本發(fā)明屬于細胞，具體涉及一種人源卵黃囊瘤ctc細胞株及其應用。

背景技術：

1、惡性腫瘤是人類健康的主要威脅之一。絕大多數(shù)腫瘤相關的死亡是由腫瘤的復發(fā)和轉移導致的。然而腫瘤轉移的機制尚不完全清楚。揭示腫瘤復發(fā)和轉移的機制，對開發(fā)新的診斷和治療方法至關重要。實體腫瘤會持續(xù)脫落腫瘤細胞，部分脫落的細胞能進入血液循環(huán)系統(tǒng)，被稱為循環(huán)腫瘤細胞。循環(huán)腫瘤細胞是惡性腫瘤經(jīng)血液轉移的關鍵媒介。如果能確定循環(huán)腫瘤細胞的特異性標記和生物學特性，則有望建立新的腫瘤轉移風險診斷方法，甚至開發(fā)特異性藥物降低腫瘤轉移的發(fā)生幾率。

2、但是，循環(huán)腫瘤細胞(ctc)數(shù)量非常少。絕大多數(shù)腫瘤患者每10ml外周血中的循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量少于10個。而同樣體積的外周血卻包含了數(shù)千萬的血液細胞，給循環(huán)腫瘤細胞的提取和研究帶來了較大的困難。由于循環(huán)腫瘤細胞與其原位的實體瘤細胞功能和表型不盡相同。循環(huán)腫瘤細胞發(fā)生了包括上皮-間質轉變在內(nèi)的一系列變化，使其能適應無錨定生長和血液流動形成的剪切力。不僅如此，研究表明循環(huán)腫瘤細胞的表型存在異質性和動態(tài)變化。這給研究循環(huán)腫瘤細胞帶來了更大的困難。

3、因此，開發(fā)一種穩(wěn)定的循環(huán)腫瘤細胞系以及建立體外培養(yǎng)方法，將對推動腫瘤轉移和治療的研究起到巨大的幫助。

技術實現(xiàn)思路

1、為了解決上述至少一個問題，本公開提供了一種人源卵黃囊瘤循環(huán)腫瘤(ctc)細胞株、富集和培養(yǎng)方法及其應用。

2、根據(jù)本公開的第一方面，提供了一種人源卵黃囊瘤ctc細胞株，所述細胞株為細胞角蛋白pan-ck陽性和婆羅雙樹樣基因sall4表達陽性。

3、在一些實施方式中，所述的人源卵黃囊瘤ctc細胞株于2023年12月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno:45758。

4、在一些實施方式中，所述的人源卵黃囊瘤ctc細胞株dapi染色陽性和cd45陰性。

5、根據(jù)本公開的第二方面，提供了一種人源卵黃囊瘤ctc細胞株的富集和培養(yǎng)方法，所述方法包括如下步驟：

6、1)采集卵黃囊瘤樣本；

7、2)從所述樣本富集卵黃囊瘤ctc細胞；

8、3)使用第一培養(yǎng)基，重懸富集到的所述卵黃囊瘤ctc細胞并進行培養(yǎng)，獲得第一培養(yǎng)產(chǎn)物，其中所述第一培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基和5v/v％～20v/v％的血清；和

9、4)使用第二培養(yǎng)基替換第一培養(yǎng)基進行維持培養(yǎng)，獲得第二培養(yǎng)產(chǎn)物，其中所述第二培養(yǎng)基包括基礎培養(yǎng)基和5v/v％～20v/v％的血清替代物。

10、在一些實施方式中，所述步驟1)中的所述樣本包括體液或其衍生物。

11、在一些實施方式中，所述步驟1)中的所述樣本選自血液、血漿、淋巴、唾液、尿液、汗液或腹水中的一種或多種。

12、在一些實施方式中，所述步驟1)中的所述樣本是腹水。

13、在一些實施方式中，所述富集可以采用本領域已知的方式來進行。例如，可以采用基于細胞密度的離心法、基于細胞體積大小的濾膜過濾法、靶向循環(huán)腫瘤細胞的磁珠，或者采用微流控技術來富集所述樣本中的循環(huán)腫瘤細胞。

14、在一些實施方式中，所述基礎培養(yǎng)基可以選自m199培養(yǎng)基、dmem/f12培養(yǎng)基、imdm培養(yǎng)基、dmem培養(yǎng)基、高糖dmem培養(yǎng)基或knockout-dmem培養(yǎng)基。

15、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基包含高糖dmem培養(yǎng)基。

16、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基包含5v/v％、6v/v％、7v/v％、8v/v％、9v/v％、10v/v％、11v/v％、12v/v％、13v/v％、14v/v％、15v/v％、16v/v％、17v/v％、18v/v％、19v/v％或20v/v％的胎牛血清。

17、在一些實施方式中，所述第二培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基包含knockout-dmem培養(yǎng)基。

