本發(fā)明涉及一種抑制性神經(jīng)元特異性啟動子。

背景技術(shù)：

1、抑制性神經(jīng)元的功能異常或者腦內(nèi)的興奮與抑制的平衡異常與癲癇、自閉癥、精神分裂癥等的發(fā)病密切相關(guān)。這些功能異?；蚱胶猱惓Ｓ锌赡芡ㄟ^向抑制性神經(jīng)元導(dǎo)入治療用基因進行功能調(diào)整來治療。

2、近年來，腺相關(guān)病毒(以下為aav)載體廣泛用于對生物體的基因表達研究，對如神經(jīng)元那樣的非分裂細(xì)胞的長期的基因表達也有用。然而，aav在病毒中也是最小級別的病毒，能在aav載體包裝的基因尺寸是包含兩端的反向末端重復(fù)(itr)序列在內(nèi)的短至約5.0kb的基因尺寸。因此，難點在于能插入至aav載體的基因的大小、數(shù)量存在限制。

3、迄今為止，報道了搭載于aav載體而能使前腦的抑制性神經(jīng)元特異性的外來基因表達的distal－less?homeobox(dlx)基因增強子序列(在與配置于下游的最小啟動子(minimal?promoter)的組合中發(fā)揮作用)(非專利文獻1)。

4、本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)：編碼小鼠基因組的谷氨酸脫羧酶(gad)65的gad2基因外顯子1的上游2.5kb作為抑制性神經(jīng)元特異性啟動子發(fā)揮作用(mgad65啟動子)(非專利文獻2)。

5、此外，發(fā)現(xiàn)：源自小鼠的dlx增強子(mdlx增強子)通過與最小啟動子組合而抑制性神經(jīng)元特異性地具有啟動子活性，但僅在大腦區(qū)域(前腦)具有啟動子活性，與此相對，mgad65啟動子在全腦具有啟動子活性(非專利文獻2)。與mdlx增強子+最小啟動子相比，mgad65啟動子在大腦區(qū)域內(nèi)的啟動子活性為相同程度，但在對抑制性神經(jīng)元的特異性和效率的方面優(yōu)異。

6、另一方面，在長度方面，mdlx增強子+最小啟動子短至約0.7kb，與此相對，mgad65啟動子長至約2.5kb，占aav載體的包裝極限的約一半，缺點在于aav載體的有用性損失較大。

7、現(xiàn)有技術(shù)文獻

8、非專利文獻

9、非專利文獻1：nat?neurosci.，2016；19(12)：1743－1749

10、非專利文獻2：mol?brain.，2021；14(1)：33

11、非專利文獻3：nat?biotechnol.，2016；34(2)：204－209

12、非專利文獻4：j?comp?neurol.，2018；526(3)：373－396

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明所要解決的問題

2、本發(fā)明的技術(shù)問題在于，得到一種抑制性神經(jīng)元特異性啟動子序列，其與mgad65啟動子相比長度短，但啟動子活性、對抑制性神經(jīng)元的特異性以及基因表達效率均不損失。

3、用于解決問題的方案

4、為了解決上述技術(shù)問題進行了深入研究。在研究中，首先，以非專利文獻2中記載的mgad65啟動子為參考，克隆了mgad65啟動子和mgad67啟動子的基因組區(qū)域。接著，制作mgad65啟動子和mgad67啟動子各自的各種區(qū)域的缺失構(gòu)建體，制作在各自的啟動子序列控制下表達綠色熒光蛋白(gfp)的跨血腦屏障(bbb)型aav(aav－php.eb)載體。將得到的aav載體投給至小鼠的靜脈內(nèi)，3周后分析gfp的表達水平、對抑制性神經(jīng)元的表達特性。

5、在mgad65啟動子區(qū)域中，著眼于作為轉(zhuǎn)錄激活因子的dlx1和dlx2所結(jié)合的部位。dlx1和dlx2與gad啟動子直接結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄。由于報告為dlx1和dlx2結(jié)合的gad啟動子區(qū)域為region?i和region?ii(以下也分別稱為ri、rii)，因此保留這兩個區(qū)域，將除此以外的區(qū)域從mgad65啟動子中刪除，或保留ri、rii中的任一者，對除此以外的區(qū)域施加缺失處理。發(fā)現(xiàn)除了該缺失處理以外，為了較高地維持啟動子活性，特別重要的是包含在原始的mgad65啟動子中不存在的、編碼gad67的gad1基因或編碼gad65的gad2基因中的、從外顯子1的5’末端至轉(zhuǎn)錄起始位點(transcription?start?site：以下，也稱為tss)的區(qū)域(以下，也稱為etss區(qū)域)的堿基序列作為啟動子。

6、即，本發(fā)明如下所述。

7、[1]一種啟動子，其由具有啟動子活性的dna構(gòu)成，所述dna包含：谷氨酸脫羧酶(gad)啟動子中的、dlx1結(jié)合部位和/或dlx2結(jié)合部位的堿基序列；以及谷氨酸脫羧酶(gad)中的、從外顯子1的5’末端至轉(zhuǎn)錄起始位點(tss)的區(qū)域(etss區(qū)域)的堿基序列。

