抗原受體或car，這種受體蛋白賦予t細(xì)胞新的靶向特定蛋白質(zhì)的能力。這些受體是嵌合的，因?yàn)樗鼈儗⒖乖Y(jié)合與t細(xì)胞激活功能結(jié)合到單個(gè)受體中。

2、使用car-t細(xì)胞的免疫療法是很有前景的，因?yàn)樾揎椀膖細(xì)胞有可能識(shí)別癌細(xì)胞，以便更有效地靶向和摧毀它們。

3、在利用car對(duì)t細(xì)胞進(jìn)行工程化后，將所得car-t細(xì)胞引入患者體內(nèi)以攻擊腫瘤細(xì)胞。car-t細(xì)胞可以源自患者自身血液中的t細(xì)胞(自體)或來自另一健康供體的t細(xì)胞(同種異體)。car-t細(xì)胞一旦注入患者體內(nèi)，它們就會(huì)與細(xì)胞上的靶向抗原接觸。car-t細(xì)胞與抗原結(jié)合并被激活?？乖Y(jié)合后，car?t細(xì)胞可以呈指數(shù)增殖，啟始腫瘤細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及靶腫瘤細(xì)胞的殺傷。

4、然而，基于car?t細(xì)胞的免疫療法仍然存在一些問題和局限性。一些car?t細(xì)胞可能與表達(dá)低水平靶抗原的正常細(xì)胞接合，導(dǎo)致脫靶毒性。因此，需要另外的療法來降低脫靶毒性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開總體上涉及增強(qiáng)表達(dá)car的免疫細(xì)胞的功能的系統(tǒng)和方法(例如，通過使用包含car和啟動(dòng)受體以及通過誘導(dǎo)組成型細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)來增強(qiáng)免疫細(xì)胞刺激的合成途徑激活因子(spa)的邏輯門)?？傊疚墓_的系統(tǒng)和方法提供了改進(jìn)的功效和對(duì)car免疫細(xì)胞的抗原特異性靶向。

2、在各種實(shí)施方案中，本文公開了一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含：包含啟動(dòng)受體的第一嵌合多肽；包含嵌合抗原受體(car)的第二嵌合多肽；和細(xì)胞因子。

3、在各種實(shí)施方案中，本文公開了一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含：包含啟動(dòng)受體的第一嵌合多肽；包含嵌合抗原受體(car)的第二嵌合多肽；和包含合成途徑激活因子(spa)的第三嵌合多肽。

4、在各種實(shí)施方案中，本文公開了一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含：包含啟動(dòng)受體的第一嵌合多肽；包含嵌合抗原受體(car)的第二嵌合多肽；包含合成途徑激活因子(spa)的第三嵌合多肽；和細(xì)胞因子。

5、在各種實(shí)施方案中，本文公開了一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含：(a)包含啟動(dòng)受體的第一嵌合多肽，(b)包含嵌合抗原受體(car)的第二嵌合多肽，(c)基因表達(dá)阻遏因子，和(d)(i)包含合成途徑激活因子(spa)的第三嵌合多肽和/或(ii)細(xì)胞因子之一或兩者。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)受體從n末端至c末端包含：第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；包含一個(gè)或多個(gè)配體誘導(dǎo)型蛋白水解裂解位點(diǎn)的第一跨膜結(jié)構(gòu)域；和包含人或人源化轉(zhuǎn)錄效應(yīng)物的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。