18、在一些實施方式中，所述第二培養(yǎng)基可以包含knockouttm血清替代物，例如包含5v/v％、6v/v％、7v/v％、8v/v％、9v/v％、10v/v％、11v/v％、12v/v％、13v/v％、14v/v％、15v/v％、16v/v％、17v/v％、18v/v％、19v/v％或20v/v％的knockouttm血清替代物。

19、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基還包含生長因子。

20、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基還包含以下生長因子中的一種或多種：表皮生長因子(egf)、神經(jīng)生長因子(ngf)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)、成纖維細胞生長因子(fgf)、干細胞因子(scf)、胰島素樣生長因子(igf)、轉化生長因子-β(tgf-β)中的一種或多種。

21、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基包含10～50ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子。

22、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基可以包含10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、26ng/ml、27ng/ml、28ng/ml、29ng/ml、30ng/ml、31ng/ml、32ng/ml、33ng/ml、34ng/ml、35ng/ml、36ng/ml、37ng/ml、38ng/ml、39ng/ml、40ng/ml、41ng/ml、42ng/ml、43ng/ml、44ng/ml、45ng/ml、46ng/ml、47ng/ml、48ng/ml、49ng/ml或50ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子。

23、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基包含10～50ng/ml的表皮生長因子。

24、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基可以包含10ng/ml、11ng/ml、12ng/ml、13ng/ml、14ng/ml、15ng/ml、16ng/ml、17ng/ml、18ng/ml、19ng/ml、20ng/ml、21ng/ml、22ng/ml、23ng/ml、24ng/ml、25ng/ml、26ng/ml、27ng/ml、28ng/ml、29ng/ml、30ng/ml、31ng/ml、32ng/ml、33ng/ml、34ng/ml、35ng/ml、36ng/ml、37ng/ml、38ng/ml、39ng/ml、40ng/ml、41ng/ml、42ng/ml、43ng/ml、44ng/ml、45ng/ml、46ng/ml、47ng/ml、48ng/ml、49ng/ml或50ng/ml的表皮生長因子。

25、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基還可以包含抗生素，例如可以包含0v/v％～5v/v％的青霉素-鏈霉素。

26、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基含有0v/v％、1v/v％、2v/v％、3v/v％、4v/v％或5v/v％的青霉素-鏈霉素混合液。

27、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基還可以包含小分子添加劑，例如丙酮酸鈉、內(nèi)皮素-1、轉鐵蛋白、膽固醇等。

28、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基還可以包含0.1mm～10mm的丙酮酸鈉。

29、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基還可以包含0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3mm、3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、3.5mm、3.6mm、3.7mm、3.8mm、3.9mm、4mm、4.1mm、4.2mm、4.3mm、4.4mm、4.5mm、4.6mm、4.7mm、4.8mm、4.9mm、5mm、5.1mm、5.2mm、5.3mm、5.4mm、5.5mm、5.6mm、5.7mm、5.8mm、5.9mm、6mm、6.1mm、6.2mm、6.3mm、6.4mm、6.5mm、6.6mm、6.7mm、6.8mm、6.9mm、7mm、7.1mm、7.2mm、7.3mm、7.4mm、7.5mm、7.6mm、7.7mm、7.8mm、7.9mm、8mm、8.1mm、8.2mm、8.3mm、8.4mm、8.5mm、8.6mm、8.7mm、8.8mm、8.9mm、9mm、9.1mm、9.2mm、9.3mm、9.4mm、9.5mm、9.6mm、9.7mm、9.8mm、9.9mm或10mm的丙酮酸鈉。

30、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基還可以包含1mm的丙酮酸鈉。

31、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基還可以包含氨基酸。示例性的氨基酸包括：必需氨基酸，如，例如，苯丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、色氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、賴氨酸和組氨酸；以及其他氨基酸，例如，精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸。

32、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基還可以包含0.1mm～10mm的谷氨酰胺。

33、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基還可以包含0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3mm、3.1mm、3.2mm、3.3mm、3.4mm、3.5mm、3.6mm、3.7mm、3.8mm、3.9mm、4mm、4.1mm、4.2mm、4.3mm、4.4mm、4.5mm、4.6mm、4.7mm、4.8mm、4.9mm、5mm、5.1mm、5.2mm、5.3mm、5.4mm、5.5mm、5.6mm、5.7mm、5.8mm、5.9mm、6mm、6.1mm、6.2mm、6.3mm、6.4mm、6.5mm、6.6mm、6.7mm、6.8mm、6.9mm、7mm、7.1mm、7.2mm、7.3mm、7.4mm、7.5mm、7.6mm、7.7mm、7.8mm、7.9mm、8mm、8.1mm、8.2mm、8.3mm、8.4mm、8.5mm、8.6mm、8.7mm、8.8mm、8.9mm、9mm、9.1mm、9.2mm、9.3mm、9.4mm、9.5mm、9.6mm、9.7mm、9.8mm、9.9mm或10mm的谷氨酰胺。

34、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基和/或所述第二培養(yǎng)基還可以包含1mm的谷氨酰胺。