8、[2]根據(jù)[1]所述的啟動子，其中，所述谷氨酸脫羧酶(gad)啟動子為源自小鼠的gad65啟動子(mgad65啟動子)，所述谷氨酸脫羧酶(gad)為源自小鼠的谷氨酸脫羧酶65(mgad65)，所述dlx1結(jié)合部位和/或dlx2結(jié)合部位的堿基序列包含選自序列號1所示的mgad65啟動子的region?i的堿基序列、序列號2所示的mgad65啟動子的region?ii的堿基序列、以及與它們中的任一者所示的堿基序列90％以上相同的堿基序列中的至少一個堿基序列，以及所述mgad65中的、從外顯子1的5’末端至轉(zhuǎn)錄起始位點(tss)的區(qū)域(etss區(qū)域)的堿基序列為序列號3所示的堿基序列、或與該堿基序列90％以上相同的堿基序列所示的堿基序列。

9、[3]根據(jù)[1]或[2]所述的啟動子，其中，包含序列號4～6中的任一者所示的堿基序列、或包含具有與序列號4～6中的任一者所示的堿基序列90％以上相同的序列的堿基序列。

10、[4]根據(jù)[1]所述的啟動子，其中，所述谷氨酸脫羧酶(gad)啟動子為源自小鼠的gad67啟動子(mgad67啟動子)，所述谷氨酸脫羧酶(gad)為源自小鼠的谷氨酸脫羧酶67(mgad67)，所述dlx1結(jié)合部位和/或dlx2結(jié)合部位的堿基序列包含選自序列號7所示的mgad67啟動子的region?i的堿基序列、序列號8所示的mgad67啟動子的region?ii的堿基序列、以及與它們中的任一者所示的堿基序列90％以上相同的堿基序列中的至少一個堿基序列，以及所述mgad67中的、從外顯子1的5’末端至轉(zhuǎn)錄起始位點(tss)的區(qū)域(etss區(qū)域)的堿基序列為序列號9所示的堿基序列、或與該堿基序列90％以上相同的堿基序列所示的堿基序列。

11、[5]根據(jù)[1]或[4]所述的啟動子，其中，包含序列號10～12中的任一者所示的堿基序列、或包含具有與序列號10～12中的任一者所示的堿基序列90％以上相同的序列的堿基序列。

12、[6]一種抑制性神經(jīng)元的基因表達用的腺相關(guān)病毒載體或由該腺相關(guān)病毒載體得到的重組病毒，其包含如[1]～[5]中任一項所述的啟動子。

13、[7]根據(jù)[6]所述的腺相關(guān)病毒載體或由該腺相關(guān)病毒載體得到的重組病毒，其中，還包含在所述啟動子的控制下配置的目標(biāo)基因。

14、[8]一種醫(yī)藥，其包含如[7]所述的腺相關(guān)病毒載體或由該腺相關(guān)病毒載體得到的重組病毒。

15、[9]根據(jù)[8]所述的醫(yī)藥，其中，所述醫(yī)藥用于由抑制性神經(jīng)元的功能異常或興奮與抑制的平衡異常產(chǎn)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。

16、[10]一種向細(xì)胞導(dǎo)入基因的方法，其包括如下工序：在體外，使用如[7]所述的腺相關(guān)病毒載體或由該腺相關(guān)病毒載體得到的重組病毒，將目標(biāo)基因?qū)胫聊繕?biāo)細(xì)胞。

17、[11]根據(jù)[10]所述的方法，其中，所述目標(biāo)細(xì)胞為抑制性神經(jīng)元。

18、[12]一種由抑制性神經(jīng)元的功能異?；蚺d奮與抑制的平衡異常產(chǎn)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方法，其包括：將如[7]所述的腺相關(guān)病毒載體或由該腺相關(guān)病毒載體得到的重組病毒投給至需要該腺相關(guān)病毒載體的對象。

19、[13]根據(jù)[7]所述的腺相關(guān)病毒載體或由該腺相關(guān)病毒載體得到的重組病毒，其中，所述腺相關(guān)病毒載體或由該腺相關(guān)病毒載體得到的重組病毒用于在由抑制性神經(jīng)元的功能異常或興奮與抑制的平衡異常產(chǎn)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中。

20、[14]一種如[7]所述的腺相關(guān)病毒載體或由該腺相關(guān)病毒載體得到的重組病毒的、在用于由抑制性神經(jīng)元的功能異常或興奮與抑制的平衡異常產(chǎn)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療的醫(yī)藥制造中的用途。

21、發(fā)明效果

22、在以往的mgad65啟動子(約2.5kb)中，占aav載體的包裝極限的約一半是很大的問題，但根據(jù)本發(fā)明能提供一種經(jīng)短鏈化的mgad65啟動子和mgad67啟動子。特別是compactmgad65(也稱為cmgad65、mgad65(rii－etss))啟動子和compact?mgad67(也稱為cmgad67、mgad67(rii－etss))啟動子都成功大幅短鏈化為0.5kb以下。而且，通過使用搭載有本發(fā)明的啟動子的aav載體，能在維持對抑制性神經(jīng)元的特異性和基因表達效率的狀態(tài)下，與以往的mgad65啟動子相同程度或更強力地使中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)整體的抑制性神經(jīng)元表達目標(biāo)基因。