本發(fā)明屬于基因編輯，涉及一種采用核酸外切酶t5exo與核酸內(nèi)切酶hfcas12max融合策略的crispr/cas12i基因編輯衍生系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、crispr/cas是一種原核生物中rna介導(dǎo)的可以識別并分解異源的遺傳物質(zhì)的獲得性免疫防御系統(tǒng)，在古菌和細菌中廣泛存在。crispr是成簇的有規(guī)律間隔的回文重復(fù)序列，cas是crispr核酸酶蛋白。crispr/cas免疫防御系統(tǒng)被分為3種類型，即typeⅰ型、typeⅱ型和typeⅲ型。在這三個類型當中，ⅱ型crispr系統(tǒng)crispr/cas9是目前為止研究及應(yīng)用最為廣泛的系統(tǒng)。在crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)中，向?qū)na(guide?rna,grna)替代了之前技術(shù)中的crrna以及tracrrna的作用，其可以在grna的作用下識別靶序列的原型間隔區(qū)相鄰基序，也就是pam位點，然后引導(dǎo)核酸酶cas9切割靶位點，并利用非同源末端連接或者同源重組的修復(fù)方式，實現(xiàn)對基因的敲除和修飾等編輯結(jié)果。

2、隨著基于crispr/cas的第三代基因編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用，為提高其編輯效率，一些改進的系統(tǒng)也被提出，例如中國專利cn116615226a、cn116769754a中引入了可以切割和改變核苷酸鏈結(jié)構(gòu)的核酸外切酶與crispr核酸酶蛋白進行融合。其中cn116769754a利用linker將t5核酸外切酶(按照5’至3’方向降解單鏈或雙鏈dna)與已有的cas12i3融合，并引入了核定位信號(即nls)序列以構(gòu)建表達載體，但經(jīng)其改造后的cas12i3蛋白在所有編輯位點的編輯效率均未達到30％，并且編輯效率僅限于細胞水平的統(tǒng)計結(jié)果，沒有關(guān)于動物胚胎及相應(yīng)出生后個體的編輯效率的考察。因此，通過融合t5核酸外切酶開發(fā)能夠在基因功能研究、基因治療，尤其是動植物生物育種領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用的crispr/cas12i基因編輯衍生系統(tǒng)受到其基因編輯效率的制約。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的問題與不足，本發(fā)明提供了一種融合核酸外切酶的crispr/cas12i基因編輯衍生系統(tǒng)及其應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

3、一種核酸內(nèi)切酶衍生蛋白基因，包括經(jīng)連接序列串聯(lián)的用于編碼核酸外切酶的基因序列與用于編碼cas12i的基因序列，所述cas12i為cas蛋白hfcas12max(用于編碼hfcas12max的基因序列如seq.id.no.1所示)。

4、一種crispr/cas12i編輯工具，該編輯工具包括用于融合表達核酸外切酶與cas12i的基因元件，所述cas12i為上述hfcas12max。

5、優(yōu)選的，所述編輯工具還包括crrna表達元件。

6、優(yōu)選的，所述基因元件具體包括依次排列的ii型啟動子(如cbh啟動子等)、上游核定位信號序列、上述cas12i的基因序列(即上述seq.id.no.1)、上述連接序列、上述核酸外切酶的基因序列、下游核定位信號序列和polya終止序列，crrna表達元件具體包括依次排列的iii型啟動子(如u6啟動子等)和crrna導(dǎo)向及骨架序列。

7、優(yōu)選的，所述crrna導(dǎo)向及骨架序列包括可特異性靶向目標基因組區(qū)域中特定靶序列(如擬編輯目標基因上的靶位點等任意一編輯位點)的向?qū)na(grna)。

8、優(yōu)選的，所述編輯工具還包括熒光報告基因表達元件和/或抗性基因表達元件。

9、優(yōu)選的，所述基因元件和crrna表達元件構(gòu)建在一個共表達載體骨架上，或者所述基因元件和crrna表達元件分別構(gòu)建在兩個表達載體骨架上。