6、在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合至生殖細(xì)胞堿性磷酸酶(alpg/p)。在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含可變重(vh)鏈序列和可變輕(vl)鏈序列，所述可變重(vh)鏈序列包含三個(gè)重鏈cdr序列cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，所述可變輕(vl)鏈序列包含三個(gè)輕鏈cdr序列cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中：cdr-h1包含seq?id?no:1、39、40、41或42所示的序列，cdr-h2包含2、43、44、45或46所示的序列，cdr-h3包含seq?id?no:3、47或48所示的序列，cdr-l1包含seq?id?no:4、49或50所示的序列，cdr-l2包含seq?id?no:5或51所示的序列，并且cdr-l3包含seq?id?no:6或53所示的序列。在一些實(shí)施方案中，vh鏈序列包含seq?id?no:7所示的序列。在一些實(shí)施方案中，vl鏈序列包含seq?id?no:8所示的序列。在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含seq?idno:9所示的序列。在一些實(shí)施方案中，alpg/p與第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)配體誘導(dǎo)型蛋白水解裂解位點(diǎn)處的裂解。

7、在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)受體還包含定位于第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與第一跨膜結(jié)構(gòu)域之間的第一鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，第一鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含cd8α或截短的cd8α鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，第一鉸鏈包含如seq?id?no:18所示的序列。

8、在一些實(shí)施方案中，第一跨膜結(jié)構(gòu)域包含notch1跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，第一跨膜結(jié)構(gòu)域包含如seq?id?no:19所示的序列。

9、在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含hnf1a/p65結(jié)構(gòu)域或gal4/vp64結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no:23所示的序列。

10、在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)受體還包含在第一跨膜結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域之間的終止轉(zhuǎn)移序列。在一些實(shí)施方案中，終止轉(zhuǎn)移序列包含如seq?id?no:20所示的序列。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)受體包含如seq?id?no:24所示的序列。

11、在一些實(shí)施方案中，car從n末端到c末端包含：(a)第二細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(b)第二跨膜結(jié)構(gòu)域；(c)細(xì)胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域；和(d)細(xì)胞內(nèi)激活結(jié)構(gòu)域。

12、在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合至間皮素(msln)，并且第二細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含可變重(vh)鏈序列和可變輕(vl)鏈序列，所述可變重(vh)鏈序列包含三個(gè)重鏈cdr序列cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，所述可變輕(vl)鏈序列包含三個(gè)輕鏈cdr序列cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中：(a)cdr-h1包含seq?id?no:10、54、56、57或71所示的序列，(b)cdr-h2包含seq?id?no:11、58、59、60、61或308所示的序列，(c)cdr-h3包含seq?id?no:12、62或63所示的序列，(d)cdr-l1包含seq?id?no:14、64、65、66或67所示的序列，(e)cdr-l2包含seq?id?no:15、68、69或70所示的序列，并且(f)cdr-l3包含seq?idno:16或72所示的序列。在一些實(shí)施方案中，vh鏈序列包含seq?id?no:13所示的序列。在一些實(shí)施方案中，vl鏈序列包含seq?id?no:17所示的序列。在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含seq?id?no:30所示的氨基酸序列。

13、在一些實(shí)施方案中，car包含第二鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，第二鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含cd8α或截短的cd8α鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，第二跨膜結(jié)構(gòu)域包含cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域包含4-1bb結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)激活結(jié)構(gòu)域包含cd3ζ結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，car包含如seq?id?no:31或32所示的序列。

14、在一些實(shí)施方案中，spa是stat磷酸化、任選地stat1、stat3和/或stat5磷酸化的激活因子。在一些實(shí)施方案中，spa包含連接至細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含源自細(xì)胞因子受體的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含源自白細(xì)胞介素受體的多肽序列。

15、在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子受體包含白細(xì)胞介素6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子(il6st)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域?qū)⒔M成型活性傳遞至細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含二聚化區(qū)，任選地其中二聚化區(qū)包含半胱氨酸殘基和亮氨酸拉鏈中的至少一者。在一些實(shí)施方案中，二聚化區(qū)形成同源二聚體。

16、在一些實(shí)施方案中，spa包括亮氨酸拉鏈-gp130(l-gp130)。在一些實(shí)施方案中，spa包含與seq?id?no:74所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，spa包含seq?id?no:74的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，spa包含與seq?id?no:75所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，spa包含seq?id?no:75的氨基酸序列。

