本發(fā)明涉及免疫治療領(lǐng)域，具體涉及自分泌多特異性納米抗體的抗原呈遞細(xì)胞及其用途。

背景技術(shù)：

1、腫瘤免疫治療作為一種新型腫瘤治療模式，主要通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗腫瘤免疫，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的，不但能引發(fā)持久的抗腫瘤免疫，而且對預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)具有重要作用。樹突狀細(xì)胞(dendritic?cells，dc)作為機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的首要環(huán)節(jié)，是腫瘤免疫治療的重要靶點(diǎn)。dc疫苗采用自體或異體腫瘤細(xì)胞成份致敏患者外周血來源的單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化的dc，從而直接誘導(dǎo)特異性的免疫反應(yīng)。

2、dc疫苗是將體外培養(yǎng)的負(fù)載腫瘤抗原的dc導(dǎo)入體內(nèi)，這些dc通過抗原提呈功能及分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)腫瘤抗原特異性th1細(xì)胞增殖活化，并進(jìn)一步促進(jìn)nk細(xì)胞及ctl活化，介導(dǎo)腫瘤殺傷。體外誘導(dǎo)或構(gòu)建的可特異性識別腫瘤的dc細(xì)胞，回輸入腫瘤患者體內(nèi)，可以激活t細(xì)胞對腫瘤的免疫反應(yīng)，表達(dá)高水平的pd-1、ctla-4。

3、靶向樹突狀細(xì)胞的治療性腫瘤疫苗通常包括三個(gè)組成部分。1)腫瘤相關(guān)抗原：抗原可以是小分子肽，重組蛋白。經(jīng)歷改造修飾的腫瘤細(xì)胞，病毒載體/或改造過的細(xì)菌載體來表達(dá)的腫瘤抗原，和dna或者rna。這些不同方式表達(dá)或制備的抗原可能在體內(nèi)被樹突狀細(xì)胞吸收和處理，并以mhc2表達(dá)到細(xì)胞表面，可以被t細(xì)胞cd8識別?？乖部梢灾苯颖磉_(dá)在樹突狀細(xì)胞上。2)是樹突狀細(xì)胞(體內(nèi)的，分離提純的，或是分離在外周血白細(xì)胞中的)。3)佐劑或免疫刺激劑。

4、盡管臨床研究表明，通過患者自體單核細(xì)胞誘導(dǎo)的dc疫苗能被患者較好的耐受，并能產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答，但仍無法有效治療腫瘤，原因可能與特異性腫瘤抗原缺乏、抗原負(fù)載效率低以及治療后續(xù)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞被激活，產(chǎn)生免疫抑制有關(guān)。腫瘤免疫微環(huán)境和腫瘤免疫抑制機(jī)制是限制dc疫苗使用的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明第一方面提供工程化的抗原呈遞細(xì)胞，所述抗原呈遞細(xì)胞：

2、(1)含有多特異性納米抗體的編碼序列；和/或

3、(2)能夠表達(dá)和/或分泌多特異性納米抗體，

4、所述多特異性納米抗體含有分別靶向多個(gè)靶點(diǎn)的多個(gè)功能區(qū)，所述多個(gè)功能區(qū)分別是重鏈抗體或其抗原結(jié)合片段。

5、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原呈遞細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物外周血。

6、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原呈遞細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物pbmc。

7、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原呈遞細(xì)胞包括選自巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的一種或多種。

8、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原呈遞細(xì)胞是成熟或未成熟的樹突狀細(xì)胞。

9、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述多個(gè)靶點(diǎn)選自：免疫檢查點(diǎn)蛋白、免疫細(xì)胞相關(guān)抗原、腫瘤相關(guān)抗原、免疫共刺激分子或具受體，例如選自：pd-1、ctla4、pdl1、pdl2、pdl3、tim3、lag3、cd47、btla、tigit、cd160、lair1、b7-h1、b7-1、vsir、cd244，cd28、cd137、cd134、cd40、cd40l、icos、hvem、cd2、cd27、cd30、gitr、light、dr3、slam、cd226、cd80、cd86，eiiib纖連蛋白、siglecl5、vegf(r)、her2、psma、axl、muc1、muc16。

10、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性納米抗體含有分別靶向2個(gè)靶點(diǎn)的2個(gè)功能區(qū)(即為雙特異性抗體)，或者分別靶向3個(gè)靶點(diǎn)的3個(gè)功能區(qū)(即為三特異性抗體)。