35、在一些實施方式中，所述血清包括胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、人血清、馬血清、豬血清、兔血清、山羊血清或兔血清。

36、在一些實施方式中，所述血清為胎牛血清。

37、在一些實施方式中，所述血清替代物包括knockouttm血清替代物、n2或b27。

38、在一些實施方式中，所述血清替代物為knockouttm血清替代物。

39、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基可以包含：h-dmem培養(yǎng)基、5v/v％～20v/v％fbs、10～50ng/ml?fgf、10～50ng/ml?egf、0.1～10mm丙酮酸鈉、0.1～10mm?l-谷氨酰胺和0v/v％～5v/v％的青霉素-鏈霉素混合液。

40、在一些實施方式中，所述第一培養(yǎng)基可以包含：h-dmem培養(yǎng)基、10v/v％fbs、20ng/ml?fgf、20ng/ml?egf、1mm丙酮酸鈉、1mm?l-谷氨酰胺和2v/v％的青霉素-鏈霉素混合液。

41、在一些實施方式中，所述第二培養(yǎng)基可以包含：knockout-dmem培養(yǎng)基、5v/v％～20v/v％knockouttm血清替代物(ksr)、10～50ng/ml?fgf、10～50ng/ml?egf、0.1～10mm丙酮酸鈉和0.1～10mm?l-谷氨酰胺。

42、在一些實施方式中，所述第二培養(yǎng)基可以包含：knockout-dmem培養(yǎng)基、10％knockouttm血清替代物(ksr)、20ng/ml?fgf、20ng/ml?egf、1mm丙酮酸鈉和1mm?l-谷氨酰胺。

43、在一些實施方式中，所述步驟3)中，培養(yǎng)時間為10～36h。

44、在一些實施方式中，所述方法的所述步驟3)中，培養(yǎng)時間為10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、31h、32h、33h、34h、35h或36h。

45、在一些實施方式中，所述方法的所述步驟3)中，培養(yǎng)時間為24h。

46、在一些實施方式中，所述方法的所述步驟3)中，使用所述第一培養(yǎng)基培養(yǎng)10～36h后，將所述第一培養(yǎng)基替換成所述第二培養(yǎng)基，進行維持培養(yǎng)。

47、在一些實施方式中，本公開使用的培養(yǎng)基是經(jīng)過過濾除菌的，例如可以使用0.22μm孔徑的過濾器過濾除菌。

48、在一些實施方式中，所述方法還包括以下步驟：

49、5)所述第二培養(yǎng)產(chǎn)物經(jīng)胰蛋白酶消化處理之后，使用所述第一培養(yǎng)基重懸并進行培養(yǎng)；

50、6)使用所述第二培養(yǎng)基替換所述第一培養(yǎng)基進行維持培養(yǎng)；

51、7)任選地，重復步驟5)和6)。

52、在一些實施方式中，所述方法還包括以下步驟：

53、8)細胞凍存：細胞培養(yǎng)后顯微鏡下觀察，細胞長滿2/3瓶后使用胰蛋白酶-edta(0.25％)消化，離心(120g/25℃/5min)后棄上清，加入適量cryostor?cs10細胞凍存液，分裝到1ml凍存管，凍存管放置在梯度降溫盒中，在-80℃冰箱過夜后，放入液氮中保存；

54、細胞復蘇：將存放在液氮中的凍存管取出，在37℃水浴鍋中解凍，向凍存管中添加1ml第一培養(yǎng)基，離心(120g/25℃/5min)后棄上清，重懸細胞液，加至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

55、在一些實施方式中，在使用所述第一培養(yǎng)基培養(yǎng)10～36小時后將所述第一培養(yǎng)基替換成所述第二培養(yǎng)基，進行維持培養(yǎng)。

56、在一些實施方式中，在步驟5)中，培養(yǎng)10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、24小時、25小時、26小時、27小時、28小時、29小時、30小時、31小時、32小時、33小時、34小時、35小時或36小時，然后將所述第一培養(yǎng)基替換成所述第二培養(yǎng)基，進行維持培養(yǎng)。

57、根據(jù)本公開的第三方面，提供了第一方面所述的人源卵黃囊瘤ctc細胞株在建立循環(huán)腫瘤細胞分離培養(yǎng)體系中的應用。

58、根據(jù)本公開的第四方面，提供了第一方面所述的人源卵黃囊瘤ctc細胞株在卵巢卵黃囊瘤的病因學、轉移機制、藥物篩選、耐藥機理及臨床干預研究平臺中的應用。

59、本公開所提供的的人源卵黃囊瘤ctc細胞株數(shù)量巨大，能夠穩(wěn)定傳代，且便于保存、擴增。填補了卵巢卵黃囊瘤沒有循環(huán)腫瘤細胞系的空白，該細胞系為深入研究循環(huán)腫瘤細胞的自然發(fā)生過程，查找新的循環(huán)腫瘤細胞標記和藥物提供了有力的工具。