17、在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含源自細(xì)胞因子的多肽并且模擬受體激動(dòng)作用。在一些實(shí)施方案中，spa包括膜結(jié)合的白細(xì)胞介素15(mbil-15)。在一些實(shí)施方案中，spa包含與seq?id?no:76所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，spa包含seq?id?no:76的氨基酸序列。

18、在一些實(shí)施方案中，spa包括cd34-白細(xì)胞介素7受體(c7r)。在一些實(shí)施方案中，spa包含與seq?id?no:77所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，spa包含seq?id?no:77的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，spa包含與seq?id?no:78所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，spa包含seq?id?no:78的氨基酸序列。

19、在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是分泌的細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素(il)-2、super-2、il-12、il-12/23p40、il-7、il-15、il-21和il-18中的至少一者。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是il-2。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是super-2。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是il-12。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是il-12/23p40。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是il-7。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是il-15。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是il-21。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是il-18。

20、在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子包含非天然信號(hào)肽。在一些實(shí)施方案中，非天然信號(hào)肽包括來自以下至少一者的信號(hào)肽：cd44、cd3e、cd5、igtal、il-2、gmcsf、胰凝乳蛋白酶原、胰蛋白酶原、igk、igkviii、ige、osm、igg2h、bm40、secrecon和tpa。在一些實(shí)施方案中，非天然信號(hào)肽包含seq?id?no:100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128或130所示的氨基酸序列或由其組成。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子包含seq?idno:86、88、90、92、94、96、98或132所示的氨基酸序列。

21、在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)阻遏因子是sgrna或shrna。在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)阻遏因子是sgrna。在一些實(shí)施方案中，sgrna阻遏選自以下的基因的表達(dá)：ptpn2、rasa2、socs1、zc3h12a和cish。在一些實(shí)施方案中，sgrna阻遏ptpn2的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，sgrna阻遏rasa2的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，sgrna阻遏socs1的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，sgrna阻遏zc3h12a的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，sgrna阻遏cish的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，sgrna包含seq?id?no:160-164中任一者所示的核酸序列。

22、在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)阻遏因子是shrna。在一些實(shí)施方案中，shrna阻遏選自以下的基因的表達(dá)：rasa2、socs1、zc3h12a、tgfbr1和cish。在一些實(shí)施方案中，shrna阻遏rasa2的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，shrna阻遏socs1的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，shrna阻遏zc3h12a的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，shrna阻遏tgfbr1的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，shrna阻遏cish的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，shrna包含seq?id?no:165-172中任一者所示的核酸序列。

23、在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含兩種或更多種基因表達(dá)阻遏因子。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏tnfrsf6(fas)表達(dá)的shrna和另外的基因表達(dá)阻遏因子。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏tnfrsf6(fas)表達(dá)的shrna、阻遏tgfbr2表達(dá)的shrna和另外的基因表達(dá)阻遏因子。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏tnfrsf6(fas)表達(dá)的shrna、阻遏ptpn2表達(dá)的shrna和另外的基因表達(dá)阻遏因子。

24、在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏cish表達(dá)的sgrna以及為il-2的細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏ptpn2表達(dá)的sgrna以及為il-2的細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏rasa2表達(dá)的sgrna以及為il-2的細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏socs1表達(dá)的sgrna以及為il-2的細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏zc3h12a表達(dá)的sgrna以及為il-2的細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏rasa2表達(dá)的shrna以及為il-2的細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏ptpn2表達(dá)的sgrna以及為il-21的細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏zc3h12a表達(dá)的sgrna以及為il-21的細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏cish表達(dá)的sgrna以及為c7r的spa。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏ptpn2表達(dá)的sgrna以及為c7r的spa。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏rasa2表達(dá)的sgrna以及為c7r的spa。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏socs1表達(dá)的sgrna以及為c7r的spa。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏zc3h12a表達(dá)的sgrna以及為c7r的spa。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏cish表達(dá)的sgrna以及為l-gp130的spa。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏rasa2表達(dá)的sgrna以及為l-gp130的spa。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏zc3h12a表達(dá)的sgrna以及為l-gp130的spa。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏rasa2表達(dá)的shrna、為il-2的細(xì)胞因子以及為l-gp130的spa。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏rasa2表達(dá)的sgrna、為il-2的細(xì)胞因子以及為l-gp130的spa。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏rasa2表達(dá)的shrna、為il-15的細(xì)胞因子以及為l-gp130的spa。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)包含阻遏rasa2表達(dá)的sgrna、為il-15的細(xì)胞因子以及為l-gp130的spa。