11、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述多個(gè)靶點(diǎn)選自免疫檢查點(diǎn)蛋白，例如pd-1、ctla4、pdl1、pdl2、pdl3、tim3、lag3、cd47、btla、tigit、cd160、lair1、b7-h1、b7-1、vsir、cd244。

12、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性納米抗體為抗pd1/ctla4雙特異性納米抗體，其含有抗pd-1納米抗體和抗ctla-4納米抗體。

13、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗pd-1納米抗體的互補(bǔ)決定區(qū)包含p-cdr1、p-cdr2和p-cdr3，其中p-cdr1包括與seq?id?no：1或4所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列、p-cdr2包括與seq?id?no：2或5所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列、和p-cdr3包括與seq?id?no：3或6所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，并且，所述抗ctla-4重鏈抗體的互補(bǔ)決定區(qū)包含c-cdr1、c-cdr2和c-cdr3，其中c-cdr1包括與seq?id?no：7所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列、c-cdr2包括與seq?id?no：8所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列、和c-cdr3包括與seq?id?no：9所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，抗pd-1納米抗體具有seq?id?no：10、11、38或39所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，并且其中各cdr序列與seq?id?no：10、11、38或39保持相同的序列。

14、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，抗ctla-4重鏈抗體具有seq?id?no：12所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，并且其中各cdr序列與seq?id?no：12保持相同的序列。

15、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述多個(gè)功能區(qū)獨(dú)立地為1個(gè)、2個(gè)或者2個(gè)以上。

16、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述多個(gè)功能區(qū)通過接頭融合。優(yōu)選地，所述接頭為(ggsgg)p或(g4s)mgn，m、n和p各自獨(dú)立為1-10的正整數(shù)。優(yōu)選地，m、n和p各自獨(dú)立為1-6或1-4的正整數(shù)。

17、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭具有seq?id?no：13-17所示的序列。

18、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，抗pd-1納米抗體是嵌合抗體，優(yōu)選人源化抗體。

19、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，抗ctla-4重鏈抗體是嵌合抗體，優(yōu)選人源化抗體。

20、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性納米抗體還含有：fc區(qū)；優(yōu)選地，fc區(qū)為igg1、igg2、igg3或igg4的fc區(qū)。

21、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述fc區(qū)還包括突變，并且突變后，雙特異性抗體與fcγriiia和/或c1q的親和力常數(shù)相比突變前降低。

22、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述fc區(qū)為igg1的fc區(qū)，且按照eu編號系統(tǒng)，所述fc區(qū)具有選自如下一種或多種突變：l234a、l235a、g237a；或fc區(qū)為igg4的fc區(qū)，且按照eu編號系統(tǒng)，所述fc區(qū)具有選自如下一種或多種突變：s228p、e233p、f234v、l235a、d254a、l309v、r409k。

23、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原呈遞細(xì)胞：負(fù)載有腫瘤抗原；包含腫瘤抗原的編碼序列；和/或表達(dá)腫瘤抗原。

24、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述腫瘤抗原選自腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤新抗原；優(yōu)選地，所述抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)所述腫瘤抗原；更優(yōu)選地，所述腫瘤抗原選自以下的一個(gè)或多個(gè)：htert、p53、her2、survivin、cea、mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-c1、mage-c2、muc1、wilms?tumor?1(wt1)、her2-neu、p53、ny-eso-1、htert、mammaglobin-a、folate?receptorα(fr-α)、hpv16/18-e6、hpv16/18-e7、alpha?fetoprotein(afp)、glypican3(gpc3)、prostate-specific?antigen(psa)、prostatic?acid?phosphatase(pap)、prostate-specific?membrane?antigen(psma)、prostate?stem?cell?antigen(psca)、six-transmembrane?epithelial?antigen?of?prostate?1(steap1)、b-cell?maturationantigen(bcma)、cmv?pp65、gp100、prame；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述腫瘤抗原包括cea、survivin和p53中的任意兩種或三種。

25、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述腫瘤抗原的編碼序列為rna，優(yōu)選為mrna。

26、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性納米抗體的編碼序列為dna或rna，優(yōu)選為mrna或sarna(自復(fù)制rna)。

27、本發(fā)明第二方面提供一種產(chǎn)生工程化的抗原呈遞細(xì)胞的方法，包括：

28、(1)使抗原呈遞細(xì)胞負(fù)載腫瘤抗原或引入腫瘤抗原的編碼序列；以及向抗原呈遞細(xì)胞引入權(quán)利要求1所記載的多特異性納米抗體的編碼序列。

29、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原呈遞細(xì)胞包括選自巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的一種或多種。

