本發(fā)明屬于生物傳感器，構(gòu)建了一種基于dnazyme激活的crispr/cas12a系統(tǒng)用于超靈敏檢測沙門氏菌新型生物傳感策略。

背景技術：

1、食源性致病菌可能污染從農(nóng)田到餐桌供應鏈的任何環(huán)節(jié)，對公眾健康安全造成了嚴重威脅，沙門氏菌作為引起食物中毒和食源性疾病爆發(fā)最常見病原體之一，感染的臨床全身性疾病包括菌血癥、發(fā)熱、嘔吐、8-12小時內(nèi)嚴重腹瀉和腹部痙攣等，因此，建立一種快速靈敏的沙門氏菌檢測方法，對于有效保護廣大人群，預防公共衛(wèi)生災害具有重要意義。

2、常規(guī)的細菌檢測方法有細菌培養(yǎng)法、pcr、elisa等，這些方法卻需要受過高度訓練的人員和專門的分析設備，而且非常耗時，檢測過程復雜。適配體作為一種檢測致病菌的前沿工具，近年來受到了廣泛關注。目前已經(jīng)建立了多種基于適配體的檢測方法，主要有熒光、比色和電化學等。為了提高檢測的靈敏度和特異性、作為一種革命性的基因編輯技術，crispr/cas系統(tǒng)受到廣泛關注，近年來將等溫核酸擴增技術與crispr/cas相結(jié)合的方法被開發(fā)出來?？紤]到crispr/cas12a系統(tǒng)與等溫核酸擴增技術結(jié)合所表現(xiàn)出的優(yōu)越的切割活性，構(gòu)建一個基于crispr/cas12a系統(tǒng)的生物傳感器用于沙門氏菌的檢測是值得探究的。

技術實現(xiàn)思路

1、為了提供一種靈敏度更高的沙門氏菌檢測系統(tǒng)，本發(fā)明提供了一種基于crispr/cas12a檢測沙門氏菌的生物傳感器，操作簡單、靈敏度高、檢測限低、特異性好。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案。

3、一種用于沙門氏菌( salmonella?typhimurium)的生物傳感器，包括：

4、復合結(jié)構(gòu)apt-t，復合結(jié)構(gòu)crrna-blocker，crispr/cas12a蛋白，報告探針fq鏈，底物鏈s，mg2+；

5、所述復合結(jié)構(gòu)apt-t由適配體（apt）和dnazyme鏈（t）互補配對形成；

6、所述復合結(jié)構(gòu)crrna-blocker由crrna和blocker鏈互補配對形成；

7、所述適配體、dnazyme鏈、crrna、blocker鏈、底物鏈s的核苷酸序列分別如seq?idno:1-5所示；

8、所述blocker鏈的第17位為核糖核苷酸；

9、報告探針fq的核苷酸序列為ttatt，5’端修飾熒光基團且3’段修飾熒光猝滅基團。優(yōu)選的，所述熒光基團為fam，熒光猝滅基團為bhq。

10、本發(fā)明還提供了一種包含上述生物傳感器的試劑盒。

11、所述試劑盒還包括沙門氏菌標準品或/和緩沖液。

12、本發(fā)明還提供了一種采用上述生物傳感器或試劑盒檢測沙門氏菌的方法，包括以下步驟：

13、（1）構(gòu)建復合結(jié)構(gòu)apt-t；

14、（2）構(gòu)建復合結(jié)構(gòu)crrna-blocker；

15、（3）將待測溶液和復合結(jié)構(gòu)apt-t，復合結(jié)構(gòu)crrna-blocker，crispr/cas12a蛋白，報告探針fq鏈，底物鏈s在含mg2+的緩沖液中混合孵育；