25、在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)受體和car能夠結(jié)合至相同的靶細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是固體癌細(xì)胞或液體癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是卵巢癌、輸卵管癌、原發(fā)性腹膜癌、子宮癌、間皮瘤、宮頸癌或胰腺癌。

26、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種或多種重組核酸，所述重組核酸包含至少一個(gè)核酸片段，所述至少一個(gè)核酸片段包含編碼本文公開的系統(tǒng)的核苷酸序列。

27、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種或多種重組核酸，所述重組核酸包含至少一個(gè)核酸片段，所述至少一個(gè)核酸片段包含：編碼包含第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的啟動(dòng)受體的核苷酸序列；編碼包含第二細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的核苷酸序列；和編碼細(xì)胞因子的核苷酸序列。

28、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種或多種重組核酸，所述重組核酸包含至少一個(gè)核酸片段，所述至少一個(gè)核酸片段包含：編碼包含第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的啟動(dòng)受體的核苷酸序列；編碼包含第二細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的核苷酸序列；和編碼合成途徑激活因子的核苷酸序列。

29、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種或多種重組核酸，所述重組核酸包含至少一個(gè)核酸片段，所述至少一個(gè)核酸片段包含：編碼包含第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的啟動(dòng)受體的核苷酸序列；編碼包含第二細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的核苷酸序列；編碼合成途徑激活因子的核苷酸序列；和編碼細(xì)胞因子的核苷酸序列。

30、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種或多種重組核酸，所述重組核酸包含至少一個(gè)核酸片段，所述至少一個(gè)核酸片段包含：編碼包含第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的啟動(dòng)受體的核苷酸序列；編碼包含第二細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的核苷酸序列；基因表達(dá)阻遏因子的核苷酸序列；和以下之一或兩者：編碼合成途徑激活因子的核苷酸序列和/或編碼細(xì)胞因子的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合至alpg/p。在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合至msln。在一些實(shí)施方案中，重組核酸包含兩個(gè)或更多個(gè)核酸片段。

31、在一些實(shí)施方案中，重組核酸還包含可操作地連接至編碼car的核苷酸序列的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，重組核酸還包含可操作地連接至編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列的組成型啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，重組核酸還包含可操作地連接至編碼合成途徑激活因子的核苷酸序列的組成型啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)受體和合成途徑激活因子在相同組成型啟動(dòng)子的控制之下。在一些實(shí)施方案中，重組核酸還包含可操作地連接至編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以及可操作地連接至編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列和編碼合成途徑激活因子的核苷酸序列的組成型啟動(dòng)子。

32、在一些實(shí)施方案中，核酸在5’至3’方向上包含：組成型啟動(dòng)子；編碼合成途徑激活因子的核苷酸序列；編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；和編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，核酸在5’至3’方向上包含：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列；組成型啟動(dòng)子；編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列；和編碼合成途徑激活因子的核苷酸序列。

33、在一些實(shí)施方案中，重組核酸還包含可操作地連接至編碼細(xì)胞因子的核苷酸序列的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

34、在一些實(shí)施方案中，重組核酸還包含：(a)可操作地連接至編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列和編碼細(xì)胞因子的核苷酸序列的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；以及(b)可操作地連接至編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列的組成型啟動(dòng)子。