10、優(yōu)選的，所述編輯工具還包括供體載體，供體載體包括用于在編輯位點插入的外源性核酸片段或內(nèi)源性核酸片段。

11、優(yōu)選的，所述熒光報告基因表達元件、抗性基因表達元件可以集成在供體載體上，也可以集成在含有所述基因元件和/或crrna表達元件的載體上。

12、優(yōu)選的，所述連接序列(具體為xten序列)如seq.id.no.2所示。

13、優(yōu)選的，所述核酸外切酶(具體為t5核酸外切酶)的基因序列如seq.id.no.3所示。

14、優(yōu)選的，所述上游核定位信號(具體為sv40?nls)序列、下游核定位信號(具體為nucleoplasmin?nls)序列分別如seq.id.no.4、seq.id.no.5所示。

15、一種基因編輯方法，包括以下步驟：

16、s1載體構(gòu)建

17、針對目標基因組區(qū)域中特定靶序列，設(shè)計相應(yīng)的grna；構(gòu)建含有上述crrna表達元件的載體以及含有用于融合表達核酸外切酶(如t5核酸外切酶)與cas12i的基因元件的載體，或者構(gòu)建集成上述crrna表達元件與所述基因元件的載體；所述cas12i為上述hfcas12max；

18、s2載體導(dǎo)入

19、將構(gòu)建的載體通過陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑或電穿孔的方式轉(zhuǎn)染進目標細胞。

20、優(yōu)選的，所述基因編輯方法還包括以下步驟：

21、s3檢測

22、通過流式分選或藥物篩選獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)染陽性細胞。

23、優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)染的目標細胞為hek293t細胞、hela細胞、u2os細胞、綿羊胎兒成纖維細胞、綿羊肌肉細胞。

24、另一種基因編輯方法，包括以下步驟：

25、s1針對目標基因組區(qū)域中特定靶序列，設(shè)計相應(yīng)的grna，然后通過直接合成或體外轉(zhuǎn)錄制備相應(yīng)的crrna樣品(如上述crrna表達元件中的crrna導(dǎo)向及骨架序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)；

26、s2將crrna樣品與核酸外切酶-cas12i融合蛋白的體外表達產(chǎn)物(如表達的相應(yīng)mrna)，通過顯微注射導(dǎo)入目標細胞，所述核酸外切酶-cas12i融合蛋白是通過預(yù)先將經(jīng)上述連接序列串聯(lián)的用于編碼核酸外切酶(如t5核酸外切酶)的基因序列與用于編碼cas12i的基因序列進行融合表達所得，所述cas12i為上述hfcas12max。

27、優(yōu)選的，所述基因編輯方法還包括以下步驟：

28、s3篩選顯微注射后存活的細胞，即可獲得相應(yīng)的基因編輯細胞。

29、優(yōu)選的，所述顯微注射的目標細胞為動物(如綿羊)的體外受精胚胎或核移植胚胎。

30、一種提高特異性核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因編輯效率的方法，包括以下步驟：

31、在特異性核酸內(nèi)切酶的n端通過串聯(lián)表達的上述連接序列融合核酸外切酶(如通過xten連接t5核酸外切酶)，或者在特異性核酸內(nèi)切酶的c端通過串聯(lián)表達的上述連接序列融合核酸外切酶(如通過xten連接t5核酸外切酶)，所述特異性核酸內(nèi)切酶為上述hfcas12max。

32、上述提高特異性核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因編輯效率的方法在羊生物育種中的應(yīng)用。

33、本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

34、本發(fā)明通過篩選與核酸外切酶(如t5核酸外切酶)融合的cas酶(具體為hfcas12max)，提出了融合核酸外切酶的crispr/cas12i基因編輯衍生系統(tǒng)(如crispr/cas12i-t5exo基因編輯系統(tǒng))，提高了cas酶介導(dǎo)的基因編輯的效率，在動物遺傳育種等方面具有較好的應(yīng)用價值和前景。