30、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，使抗原呈遞細(xì)胞負(fù)載腫瘤抗原或引入腫瘤抗原的編碼序列包括：使抗原呈遞細(xì)胞與腫瘤抗原肽接觸，或者與編碼腫瘤抗原的rna接觸。

31、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，引入多特異性納米抗體的編碼序列包括：使抗原呈遞細(xì)胞與編碼多特異性納米抗體的rna接觸；或與含有編碼多特異性納米抗體的多核苷酸的質(zhì)粒載體接觸。

32、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒為微載體，其骨架序列長度在600bp以內(nèi)，減少和/或不含cpg?dna基序，和/或所述質(zhì)粒為無抗微質(zhì)粒。

33、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，樹突狀細(xì)胞衍生自單核細(xì)胞。

34、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(1)之前或之后，使所述抗原呈遞細(xì)胞接觸成熟組合物(例如成熟雞尾酒(maturation?cocktails))。所述成熟組合物包含選自ifn-γ、polyi：c、r848、pge2的一個(gè)或多個(gè)。

35、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述腫瘤包括呼吸系統(tǒng)腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤、泌尿系統(tǒng)腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、生殖系統(tǒng)腫瘤、皮膚腫瘤；優(yōu)選包括選自以下的一種或多種：肝癌、胃腸癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、子宮肉瘤、外陰癌、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、前列腺癌、輸卵管癌、喉癌、甲狀腺癌、膽囊癌、腎癌、膀胱癌和腦癌。

36、本發(fā)明第三方面還提供一種離體激活來自患有腫瘤的患者的免疫活性細(xì)胞的方法，其包括：

37、由所述患者獲得免疫活性細(xì)胞；

38、通過本發(fā)明第二方面所述方法產(chǎn)生工程化的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述腫瘤抗原是所述患者的腫瘤的至少一種腫瘤抗原；和

39、將所述多種免疫活性細(xì)胞與所述工程化的抗原呈遞細(xì)胞共培養(yǎng)足以激活所述免疫活性細(xì)胞的時(shí)間，得到激活的免疫活性細(xì)胞。

40、本發(fā)明第四方面還提供一種激活的免疫活性細(xì)胞，通過本發(fā)明第三方面的方法得到。

41、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫活性細(xì)胞是t細(xì)胞。

42、本發(fā)明第五方面還提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明第一方面所述的工程化的抗原呈遞細(xì)胞或由本發(fā)明第二方面所述方法產(chǎn)生的工程化的抗原呈遞細(xì)胞，和/或本發(fā)明第四方面的激活的免疫活性細(xì)胞；以及藥學(xué)上可接受的輔料。

43、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原呈遞細(xì)胞包括選自巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的一種或多種。

44、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防對象中表達(dá)所述腫瘤抗原的腫瘤。

45、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物是疫苗組合物。

46、本發(fā)明還提供本發(fā)明第一方面所述的工程化的抗原呈遞細(xì)胞、由本發(fā)明第二方面所述方法產(chǎn)生的工程化的抗原呈遞細(xì)胞、或本發(fā)明第四方面的激活的免疫活性細(xì)胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防對象中腫瘤的發(fā)生或轉(zhuǎn)移，或抑制對象中腫瘤的生長或轉(zhuǎn)移，所述腫瘤表達(dá)所述腫瘤抗原。

47、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原呈遞細(xì)胞包括選自巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的一種或多種。

48、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述對象是哺乳動(dòng)物，例如人、犬、貓、馬、牛或豬。

49、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述對象患有腫瘤或有發(fā)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。

50、本發(fā)明還提供一種預(yù)防或治療對象中腫瘤的發(fā)生、生長或轉(zhuǎn)移的方法，包括給予治療有效量的本發(fā)明第一方面所述的工程化的抗原呈遞細(xì)胞或由本發(fā)明第二方面所述方法產(chǎn)生的工程化的抗原呈遞細(xì)胞、本發(fā)明第四方面的激活的免疫活性細(xì)胞、或本發(fā)明第五方面所述的藥物組合物。

51、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，由所述工程化的抗原呈遞細(xì)胞預(yù)防所述腫瘤的發(fā)生或降低所述腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移，并且所述工程化的抗原呈遞細(xì)胞在給予前用成熟組合物離體培養(yǎng)，所述抗原呈遞細(xì)胞載有所述腫瘤抗原。

52、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原呈遞細(xì)胞包括選自巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的一種或多種。

53、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述成熟組合物包含選自ifn-γ、polyi：c、r848、pge2的一個(gè)或多個(gè)。