35、在一些實(shí)施方案中，核酸在5’至3’方向上包含：(a)組成型啟動(dòng)子；(b)編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列；(c)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；d)編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列；和(e)編碼細(xì)胞因子的核酸序列。

36、在一些實(shí)施方案中，核酸在5’至3’方向上包含：(a)組成型啟動(dòng)子；(b)編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列；(c)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；(d)編碼細(xì)胞因子的核苷酸序列；和(e)編碼嵌合抗原受體的核酸序列。

37、在一些實(shí)施方案中，核酸在5’至3’方向上包含：(a)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；(b)編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列；(c)編碼細(xì)胞因子的核酸序列；(d)組成型啟動(dòng)子；和(e)編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列。

38、在一些實(shí)施方案中，核酸在5’至3’方向上包含：(a)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；(b)編碼細(xì)胞因子的核苷酸序列；(c)編碼嵌合抗原受體的核酸序列；(d)組成型啟動(dòng)子；和(e)編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列。

39、在一些實(shí)施方案中，重組核酸還包含：(a)可操作地連接至編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列的第一誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；(b)可操作地連接至編碼細(xì)胞因子的核苷酸序列的第二誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；以及(c)可操作地連接至編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列的組成型啟動(dòng)子。

40、在一些實(shí)施方案中，核酸在5’至3’方向上包含：(a)組成型啟動(dòng)子；(b)編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列；(c)第一誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；(d)編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列；(e)第二誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；和(f)編碼細(xì)胞因子的核酸序列。

41、在一些實(shí)施方案中，核酸在5’至3’方向上包含：(a)組成型啟動(dòng)子；(b)編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列；(c)第二誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；(c)編碼細(xì)胞因子的核酸序列；(d)第一誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；和(e)編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列。

42、在一些實(shí)施方案中，核酸在5’至3’方向上包含：(a)第一誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；(b)編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列；(c)第二誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；(d)編碼細(xì)胞因子的核酸序列；(e)組成型啟動(dòng)子；和(f)編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列。

43、在一些實(shí)施方案中，核酸在5’至3’方向上包含：(a)第一誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；(b)編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列；(c)組成型啟動(dòng)子；(d)編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列；(e)第二誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；和(f)編碼細(xì)胞因子的核酸序列。

44、在一些實(shí)施方案中，核酸在5’至3’方向上包含：(a)第二誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；(b)編碼細(xì)胞因子的核酸序列；(c)第一誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；(d)編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列；(e)組成型啟動(dòng)子；和(f)編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列。

45、在一些實(shí)施方案中，核酸在5’至3’方向上包含：(a)第二誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；(b)編碼細(xì)胞因子的核酸序列；(c)組成型啟動(dòng)子；(d)編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列；(e)第一誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；和(f)編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列。

46、在一些實(shí)施方案中，第一誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和第二誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是相同的。

47、在一些實(shí)施方案中，編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列包含seq?id?no:35所示的序列。在一些實(shí)施方案中，編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列包含seq?id?no:36所示的序列。在一些實(shí)施方案中，編碼合成途徑激活因子的核苷酸序列包含seq?id?no:79、80、81、82或83所示的序列。在一些實(shí)施方案中，編碼細(xì)胞因子的核苷酸序列包含seq?id?no:87、89、91、93、95、97或99所示的序列。在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)阻遏因子包含seq?id?no:160-172中任一者所示的核酸序列。

48、在一些實(shí)施方案中，核酸在一些實(shí)施方案中，重組核酸還包含與宿主細(xì)胞染色體中的插入位點(diǎn)互補(bǔ)的5'同源定向修復(fù)臂和3'同源定向修復(fù)臂。在一些實(shí)施方案中，重組核酸還包含編碼自切除2a肽(p2a)的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，p2a處于編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列的3’端。在一些實(shí)施方案中，p2a處于編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列的3’端。