16、（4）將孵育液進行熒光檢測。

17、上述方法中，步驟（3）還包括制備系列濃度的沙門氏菌懸液，系列濃度的沙門氏菌懸液和復合結(jié)構(gòu)apt-t，復合結(jié)構(gòu)crrna-blocker，crispr/cas12a蛋白，報告探針fq鏈，底物鏈s在含mg2+的緩沖液中混合孵育的步驟。步驟（4）中還包括將系列濃度沙門氏菌懸液作濃度對數(shù)和熒光值回歸方程，并計算待測溶液中沙門氏菌濃度的步驟。

18、所述含mg2+的緩沖液選自nebuffer?2.1反應緩沖液或nebuffer?r2.1反應緩沖液。

19、所述復合結(jié)構(gòu)crrna-blocker采用以下方法制備：等摩爾比的適配體和dnazyme鏈熱變性后室溫退火獲得。

20、所述復合結(jié)構(gòu)apt-t采用以下方法制備：等摩爾比的crrna和blocker鏈熱變性后室溫退火獲得。

21、本發(fā)明的檢測原理如圖1所示，首先，利用dnazyme序列設計了一條能夠封閉沙門氏菌適配體的dna鏈t，t鏈與適配體（apt）形成復合結(jié)構(gòu)apt-t。其次，設計了一條帶有金屬激活dnazyme切割位點ra的blocker鏈，與crrna形成復合結(jié)構(gòu)crrna-blocker。其中各核酸元件的序列如下：

22、所述沙門氏菌的適配體apt的序列為：

23、5’-agtaatgcccggtagttattcaaag?atgagtaggaaaagagggct-3’；

24、所述dnazyme鏈t的序列為：

25、5’-ccacctccgagccggtcgaaagccctctt?ttccaa?aacgggcattact-3’；

26、所述crrna的序列為：

27、5’-uaauuucuacua?aguguagaucuaugauaacuaaga?auaua-3’；

28、所述blocker鏈的序列為：

29、5’-catagatctacgggct(ra)gggtggacttag?tagaaa-3’；

30、所述底物鏈s的序列為：

31、5’-tatattcttagttatcatag-3’；

32、所述報告探針fq的序列為：

33、5’-fam-ttatt-bhq-3’。

34、在傳感器中，適配體apt和dnazyme鏈通過堿基互補配對形成apt-t，金屬激活dnazyme被適配體封閉住，沒有催化活性。而blocker鏈與crrna雜交，將crrna封閉住。當體系中存在目標物 s.?typhimurium時，目標物帶走適配體，從而暴露出金屬激活dnazyme序列。釋放的金屬激活dnazyme在mg2+作用下識別blocker鏈并切割ra位點，從而將封閉住的crrna釋放，與cas12a蛋白、底物鏈s結(jié)合后激活crispr/cas12a系統(tǒng)的反式切割活性，切割熒光鏈fq，釋放熒光，從而實現(xiàn) s.?typhimurium的超靈敏檢測。該策略利用金屬激活dnazyme對ra位點的高催化活性和crispr/cas12a系統(tǒng)對單鏈高效率的切割活性，在沙門氏菌檢測時表現(xiàn)出了操作簡單、高靈敏和檢測限低等優(yōu)點。因此，該傳感器的可以為致病菌檢測提供一個新型的生物傳感平臺。

35、本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

36、本發(fā)明提供的傳感器利用了沙門氏菌及其適配體之間特異性結(jié)合的特性進行檢測；釋放金屬激活dnazyme解封閉crrna，從而實現(xiàn)沙門氏菌的超靈敏檢測，該生物傳感器對沙門氏菌的檢測限為5.82?cfu/ml，檢測范圍為3個數(shù)量級，優(yōu)于現(xiàn)有的大多數(shù)方法。此外，與現(xiàn)有方法相比，該方法操作簡單，無需復雜的設計和預處理，基于crispr/cas12a的反式切割活性，大大提高了擴增效率。該方法對沙門氏菌具有較高的選擇性，并且可以用于實際樣品的檢測，該策略具有高效、靈敏、選擇性強等優(yōu)點，可以為環(huán)境檢測和食品安全的研究提供一種新思路。