54、樹突狀細(xì)胞(dc)注射后，會遷移到淋巴結(jié)，在那里它們遇到幼稚t細(xì)胞并將其激活。激活機(jī)制為：1.dc表面的mhc與t細(xì)胞的tcr相互作用；2.dc的b7分子與t細(xì)胞的cd28之間的相互作用。本發(fā)明一些實(shí)施方案的分泌抗pd-1/ctla-4雙特異性納米抗體或含有其編碼序列的dc具有以下優(yōu)點(diǎn)：

55、激活幼稚t細(xì)胞活化，具體機(jī)理為：在淋巴結(jié)中，tregs表達(dá)高水平的ctla-4，與dc的b7分子相互作用，會降低dc刺激腫瘤特異性t細(xì)胞的能力。本發(fā)明的dc可以分泌pd-1/ctla-4雙特異性抗體，阻斷treg的ctla-4，解除tregs降低dc刺激腫瘤特異性t細(xì)胞的能力，因此本發(fā)明的dc可以有效地激活幼稚t細(xì)胞。

56、t細(xì)胞激活后會表達(dá)高水平的pd-1和ctla-4，在腫瘤部位，會因?yàn)橐韵氯N因素抑制腫瘤特異性t細(xì)胞的功能，阻止它們殺死癌細(xì)胞：a.腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞表達(dá)pd-l1，b.treg高水平表達(dá)ctla-4，c.腫瘤細(xì)胞表達(dá)與t細(xì)胞ctla-4結(jié)合的b7分子。而本發(fā)明的dc可以分泌pd-1/ctla-4雙特異性抗體，因此可以阻斷t細(xì)胞表達(dá)的pd-1和ctla-4，即在t細(xì)胞遷移至腫瘤部位前就已對t細(xì)胞表達(dá)的ctla-4和pd-1進(jìn)行抑制，從而可以有效刺激激活的t細(xì)胞對癌癥的效應(yīng)功能。

57、而且，與分別分泌pd-1納米抗體和ctla-4納米抗體相比，分泌pd-1/ctla-4雙特異性納米抗體可以提高抗體分泌量，尤其是遠(yuǎn)大于單獨(dú)ctla-4納米抗體的分泌量，從而更好地阻斷treg的ctla-4。

58、本發(fā)明一些實(shí)施方案還提出了引入外源性rna的方法制作dc疫苗，外源性rna能夠引發(fā)機(jī)體的固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)。在腫瘤治療中利用這一機(jī)理，以疫苗的形式引入外源性rna，可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子及干擾素的釋放，激活nk、巨噬細(xì)胞、效應(yīng)t細(xì)胞，將沒有免疫細(xì)胞浸潤的″冷腫瘤”變?yōu)椤盁崮[瘤”，促進(jìn)免疫系統(tǒng)對癌細(xì)胞的殺傷作用，也能協(xié)同提高免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗體的療效，即在給免疫系統(tǒng)“松剎車”的同時(shí)“踩油門”，從而進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。相比傳統(tǒng)疫苗，mrna的安全性更有優(yōu)勢，不會插入基因突變，可以被正常細(xì)胞降解，通過調(diào)節(jié)序列修飾和遞送載體可以改變其半衰期等。許多證據(jù)表明，mrna不僅能介導(dǎo)更優(yōu)的轉(zhuǎn)染效率和更長的蛋白表達(dá)時(shí)間，而且比于dna具有更大優(yōu)勢，這些優(yōu)勢包括：(1)mrna無需進(jìn)入細(xì)胞核即可發(fā)揮功能。到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中，mrna即啟動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯。相反，dna需要先入核，然后轉(zhuǎn)錄成mrna。這個(gè)過程使dna的效率低于mrna，因?yàn)槠涔δ苋Q于細(xì)胞分裂過程中核被膜的破壞。(2)與dna和病毒載體相比，mrna不會插入基因組，而只是瞬時(shí)表達(dá)編碼蛋白，因此，由于其低插入風(fēng)險(xiǎn)，它為研究人員和制藥公司提供了絕佳的安全選擇。(3)mrna很容易通過體外轉(zhuǎn)錄(ivt)過程合成。這個(gè)過程相對廉價(jià)，并且可以快速應(yīng)用于各種療法。而且，mrna在理論上能夠表達(dá)任何蛋白質(zhì)，因此可以使用治療幾乎所有疾病。這解決了之前dc疫苗費(fèi)用昂貴，制備過程繁瑣的問題。