49、在一些實(shí)施方案中，重組核酸還包含土撥鼠肝炎病毒翻譯后調(diào)控元件(wpre)。在一些實(shí)施方案中，wpre處于編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列的3’端和編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列的5’端，或者其中所述wpre處于編碼啟動(dòng)受體的核苷酸序列的3’端和編碼嵌合抗原受體的核苷酸序列的5’端。在一些實(shí)施方案中，重組核酸還包含sv40多聚a元件。

50、在一些實(shí)施方案中，將核酸并入表達(dá)盒或表達(dá)載體中。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體是非病毒載體。

51、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了包含本文公開的重組核酸的表達(dá)載體。在一些實(shí)施方案中，重組核酸的5'端和3'端包含與原代細(xì)胞基因組中插入位點(diǎn)側(cè)翼的基因組序列同源的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，插入位點(diǎn)位于t細(xì)胞受體α恒定(trac)基因座或基因組安全港(gsh)基因座。

52、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種免疫細(xì)胞，所述免疫細(xì)胞包含：本文公開的系統(tǒng)；至少一種本文公開的重組核酸；和/或本文公開的載體。在一些實(shí)施方案中，所述免疫細(xì)胞是原代人免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是同種異體免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是自體免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述原代免疫細(xì)胞是自然殺傷(nk)細(xì)胞、t細(xì)胞、cd8+t細(xì)胞、cd4+t細(xì)胞、原代t細(xì)胞或t細(xì)胞祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述原代免疫細(xì)胞是原代t細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述原代免疫細(xì)胞是原代人t細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述原代免疫細(xì)胞是無病毒的。

53、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種原代免疫細(xì)胞，所述原代免疫細(xì)胞包含至少一種重組核酸，所述重組核酸包含：編碼包含第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的啟動(dòng)受體的核酸序列；編碼包含第二細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的核酸序列；編碼細(xì)胞因子和/或合成途徑激活因子的核酸序列；其中所述重組核酸插入原代免疫細(xì)胞的基因組的靶區(qū)中，其中所述原代免疫細(xì)胞不包含用于將重組核酸引入原代免疫細(xì)胞中的病毒載體。在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合至alpg/p。在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合至msln。

54、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了包含核糖核蛋白復(fù)合物(rnp)-重組核酸復(fù)合物的活的無病毒的原代細(xì)胞，其中所述rnp包含核酸酶結(jié)構(gòu)域和指導(dǎo)rna，其中重組核酸包含：編碼包含特異性地結(jié)合至alpg/p的第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的啟動(dòng)受體的核酸序列；編碼包含特異性地結(jié)合至msl的第二細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的核酸序列；編碼細(xì)胞因子和/或組成型激活細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的合成途徑激活因子的核酸序列；其中重組核酸的5’端和3’端包含與原代細(xì)胞的基因組中的插入位點(diǎn)側(cè)翼的基因組序列同源的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合至alpg/p。在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合至msln。

55、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了包含多個(gè)本文公開的免疫細(xì)胞的細(xì)胞群體。

56、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本文公開的免疫細(xì)胞或本文公開的細(xì)胞群體，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。

57、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本文公開的重組核酸或本文公開的載體，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。

58、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種編輯免疫細(xì)胞的方法，所述方法包括：提供核糖核蛋白(rnp)-重組核酸復(fù)合物，其中所述rnp包含核酸酶結(jié)構(gòu)域和指導(dǎo)rna，其中所述重組核酸包含本文公開的重組核酸，并且其中所述重組核酸的5'端和3'端包含與免疫細(xì)胞基因組中插入位點(diǎn)側(cè)翼的基因組序列同源的核苷酸序列；以非病毒方式將rnp-重組核酸復(fù)合物引入免疫細(xì)胞中，其中所述指導(dǎo)rna與原代免疫細(xì)胞基因組的靶區(qū)特異性地雜交，并且其中核酸酶結(jié)構(gòu)域使靶區(qū)裂解以產(chǎn)生在免疫細(xì)胞基因組中的插入位點(diǎn)；以及通過將如本文所公開的重組核酸插入免疫細(xì)胞基因組中的插入位點(diǎn)中來編輯免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，以非病毒方式引入包括電穿孔。

59、在一些實(shí)施方案中，所述核酸酶結(jié)構(gòu)域包含crispr相關(guān)核酸內(nèi)切酶(cas)，任選地是cas9核酸酶。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞的基因組的所述靶區(qū)是t細(xì)胞受體α恒定(trac)基因座或基因組安全港(gsh)基因座。在一些實(shí)施方案中，重組核酸是雙鏈重組核酸或單鏈重組核酸。在一些實(shí)施方案中，重組核酸是線狀重組核酸或環(huán)狀重組核酸，任選地其中所述環(huán)狀重組核酸是質(zhì)粒。

60、在一些實(shí)施方案中，所述免疫細(xì)胞是原代人免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是自體免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是同種異體免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述免疫細(xì)胞是自然殺傷(nk)細(xì)胞、t細(xì)胞、cd8+t細(xì)胞、cd4+t細(xì)胞、原代t細(xì)胞或t細(xì)胞祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是原代t細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是原代人t細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是無病毒的。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括從患者獲得免疫細(xì)胞以及在體外引入重組核酸。

61、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種治療受試者的疾病的方法，所述方法包括向受試者施用本文公開的免疫細(xì)胞或本文公開的原代細(xì)胞或本文公開的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述疾病是癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥是實(shí)體癌或液體癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是卵巢癌、輸卵管癌、原發(fā)性腹膜癌、子宮癌、間皮瘤、宮頸癌或胰腺癌。

62、在一些實(shí)施方案中，施用免疫細(xì)胞增強(qiáng)受試者的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答是適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答是先天免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答是增加的至少一種細(xì)胞因子或趨化因子的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種細(xì)胞因子或趨化因子是il-2或ifnγ。在一些實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答是增加的靶細(xì)胞溶解。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括與免疫細(xì)胞同時(shí)或在免疫細(xì)胞之后向所述受試者施用免疫療法。

63、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性的方法，所述方法包括：獲得包含本文公開的系統(tǒng)、本文公開的重組核酸和/或本文公開的載體的免疫細(xì)胞；以及使免疫細(xì)胞與表達(dá)alpg/p和msln的靶細(xì)胞接觸，其中啟動(dòng)受體與靶細(xì)胞上的alpg/p的結(jié)合誘導(dǎo)啟動(dòng)受體的激活和嵌合抗原受體的表達(dá)，其中嵌合抗原受體與靶細(xì)胞上的msln的結(jié)合調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，并且其中細(xì)胞因子和/或合成途徑激活因子也調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性。

64、在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)包括增強(qiáng)免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答是適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答是先天免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞活性是增加的至少一種細(xì)胞因子或趨化因子的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種細(xì)胞因子或趨化因子是il-2或ifnγ。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞活性是靶細(xì)胞溶解。

65、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含：(a)car、spa和細(xì)胞因子中的至少一者；(b)rasa2表達(dá)的阻遏因子。在一些實(shí)施方案中，spa包括亮氨酸拉鏈-gp130(l-gp130)。在一些實(shí)施方案中，spa包含與seq?id?no:74所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，spa包含seq?id?no:74的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，spa包含與seq?id?no:75所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，spa包含seq?id?no:75的氨基酸序列。

66、在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是il-2。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子包含seq?idno:86所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是il-15。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子包含seq?id?no:96所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，rasa2表達(dá)的阻遏因子是shrna或sgrna。在一些實(shí)施方案中，rasa2表達(dá)的阻遏因子是shrna。在一些實(shí)施方案中，shrna包含seq?id?no:165的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，rasa2表達(dá)的阻遏因子是sgrna。在一些實(shí)施方案中，sgrna包含seq?id?no:161的核酸序列。

67、在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)還包含阻遏tnfrsf6(fas)表達(dá)的shrna。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)還包含阻遏tgfbr2表達(dá)的shrna。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)還包含阻遏ptpn2表達(dá)的shrna。

68、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種或多種重組核酸，所述重組核酸包含至少一個(gè)核酸片段，所述至少一個(gè)核酸片段包含編碼本文公開的系統(tǒng)的核苷酸序列。

69、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了包含本文提供的重組核酸序列的表達(dá)載體。

70、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種工程化免疫細(xì)胞，所述工程化免疫細(xì)胞包含：本文公開的系統(tǒng)；本文公開的重組核酸序列；或本文公開的表達(dá)載體。

71、在工程化免疫細(xì)胞的多個(gè)實(shí)施方案中，本文還公開了一種改善方案，其包含：(a)car、spa和細(xì)胞因子中的至少一者；(b)rasa2表達(dá)的阻遏因子。在一些實(shí)施方案中，spa包括亮氨酸拉鏈-gp130(l-gp130)。在一些實(shí)施方案中，spa包含與seq?id?no:74所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，spa包含seq?id?no:74的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，spa包含與seq?id?no:75所示的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，spa包含seq?id?no:75的氨基酸序列。

72、在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子是il-2。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子包含seq?idno:86所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，rasa2表達(dá)的阻遏因子是shrna或sgrna。在一些實(shí)施方案中，rasa2表達(dá)的阻遏因子是shrna。在一些實(shí)施方案中，shrna包含seq?id?no:165的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，rasa2表達(dá)的阻遏因子是sgrna。在一些實(shí)施方案中，sgrna包含seq?id?no:161的核酸序列。

73、在一些實(shí)施方案中，工程化免疫細(xì)胞還包含阻遏tnfrsf6(fas)表達(dá)的shrna。在一些實(shí)施方案中，工程化免疫細(xì)胞還包含阻遏tgfbr2表達(dá)的shrna。在一些實(shí)施方案中，工程化免疫細(xì)胞還包含阻遏ptpn2表達(dá)的shrna。

74、在一些實(shí)施方案中，所述工程化免疫細(xì)胞是原代人免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，工程化免疫細(xì)胞是同種異體免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，工程化免疫細(xì)胞是自體免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述原代免疫細(xì)胞是自然殺傷(nk)細(xì)胞、t細(xì)胞、cd8+t細(xì)胞、cd4+t細(xì)胞、原代t細(xì)胞或t細(xì)胞祖細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述原代免疫細(xì)胞是原代t細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，其中所述原代免疫細(xì)胞是原代人t細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述原代免疫細(xì)胞是無病毒的。

75、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了包含多個(gè)本文公開的工程化免疫細(xì)胞的細(xì)胞群體。

76、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本文公開的工程化免疫細(xì)胞或本文公開的群體，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。

77、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種治療受試者的疾病的方法，所述方法包括向受試者施用本文公開的工程化免疫細(xì)胞或本文公開的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述疾病是癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥是實(shí)體癌或液體癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是卵巢癌、輸卵管癌、原發(fā)性腹膜癌、子宮癌、間皮瘤、宮頸癌或胰腺癌。在一些實(shí)施方案中，施用工程化免疫細(xì)胞增強(qiáng)受試者的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答是適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答是先天免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答是增加的至少一種細(xì)胞因子或趨化因子的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種細(xì)胞因子或趨化因子是il-2或ifnγ。在一些實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答是增加的靶細(xì)胞溶解。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括與工程化免疫細(xì)胞同時(shí)或在工程化免疫細(xì)胞之后向所述受試者施用免疫療法。

78、在各種實(shí)施方案中，本文還公開了一種抑制受試者中的靶細(xì)胞的方法，所述方法包括向受試者施用本文公開的工程化免疫細(xì)胞或本文公開的藥物組合物，其中工程化免疫細(xì)胞抑制靶細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是癌細(xì)胞。